JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل إجراءات إنتاج الإنزيم الهولوجيني البشري myosin-7a بشكل مؤتلف باستخدام نظام MultiBac Baculovirus ولدراسة حركته باستخدام مقايسة انزلاقية مخصصة في المختبر.

Abstract

Myosin-7a هو بروتين حركي قائم على الأكتين حيوي للعمليات السمعية والبصرية. تؤدي الطفرات في الميوسين 7 أ إلى متلازمة آشر من النوع 1 ، وهي الشكل الأكثر شيوعا وشدة من العمى الصم لدى البشر. من المفترض أن الميوسين -7 أ يشكل مركب التصاق عبر الغشاء مع بروتينات آشر الأخرى ، وهو ضروري للسلامة الهيكلية والوظيفية لخلايا الشعر المستقبلة الضوئية والقوقعة. ومع ذلك ، نظرا للتحديات في الحصول على بروتين نقي وسليم ، تظل الآليات الوظيفية الدقيقة للميوسين البشري 7a بعيدة المنال ، مع توفر دراسات هيكلية وميكانيكية حيوية محدودة. أظهرت الدراسات الحديثة أن الميوسين 7a للثدييات عبارة عن مجمع حركي متعدد الأشكال يتكون من سلسلة ثقيلة وثلاثة أنواع من السلاسل الخفيفة: السلسلة الخفيفة التنظيمية (RLC) ، والكالمودولين ، والبروتين الشبيه بالكالمودولين 4 (CALML4). على عكس الكالمودولين ، لا يرتبط CALML4 بأيونات الكالسيوم. تعتبر كل من الكالموديلين الحساسة للكالسيوم وغير الحساسة ضرورية للميوسين 7a للثدييات من أجل الضبط الدقيق لخصائصه الميكانيكية. هنا ، نصف طريقة مفصلة لإنتاج إنزيم الميوسين البشري المؤتلف -7a باستخدام نظام التعبير عن بروتين MultiBac Baculovirus. وهذا ينتج كميات مليغرام من البروتين كامل الطول عالية النقاء, مما يسمح لتوصيفها الكيميائي الحيوي والفيزيائي الحيوي. نقدم أيضا بروتوكولا لتقييم خصائصه الميكانيكية والحركية باستخدام فحوصات الحركة في المختبر المصممة والفحص المجهري الفلوري. إن توافر بروتين الميوسين -7a البشري السليم ، جنبا إلى جنب مع بروتوكول التوصيف الوظيفي المفصل الموصوف هنا ، يمهد الطريق لمزيد من التحقيقات في الجوانب الجزيئية للميوسين -7 أ في الرؤية والسمع.

Introduction

الميوسين هي بروتينات حركية جزيئية تتفاعل مع الأكتين لدفع العديد من العمليات الخلوية1،2،3،4. يمتلك البشر 12 فئة و 39 جينا من جينات الميوسين5 ، والتي تشارك في مجموعة واسعة من الوظائف الفسيولوجية ، مثل تقلص العضلات6 والعمليات الحسية7. كل جزيء ميوسين عبارة عن مركب متعدد الأشكال يتكون من سلسلة ثقيلة وسلاسل خفيفة. تنقسم السلسلة الثقيلة إلى مناطق الرأس والرقبة والذيل. يحتوي الرأس على مواقع ربط الأكتين والنيوكليوتيدات المسؤولة عن التحلل المائي ل ATP وتوليد القوة على خيوط الأكتين2. تتكون العنق من عدة زخارف ذكاء حلزونية α حيث يتم ربط مجموعة محددة من السلاسل الخفيفة. تعمل معا كذراع رافعة لتضخيم التغييرات التوافقية للمحرك إلى حركات كبيرة8،9،10. يحتوي الذيل على مجالات فرعية خاصة بالفئة ويلعب دورا تنظيميا في ضبط النشاط الحركي للميوسين والتوسط في التفاعلات مع شركاء الارتباط الخلوي2،11.

الميوسين البشري 7 أ ، وهو عضو في الميوسين من الفئة 7 ، ضروري للعمليات السمعية والبصرية12،13. ترتبط أشكال الذكاء للميوسين البشري -7a بمزيج فريد من السلاسل الخفيفة ، بما في ذلك السلسلة الخفيفة التنظيمية (RLC) ، والكالمودولين ، والبروتين الشبيه بالكالمودولين 4 (CALML4) 14،15،16. إلى جانب تثبيت ذراع الرافعة ، تنظم هذه السلاسل الخفيفة الخواص الميكانيكية للميوسين -7 أ استجابة لإشارات الكالسيوم ، وهي ميزة يبدو أنها فريدة من نوعها للثدييات الإسوية14.

العيوب في الجين الذي يشفر سلسلة الميوسين -7a الثقيلة (MYO7A / USH1B) هي المسؤولة عن متلازمة آشر من النوع 1 ، وهي أشد أشكال فقدان البصر والسمع المشترك لدىالبشر 17. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جين السلسلة الخفيفة CALML4 ، هو من بين الجينات المرشحة التي تم تعيينها لاحتواء الأليل المسبب ل USH1H ، وهو متغير آخر من النوع 1 متلازمة آشر15،18. في شبكية العين ، يتم التعبير عن الميوسين -7 أ في ظهارة صبغة الشبكية والخلايا المستقبلة للضوء13. لقد تورط في توطين الميلانوزومات في ظهارة صبغة الشبكية (RPE)19 والبلعمة لأقراص الجزء الخارجي المستقبلة للضوء بواسطة خلايا RPE20. في الأذن الداخلية ، يوجد الميوسين 7a بشكل أساسي في الأهداب المجسمة ، حيث يلعب دورا مهما في إنشاء حزم الشعر وفي بوابات عملية النقل الميكانيكي الكهربائي12،21،22.

في حين أن أهمية الميوسين 7 أ في الخلايا الحسية راسخة ، إلا أن آلياته الوظيفية على المستوى الجزيئي لا تزال غير مفهومة جيدا. ترجع هذه الفجوة في المعرفة جزئيا إلى التحديات في تنقية البروتين السليم ، وخاصة الشكل الإسوي للثدييات. في الآونة الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير باستخدام نظام MultiBac للتعبير بشكل مؤتلف عن الإنزيم البشري الكامل myosin-7aholoenzyme 14. وقد مكن هذا التقدم من التوصيفات الهيكلية والفيزيائية الحيوية لهذا البروتين الحركي ، مما أدى إلى اكتشاف العديد من الخصائص الفريدة للميوسين البشري -7 أ التي تم تكييفها خصيصا للوظائف السمعية للثدييات14،23.

نظام MultiBac عبارة عن منصة متقدمة لفيروس العصعصبة / خلايا الحشرات مصممة خصيصا للتعبير عن المجمعات متعددة النواةحقيقية النواة 24،25. تتمثل الميزة الرئيسية لهذا النظام في قدرته على استضافة أشرطة متعددة للتعبير الجيني ، كل منها يشفر وحدة فرعية من المركب ، داخل فيروس باكولوفير متعدد البكالوري. يتم تسهيل تجميع أشرطة التعبير متعددة الجينات من خلال ما يسمى بوحدة الضرب: موقع نوكلياز داخلي موجه (HE) وموقع BstXI مصمم مطابق يحيط بمواقع الاستنساخ المتعددة (MCS). تتيح هذه الوحدة التجميع التكراري لشريط تعبير واحد عن طريق التقييد / الربط ، والاستفادة من حقيقة أنه يتم التخلص من مواقع تقييد HE و BstXI عند ربطها. في هذه الورقة ، يتم استنساخ كل من السلسلة الثقيلة من الميوسين البشري -7a و RLC و calmodulin و CALML4 في وحدة الضرب داخل متجه pACEBac1 (الشكل 1 أ) ، والتي يتم تجميعها بعد ذلك في كاسيت تعبير متعدد الجينات من خلال العملية التكرارية (الشكل 1 ب). تم دمج كاسيت myosin-7a متعدد الجينات في الجينوم الفيروسي العصبي (bacmid) من خلال تبديل عنصر mini-Tn7 من ناقل pACEBac1 إلى الموقع المستهدف mini-attTn7 في الجينوم (الشكل 1 ج). باتباع إجراءات تنقية باكميد ، وإنتاج الفيروس العصبي ، وتضخيمه (الشكل 1D ، E) ، يتم تحضير فيروس الباكوجين المؤتلف myosin-7a MultiBac ويمكن استخدامه لإنتاج البروتين على نطاق واسع (الشكل 1F). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إنتاج سلاسل الميوسين -7a الخفيفة بشكل منفصل في الإشريكية القولونية وتنقيتها باستخدام علامة His6-SUMO القابلة للانشقاق26،27،28. تعتبر سلاسل الضوء المنقاة مفيدة لدراسة ديناميكيات الربط وتنظيم الميوسين 7 أ.

يمكن إخضاع بروتين الميوسين 7a المنقى لدراسات هيكلية وكيميائية حيوية وفيزيائية حيوية لاكتساب نظرة ثاقبة حول التنظيم الهيكلي والوظيفي لهذا البروتين الحركي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن فحص تفاعلاته مع شبكة الأكتين والبروتينات الملزمةالأخرى 29 باستخدام مجموعة متنوعة من أساليب إعادة التكوين في المختبر. ستعلم نتائج هذه التحليلات الخصائص الفيزيائية الحيوية لهذا الميوسين ، مما يؤدي إلى فهم ميكانيكي لكيفية دفع الميوسين 7 أ لتغيرات الهيكل الخلوي وتشكيل التشكل الفريد ووظيفة الخلايا الحسية في النهاية. في هذه الورقة ، نقوم بتفصيل سير عمل لمقايسة انزلاق خيوط الأكتين التي تم تكييفها خصيصا للميوسين الثديي 7a. مقايسة انزلاق خيوط الأكتين هي اختبار قوي للحركة في المختبر يدرس كميا حركة خيوط الأكتين الفلورية التي يدفعها عدد كبير من محركات الميوسين المثبتة على سطح غطاء30،31،32. تشمل مزايا هذا الاختبار بساطة الإعداد ، والحد الأدنى من متطلبات المعدات (مجهر مضان واسع المجال مزود بكاميرا رقمية) ، وقابلية التكرار العالية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن حركة خيوط الأكتين مدفوعة بمجموعة من محركات الميوسين المجمدة ، فإن هذا الاختبار مفيد بشكل خاص لدراسة حركة الميوسين الأحادي مثل الميوسين 7 أ14،33. تتضمن البروتوكولات العديد من التعديلات ، من الإجراءات التجريبية إلى تحليل التصوير ، المصممة خصيصا للخصائص الحركية الفريدة للميوسين الثديي 7a. مع توفر بروتين الميوسين -7a السليم وبروتوكول التوصيف الوظيفي الموضح هنا ، تضع هذه الورقة الأساس لمزيد من التحقيق في الأدوار الجزيئية للميوسين -7 أ في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية.

Protocol

ملاحظة: نصف هنا بروتوكولا لتصنيع الإنزيم الميولوجيني البشري السليم الميوسين-7a وتوصيف حركته في المختبر. ينقسم هذا البروتوكول إلى ثلاثة أقسام: أولا ، التعبير عن الميوسين البشري -7a باستخدام نظام التعبير عن بروتين الفيروس العصبي MultiAcc. ثانيا ، تنقية سلاسل ضوء الميوسين 7a بشكل منفصل باستخدام نظام E.coli His6-SUMO ؛ وأخيرا ، دراسة حركة الميوسين البشري 7a باستخدام مقايسة انزلاق خيوط الأكتين.

1. إنتاج معقد myosin-7a القائم على نظام MultiBac

  1. إنشاء كاسيت متعدد الجينات لفيروس باكوفور للتعبير عن مركب الميوسين 7a البشري (16 يوما)
    ملاحظة: يتطلب الأمر دورة استنساخ واحدة (4 أيام) لإدخال الحمض النووي (cDNAs) للوحدات الفرعية للميوسين -7a في متجهات pACEBac1 وثلاث دورات استنساخ لإكمال الربط التدريجي لجميع وحدات الضرب المطلوبة للتعبير عن مركب الميوسين -7 أ ، مما ينتج عنه ما مجموعه 16 يوما.
    1. استنساخ cDNAs التي تشفر سلسلة الميوسين -7a الثقيلة (HC) و calmodulin و CALML4 و RLC في نواقل pACEBac1 باستخدام مجموعة تجارية تتبع بروتوكولات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد ؛ الشكل 1 أ). يتم إدراج علامة FLAG في الطرف C من myosin-7a HC للمساعدة في التنقية.
      ملاحظة: يتم إنتاج الميوسين في الثدييات -7a كشكلين إسويين للتضفير ، يختلفان فقط بجزء من 11 من الأحماض الأمينية في الطرفN 23. يلعب هذا الامتداد القصير للطرف N دورا مهما في تنظيم نشاط ATPase للميوسين 7a14. لقد ثبت أن إضافة علامة N-terminal يمكن أن تعطل التنظيم العادي من خلال هذا الامتداد الطرفي N ويقلل بشكل كبير من النشاط الأنزيمي للمحرك وحركته14. لذلك ، يتم استخدام علامة C-terminal FLAG لتجنب تعطيل التنظيم الطبيعي للبروتين.
    2. قم ببناء كاسيت التعبير متعدد الجينات للإنزيم المجسم myosin-7a باستخدام مضاعفة اندونوكلياز / BstXI كما هو موضح أدناه (الشكل 1 ب).
      ملاحظة: ينتج نوكلياز داخلي I-CeuI موجه نهايات متماسكة متوافقة مع النهايات الناتجة عن ملخص BstXI. عند الربط ، يتم إنشاء موقع تقييد هجين موجه للنوكلياز الداخلي / BstXI لا يمكن قطعه بواسطة أي من الإنزيمين. يمكن تكرار نفس الإجراء لدمج المزيد من وحدات الضرب. إذا كانت مواقع التقييد المتعددة ل I-CeuI و BstXI موجودة على تركيبات الإدخال أو المتجهات ، فيجب التخلص من هذه المواقع الإضافية عن طريق الطفرات الموجهة للموقع للتأكد من أن مواقع القطع I-CeuI و BstXI فريدة من نوعها.
    3. إدراج المستحضر: استيعاب بنية الإدخال (على سبيل المثال ، pACEBac-M7a HC) باستخدام نوكلياز داخلي موجه I-CeuI (انظر جدول المواد) ، ثم قم بتنقية البلازميد الخطي باستخدام مجموعة تنقية PCR (انظر جدول المواد). علاوة على ذلك ، قم بهضم البلازميد الخطي باستخدام BstXI (انظر جدول المواد) ، وافصل الجزء الذي يحتوي على كاسيت التعبير الجيني باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ، وقم بتنقية باستخدام مجموعة استخراج الهلام (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: تتطلب I-CeuI و BstXI ظروف تخزين مؤقت مختلفة ، وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة ، لتحقيق نشاط بنسبة 100٪. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب القطع الكامل باستخدام I-CeuI ما لا يقل عن 3 ساعات ، بينما يتطلب BstXI 15 دقيقة فقط من وقت الحضانة. وبالتالي يجب إجراء عمليات الهضم بالتتابع.
    4. تحضير المتجهلات: خطي بناء المتجه (على سبيل المثال ، pACEBac-CaM) من خلال هضم BstXI. يتم تضمين الفوسفاتيز القلوي في مستحضر الناقل لمنع البلازميد الناقل من الارتباط بنفسه (انظر جدول المواد). احصل على منتج الهضم عن طريق الرحلان الكهربائي وقم بتنقيته باستخدام مجموعة استخراج الجل.
    5. الربط: قم بربط الملحق المعالج ب I-CEUI / BstXI والناقل المعالج ب BstXI باستخدام T4 DNA Ligase (انظر جدول المواد). قم بإجراء تفاعلات الربط في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية -25 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق بنسبة 1: 1 من كتلة الحمض النووي المدخل إلى الحمض النووي المتجه ، مع الحفاظ على الكتلة الكلية قريبة من 100 نانوغرام في كل تفاعل ربط.
    6. التحويل وتحليل البلازميد: قم بتحويل مخاليط الربط إلى خلايا DH5α (انظر جدول المواد) باتباع توصيات الشركة المصنعة وفحص المستعمرات الإيجابية لمقاومة الجنتاميسين. قم بتنقية البلازميدات باستخدام مجموعة تجارية (انظر جدول المواد) ، وتحقق من المستنسخة الصحيحة (على سبيل المثال ، البلازميدات التي تحتوي على كل من M7a HC و CaM) بناء على أنماط هضم تقييد محددة وتسلسل الحمض النووي للإدخالات.
    7. تكامل أشرطة التعبير الجيني المتعددة: كرر الخطوات من 1.1.2 إلى 1.1.6 لدمج أشرطة جينية إضافية تعبر عن وحدات فرعية أخرى من الميوسين -7a.
  2. إنتاج وتنقية الحمض النووي الباكميد المؤتلف (4 أيام ؛ الشكل 1 ج).
    ملاحظة: اليوم 1 - التحول البكتيري ونمو المستعمرات المتحولة. الأيام 2-3 - زراعة المستعمرات وفحص التحول الناجح. يوم 3 - اختيار وخطوط المستعمرات الإيجابية ، بدءا من التلقيح بين عشية وضحاها. يوم 4 - تنقية الحمض النووي باكميد.
    1. قم بتحويل الخلايا المختصة DH10Bac (انظر جدول المواد) باستخدام 1 نانوغرام من البلازميد المتسلسل pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM باتباع توصيات الشركة المصنعة.
    2. صفيحة 20-200 ميكرولتر من الخلايا على صفيحة أجار تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين ، و 7 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، و 10 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين ، و 100 ميكروغرام / مل إندوليل-β-جالاكتوسايد مهلجنة ، و 40 ميكروغرام / مل IPTG (انظر جدول المواد) واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة للسماح بتطوير اللون الأزرق الغامق في المستنسخة السلبية.
      ملاحظة: يصبغ الإندوليل β-جالاكتوسايد المهلجنة المستعمرات التي تستمر في التعبير عن LacZ (مما يشير إلى أن التبديل لم ينجح) ، مما يتيح اختيار المستعمرات البيضاء حيث كان التبديل ناجحا.
    3. اختر بعناية مستعمرة بيضاء معزولة وقم بزراعة الخلايا طوال الليل في 5 مل من وسط LB الذي يحتوي على 50 ميكروغرام / مل من الكاناميسين ، و 7 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين ، و 10 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري عند 225 دورة في الدقيقة.
    4. الطرد المركزي للثقافة عند 2,465 × جم لمدة 10 دقائق لحبيبات الإشريكية القولونية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من Buffer P1 من المجموعة.
      ملاحظة: أثناء استخدام المخازن المؤقتة من مجموعة Miniprep هنا، يختلف بروتوكول تنقية منتج bacmid عن البروتوكول المرفق مع المجموعة.
    5. أضف 300 ميكرولتر من Buffer P2 من المجموعة. امزج عن طريق قلب الأنابيب عدة مرات ، ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
    6. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت N3 من المجموعة واخلطه عن طريق الانعكاس لإيقاف تفاعل التحلل. جهاز طرد مركزي عند 17,885 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. انقل المادة الطافية إلى أنبوب معقم نظيف وكرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق أخرى.
    8. انقل 800 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب آخر معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.7 مل (انظر جدول المواد) وأضف 600 ميكرولتر من الأيزوبروبانول البارد (انظر جدول المواد) ، وخلطها عن طريق الانعكاس الصارم. ثم جهاز الطرد المركزي عند 17,885 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    9. تخلص من المادة الطافية وحدد موقع الحبيبات البيضاء الصغيرة. اغسل الحبيبات ب 800 ميكرولتر من الإيثانول البارد 70٪ (انظر جدول المواد) وأجهزة الطرد المركزي عند 17,885 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف الإيثانول بعناية على طول جدار الأنبوب لتجنب إزعاج الحبيبات.
    10. تخلص من المادة الطافية وكرر غسل الإيثانول مرة واحدة. جفف الحبيبات بالهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. استنشق بعناية أي سائل زائد ، إذا لزم الأمر.
    11. قم بإذابة الحبيبات ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB من المجموعة. تأكد من إذابة الحبيبات تماما عن طريق تحريك الأنبوب أو الخلط برفق عن طريق سحب العينات. حدد التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد).
    12. اضبط حجم المخزن المؤقت حسب الحاجة لجعل تركيز باكميد عند حوالي 1 ميكروغرام / ميكرولتر ، قم بتخزين الحمض النووي الباكميد عند 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا لإنتاج فيروس P0.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ ب bacmid المنقى عند 4 درجات مئوية ويظل فعالا لعدة أشهر. لقد رأينا عمليات نقل ناجحة مع منتجات bacmid حتى عمر 1 سنة. بدلا من ذلك ، يمكن اقتباس البكميد وتخزينه عند -20 درجة مئوية. يجب تجنب دورات التجميد / الذوبان المتعددة لأنها تقلل من كفاءة التعداد.
  3. خلايا حشرية Transfect Sf9 مع bacmid لإنتاج الفيروس العصبي المؤتلف (6 أيام ؛ الشكل 1 د)
    ملاحظة: اليوم 1 - تعداء الخلايا بالحمض النووي البكميدي. الأيام 2-6 - مراقبة نمو الخلايا والتعبير عنها. يوم 6 - جمع فيروس P0.
    1. أضف خلايا Sf9 في وسط الاستزراع (انظر جدول المواد) إلى صفيحة مكونة من 6 آبار بتركيز 0.33 × 106 خلايا / مل مع 3 مل لكل بئر. اترك اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق بأسفل اللوحة.
    2. لكل بئر ، قم بإعداد خليط تعداء عن طريق الجمع بين 10 ميكرولتر من كاشف تعداء الدهون الموجبة (انظر جدول المواد) مع 250 ميكرولتر من وسائط الحد الأدنى من الوسط الأساسي المحسن (MEM) (انظر جدول المواد) في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم. تخلط عن طريق الانعكاس وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. أضف 1 ميكروغرام (بناء على التركيز المحدد في الخطوة 1.2.12) من الميوسين -7 أ باكميد غير المخفف إلى خليط التعداد. تخلط عن طريق الانعكاس وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. قم بتوزيع خليط الحمض النووي والدهون بالكامل بالتساوي في الآبار. اترك بئرا واحدا للخلايا غير المنقولة كعنصر تحكم سلبي.
    5. أغلق الصفيحة المكونة من 6 آبار بغشاء (انظر جدول المواد) واحتضانها عند 27 درجة مئوية لمدة 6 أيام. راقب النمو والانفصال طوال هذا الوقت. إذا كانت هناك علامة فلورية موجودة على الهيكل ، فتحقق من تطور التألق (الشكل 2).
    6. عندما تظهر على الخلايا المنقولة علامات الإصابة في المرحلة المتأخرة ، انقل الوسط الذي يحتوي على الفيروس من الآبار المصابة إلى أنبوب مخروطي 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 805 × جم لمدة 10 دقائق.
    7. انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 15 مل ، ولفه بورق الألمنيوم ، وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. هذا المنتج هو الآن فيروس P0 ويمكن تخزينه واستخدامه بشكل فعال لمدة تصل إلى أربعة أشهر من تجربتنا.
  4. تضخيم مخزون الفيروس العصبي (3-5 أيام ؛ الشكل 1 هاء)
    1. قم بإعداد 100 مل (أو الحجم المطلوب) من خلايا Sf9 بتركيز 2 × 106 خلايا / مل في وسائط زراعة الخلايا Sf9 في قارورة Erlenmeyer سعة 250 مل (انظر جدول المواد).
    2. أضف نسبة 1: 100 (v / v) من مخزون فيروس P0 إلى ثقافة تعليق الخلايا Sf9 واحتضانها عند 27 درجة مئوية في شاكر مداري عند 135 دورة في الدقيقة.
    3. راقب النمو كل 24 ساعة حتى تحقق الخلايا ~ 90٪ موت الخلايا. بمجرد الوصول إلى هذا النطاق ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 10 دقائق واجمع المادة الطافية التي تحتوي على فيروس P1.
    4. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام الترشيح الفراغي 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد). احتفظ بالمنتج المصفى في الظلام وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. هذا المنتج هو الآن فيروس P1.
      ملاحظة: ينخفض عيار الفيروس مع التخزين طويل الأجل عند 4 درجات مئوية. ضع في اعتبارك صنع مخزون فيروسات طازج إذا تم تخزينه لأكثر من 4 أشهر ، أو معايرة مخزون الفيروس قبل استخدامه في التعبير34.
  5. تعبير البروتين (60 -72 ساعة بين بدء التعبير وجمع الخلية بيليه ; الشكل 1 هاء)
    1. قم بإعداد خلايا Sf9 المتنامية في مرحلة السجل بتركيز 2 × 106 خلايا / مل وإضافة فيروس P1 بنسبة 12 مل من الفيروس إلى 300 مل من تعليق الخلية.
      ملاحظة: يبلغ إنتاج البروتين حوالي 1 مجم / لتر. يوصى باستخدام ما لا يقل عن 1.5 لتر من تعليق الخلية لهذا التعبير البروتيني.
    2. استزراع الخلايا عند 27 درجة مئوية في شاكر مداري عند 135 دورة في الدقيقة لمدة 60 ساعة تقريبا.
      ملاحظة: يمكن جمع عينات صغيرة في نقاط زمنية مختلفة وتحليلها باستخدام المواد الهلامية SDS لتقييم مستويات التعبير عن البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم دمج البروتينات مع علامات الفلورسنت ، فيمكن تقييم مستويات التعبير باستخدام الفحص المجهري الفلوري. يجب حصاد الخلايا في موعد لا يتجاوز بداية موت الخلايا.
    3. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 3،735 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الخلايا. يمكن تخزين الكريات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي أو حفظها للتخزين طويل الأجل. عادة ما نستخدم حبيبات الخلايا في غضون أسابيع ولكننا استعدنا البروتين النشط بعد عدة أشهر من التجميد.
  6. تنقية البروتين (2 أيام ؛ الشكل 1F)
    ملاحظة: اليوم 1 - استخراج البروتين وتنقيته باستخدام كروماتوغرافيا تقارب FLAG. اليوم 2 - Aliquot وتجميد العينات بعد غسيل الكلى طوال الليل. البروتوكول الموضح أدناه مخصص لتنقية الميوسين 7 أ من كريات خلية 1.5 لتر.
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت الرئيسي الذي يحتوي على 10 ملي مولار MOPS (درجة الحموضة 7.2) ، و 500 ملي كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي مولار MgCl2 ، و 1 ملي مولار EGTA ، و 1 ميكروغرام / مل ليوببتين ، و 100 ميكروغرام / مل من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF). قم بتصفيته باستخدام مرشح بحجم المسام 0.22 ميكرومتر وقم بتخزين المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: PMSF غير مستقر في المحاليل المائية. قم بإعداد محلول مخزون PMSF على شكل 1 متر في 100٪ إيثانول وتخزينه عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. قم بإعداد 75 مل من Extraction Buffer عن طريق استكمال Master Buffer ب 3 أقراص مثبطة للبروتياز خالية من EDTA ، و 2 ملي مولار ATP ، و 0.1 ملي مولار من الديثيوثريتول (DTT ؛ انظر جدول المواد).
    3. أضف 75 مل من Extraction Buffer إلى الحبيبات وهي لا تزال مجمدة. اترك الحبيبات في مخزن الاستخراج المؤقت على الجليد حتى تذوب. استخدم ماصة مصلية لتفتيت الحبيبات لتسريع عملية الذوبان.
    4. باستخدام طرف 1/2 بوصة (13 مم) ، قم بصوتنة إعادة التعليق على الجليد لمدة 10 دقائق بسعة 50٪ ، و 5 ثوان ، و 5 ثوان.
    5. جهاز الطرد المركزي إجمالي المحللة عند 33،746 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد 1.5 مل من راتنج FLAG عن طريق غسل 3 مل من الملاط بنسبة 50٪ من راتنج التقارب المضاد ل FLAG (انظر جدول المواد) مع 40 مل من PBS. قم بتكسير الراتنج عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة PBS بعناية دون إزعاج الراتنج.
    6. أضف المادة الطافية من الطرد المركزي المحلل إلى الراتنج المغسول واحتضانها بدوران مستمر عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
    7. بيليه الراتنج عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. دون إزعاج الراتنج ، قم بإزالة المادة الطافية.
    8. أعد تعليق الراتنج في 40 مل من Master Buffer وأجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الراتنج. كرر الغسيل 1x.
    9. انقل الراتنج المغسول إلى عمودين من البولي بروبلين (انظر جدول المواد). اغسل كل عمود 1x ب 2 مل من Master Buffer. قم بإزالة المخزن المؤقت الرئيسي عن طريق الطرد المركزي للعمود عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. سيتم تعبئة الراتنج في الأسفل.
    10. قم بإعداد المخزن المؤقت للشطف عن طريق إضافة 100 ميكروغرام / مل من ببتيد FLAG (انظر جدول المواد) إلى المخزن المؤقت الرئيسي.
    11. أضف 300 ميكرولتر من Elution Buffer إلى الراتنج المعبأ في كل عمود واخلطه برفق عن طريق سحب العينات لضمان ترطيب الراتنج تماما بواسطة Elution Buffer. دع الراتنج يحتضن مع Elution Buffer على الجليد لمدة 10 دقائق.
    12. الطرد المركزي الأعمدة عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. انقل التدفق إلى أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق واحتفظ به على الجليد. هذا هو الكسر الأول.
    13. كرر الخطوات 1.6.11-1.6.12 بحيث يتم جمع 4 كسور من كل عمود.
    14. قم بإجراء الرحلان الكهربائي للهلام SDS-PAGE35 مع كسور الشطف لتحديد تركيزاتها النسبية. أثناء تشغيل الجل ، قم بإعداد عازل غسيل الكلى يحتوي على 500 ملي كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي مولار MOPS ، و 2 ملي ملي MgCl2 ، و 0.1 ملي مولار EGTA ، و 1 ملي مولار DTT.
    15. اجمع بين الكسور الأكثر تركيزا. انقل العينة إلى كاسيت غسيل الكلى 10K MWCO (انظر جدول المواد) وقم بغسيل الكلى طوال الليل عند 4 درجات مئوية. استخدم 1 لتر من محلول غسيل الكلى لحوالي 500 ميكرولتر من البروتين. قم بإجراء ثلاثة تغييرات على الأقل في المخزن المؤقت لغسيل الكلى.
      ملاحظة: يسمح عمود الدوران وطريقة شطف الطرد المركزي بتصفية البروتينات بتركيزات عالية (0.5-1 مجم / مل). لا يلزم عادة اتخاذ مزيد من خطوات التركيز. ومع ذلك ، إذا كانت هناك حاجة إلى بروتينات أكثر تركيزا ، فقم بتحميل العينات على 100,000 MWCO أنابيب تركيز (انظر جدول المواد) وأجهزة الطرد المركزي عند 1,400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه العملية حتى يتم تحقيق حجم محلول البروتين المطلوب.
    16. في اليوم التالي ، قم بتفريغ العينة بعناية من كاسيت غسيل الكلى. Aliquot 15 ميكرولتر لكل أنبوب PCR وإسقاط الأنابيب في وعاء من النيتروجين السائل للتجميد السريع. يمكن تخزين البروتينات المجمدة عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل (الشكل 3 أ).
      ملاحظة: عادة ما يتراوح إنتاج الميوسين 7 أ باستخدام هذه الطريقة بين 0.5 و 1 مجم / لتر.

2. تنقية السلاسل الخفيفة RLC و CALML4 باستخدام نظام الإشريكية القولونية His6-SUMO (7 أيام)

ملاحظة: الأيام 1-4 - استنساخ وتنقية البلازميدات. اليوم 5 - التحول البكتيري. الأيام 6-7 - تنقية البروتينات النهائية ونقلها وتجميدها.

  1. استنساخ cDNAs التي تشفر RLC و CALML4 في متجه pET-SUMO ، والذي يحتوي على تسلسل His6 قبل SUMO للمساعدة في التنقية. عند الحاجة ، يمكن فصل مجال His6-SUMO عن بروتين الاندماج باستخدام بروتياز SENP226،36.
  2. لكل بروتين سلسلة خفيفة ، قم بتحويل BL21 بكتريا قولونية الخلايا المختصة (انظر جدول المواد) مع البلازميد وابدأ زراعة سائلة 5 مل بين عشية وضحاها مع الخلايا المحولة.
  3. في اليوم التالي ، قم بتلقيح 5 مل للثقافة الليلية في 1 لتر من مرق لوريا بيرتاني (LB) الذي يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين. اسمح للثقافة بالنمو عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر عند 270 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة الضوئية (OD) إلى 0.6 - 1.0.
    ملاحظة: تتضاعف قيمة OD كل 20 دقيقة تقريبا بمجرد وصولها إلى 0.2. راقب OD بشكل متكرر.
  4. ابدأ التعبير عن البروتين عن طريق إضافة 250 ميكرومتر من الأيزوبروبيل b-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى المزرعة. احتضن لمدة 3-5 ساعات عند 37 درجة مئوية أو 16 درجة مئوية طوال الليل مع اهتزاز مستمر عند 270 دورة في الدقيقة.
  5. حبيبات الإشريكية القولونية عن طريق الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 4,347 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
  6. قم بإعداد مخزن مؤقت لإعادة التعليق يحتوي على 50 ملي مولار Tris-HCl ، و 1 M كلوريد الصوديوم ، و 5 ملي مولار إيميدازول ، و 10٪ جلسرين ، درجة الحموضة 7.4 (انظر جدول المواد). ابق على الجليد.
  7. أعد تعليق الحبيبات في 15-25 مل من Resuspension Buffer وانقل التعليق إلى دورق نظيف ، واضبط الحجم الإجمالي إلى 35 مل. أضف DNase و RNase إلى المعلق بنسبة 1: 1000 (v / v) للتركيز النهائي 1 ميكروغرام / مل و 2 ميكروغرام / مل ، على التوالي. أضف قرصا واحدا لمثبط الإنزيم البروتيني الخالي من EDTA ، و 4 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول ، و 1٪ تريتون X إلى التعليق (انظر جدول المواد). يحفظ على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  8. قم بتشغيل تعليق الحبيبات في الماء المثلج مع تشغيل 1 ثانية ، و 1 ثانية ليصبح المجموع 1 دقيقة بسعة 100٪. اترك المحللة المتجانسة عند 4 درجات مئوية مع دوران مستمر لمدة ساعتين.
    ملاحظة: تساعد إضافة Triton X في تحلل الخلايا استعدادا للصوتنة.
  9. جهاز الطرد المركزي المحلل عند 26,900 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أثناء حدوث ذلك ، ابدأ في تحضير راتنج الكوبالت (انظر جدول المواد). استخدم 500 ميكرولتر من راتنج الكوبالت ل 1 لتر من ثقافة الإشريكية القولونية . اغسل الراتنج 2x بالماء فائق النقاء ومرة واحدة باستخدام Suspension Buffer عن طريق الطرد المركزي عند 4,347 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
  10. بعد الطرد المركزي المحلل ، امزج المادة الطافية مع الراتنج المغسول والصخور برفق عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  11. جهاز الطرد المركزي لتعليق راتنج المحللة عند 4،347 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. سيتم تعبئة الراتنج في الجزء السفلي من الأنبوب. دون إزعاج الراتنج ، قم بإزالة المادة الطافية.
  12. اغسل الراتنج باستخدام Resuspension Buffer عن طريق الطرد المركزي عند 4,347 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية. كرر الغسيل حتى يصبح المادة الطافية عديمة اللون.
  13. قم بإعداد محلول الشطف الذي يحتوي على 50 ملي مولار Tris HCl ، و 300 ملي كلوريد الصوديوم ، و 5 ملي مولار إيميدازول ، و 10٪ جلسرين ، و 4 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول ، و 0.25 ميكرومتر من البروتياز SENP2 (انظر جدول المواد). احتفظ بها على الجليد.
  14. أعد تعليق الراتنج في 1 مل من Resuspension Buffer واحتضنه طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الدوران المستمر.
  15. في اليوم التالي ، جهاز الطرد المركزي عند 4,347 × جم لمدة دقيقتين لحبيبات الراتنج. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على بروتين السلسلة الخفيفة المشقوقة والبروتياز.
  16. أضف 1 مل من Elution Buffer إلى الراتنج. كرر الطرد المركزي وجمع المادة الطافية.
  17. قم بإزالة البروتياز عن طريق كروماتوغرافيا البروتين السائل السريع (FPLC). باختصار ، قم بإعداد عمود استبعاد الحجم (انظر جدول المواد) بمخزن مؤقت يحتوي على 50 ملي مولار Tris-HCl و 300 ملي كلوريد الصوديوم و 10٪ جلسرين و 5 ملي مولار DTT (درجة الحموضة 7.4). ركز المادة الطافية إلى 500 ميكرولتر باستخدام أنبوب تركيز 10,000 MWCO. قم بتحميل العينة المركزة على عمود متصل بنظام كروماتوغرافيا آلي باستخدام حقنة ، وتدفقها باستخدام مخزن مؤقت يحتوي على 50 ملي مولار Tris-HCl ، و 300 ملي كلوريد الصوديوم ، و 10٪ جلسرين ، و 5 ملي مولار DTT (درجة الحموضة 7.4). راقب الكسور التي تم جمعها باستخدام قياس الطيف الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية. اجمع كسور البروتين بوزن جزيئي يتوافق مع سلاسل الضوء.
    ملاحظة: يمكن أيضا إزالة البروتياز عن طريق كروماتوغرافيا التقارب إذا تم تصميم علامة تنقية (على سبيل المثال ، علامة ضريبة السلع والخدمات) في البروتياز.
  18. قم بتشغيل جل SDS-PAGE مع كسور الشطف لتحديد النقاء والتركيزات النسبية لبروتينات السلسلة الخفيفة في كل جزء. الكسور المرغوبة هي تلك التي تحتوي على بروتينات السلسلة الخفيفة المركزة بدون أي نطاقات بروتياز مرئية. اجمع بين أجزاء البروتين المرغوبة وركزها باستخدام أنبوب تركيز 10,000 MWCO35.
  19. قم بتجميد كميات البروتين في النيتروجين السائل ونقلها على الفور إلى -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل (الشكل 3 ب).
    ملاحظة: يبلغ عائد RLC و CALML4 باستخدام نظام الإشريكية القولونية His6-SUMO حوالي 1-2 مجم / لتر.

3. مقايسة انزلاق خيوط الأكتين المصممة خصيصا (3 ساعات)

ملاحظة: تتشابه الطرق المستخدمة في هذا القسم مع تلك الموصوفة للميوسين31 الأخرى مع التعديلات الرئيسية التي تتمثل في حضانة وتطبيق الميوسين في عازلة عالية القوة الأيونية والفاصل الزمني الطويل المطلوب لتحقيق قياس دقيق للإزاحة من إطار إلى إطار.

  1. تحضير 20 ميكرومولار أكتين خيطي (F-actin) عن طريق بلمرة الأكتين الكروي (G-actin) في مخزن البلمرة المؤقت (50 ملي مولار KCl ، 25 ملي مولار MOPS ، 2 ملي مولار MgCl2 ، 1 ملي مولار DTT (درجة الحموضة 7.0)) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. قم بتسمية F-actin بإضافة 1.2x من الرودامين والفالودين المولي الزائد (انظر جدول المواد). غطيها بورق الألمنيوم واحتضنها على الثلج لمدة 2 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: يمكن شراء G-actin من البائعين التجاريين (انظر جدول المواد) أو تنقيته من مسحوق الأسيتون لعضلات الأرانب31،37. يمكن تخزين F-actin المسمى عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين عند هذا التركيز.
  2. قم بإعداد غرفة التدفق كما هو موضح سابقا31. باختصار ، ضع شريطين من الشريط على الوجهين على بعد 2-3 مم على شريحة مجهر نظيفة ومعالجة بالنيتروسليلوز (انظر جدول المواد). ضع جانب النيتروسليلوز الغطاء لأسفل على الشرائط ، مما يؤدي إلى إنشاء غرفة تدفق بحجم تقريبي يبلغ 10 ميكرولتر (الشكل 4).
  3. إجراء فحص انزلاق خيوط الأكتين
    1. إلى غرفة التدفق ، أضف حجما واحدا من 0.2 مجم / مل من بروتين الميوسين البشري المنقى 7a في 500 ملي مولار من كلوريد الصوديوم (500 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار MOPS ، 5 ملي ملي كلوريد2 ، 0.1 ملي مولار EGTA (الرقم الهيدروجيني 7.4)). اتركيه يحتضنون لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان إضافة الميوسين -7 أ في مخزن مؤقت عالي الملح لأن هذا يخفف من حالة التثبيط الذاتي ويسمح للميوسين -7 أ بالالتصاق بالسطح في التشكل المنشط.
    2. اغسل غرفة التدفق بأحجام ثلاثية الغرف من 1 مجم / مل BSA (انظر جدول المواد) في 150 ملي مولار كلوريد الصوديوم (150 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار MOPS ، 5 ملي ملليجرامكلوريد 2 ، 0.1 ملي مولار EGTA ، 1 ملي مولار DTT (درجة الحموضة 7.4)) لسحب السائل باستخدام منديل نظيف عند المخرج لامتصاص السوائل الزائدة. احتضن لمدة 1 دقيقةبعد الغسيل الثالث.
    3. قم بتدفق حجم غرفة واحدة من 10 نانومتر من الرودامين الفالودين المسمى F-actin في 150 ملي مولار من NaCl Motility Buffer عبر غرفة التدفق. مراقبة ارتباط خيوط الأكتين بالسطح تحت المجهر الفلوري بهدف 100x. يجب أن تكون كثافة خيوط الأكتين مثالية (الشكل 5 أ) ، مما يضمن خيوطا كافية في مجال الرؤية للتتبع ولكنها متناثرة بما يكفي لمنع تداخل الخيوط المتعددة ، مما يعقد التتبع.
    4. اغسل غرفة التدفق بأحجام ثلاثية الغرف من 150 ملي مولار NaCl Motility Buffer لإزالة خيوط الأكتين غير المرتبطة والرودامين فالودين الزائد.
    5. ابدأ الحركة عن طريق إضافة حجم غرفة واحد من المخزن المؤقت النهائي (200 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار MOPS ، 5 ملي ملي كلوريد2 ، 0.1 ملي مولار EGTA ، 50 ملي مولار DTT ، 2 ملي مولار ATP ، 2.5 مجم / مل جلوكوز ، 100 ميكروغرام / مل جلوكوز أوكسيديز ، 2 ميكرومتر RLC ، 2 ميكرومتر CaM ، 2 ميكرومتر CALML4).
    6. سجل الصور على مجهر مضان باستخدام إثارة 561 نانومتر لتصور الأكتين المسمى بالرودامين الفالويدين. ابحث عن منطقة على الشريحة بكثافة الأكتين المطلوبة (الشكل 5 أ) والتقط الصور كل 30 ثانية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: تبلغ سرعة الميوسين الثديي -7 أ حوالي 5 نانومتر / ثانية. عند ضبط معدل إطارات الاستحواذ ، من المهم التأكد من أن إزاحة الخيوط بين الإطارات طويلة بما يكفي (أكثر من بكسل واحد) للسماح بالتتبع الدقيق. يمكن أن تتسبب حركات البكسل الفرعي بين الإطارات في المبالغة في تقدير السرعة. يسمح معدل الإطارات البالغ 30 ثانية لخيوط الأكتين بالتحرك حوالي 150 نانومتر بين الإطارات ، أي ما يعادل أكثر من بكسلين على المجهر. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر من إمكانية ملاحظة إزاحة كبيرة على المجهر المستخدم. إذا كان ذلك متاحا ، يمكن استخدام التسجيل متعدد المواضع لجمع العديد من مجالات الرؤية للتحليل في وقت واحد.
  4. تحليل حركة خيوط الأكتين باستخدام برنامج FAST (المثبت على جهاز Mac)38.
    ملاحظة: برنامج FAST المستخدم هنا هو واحد فقط من العديد من الخيارات لقياس حركة الفتيل. اخترنا استخدام FAST لأنه مؤتمت وسريع ولا يتطلب برامج مدفوعة. تشمل الخيارات الأخرى الخوارزميات المستندة إلى MATLAB مثل FIESTA والطرق المستندة إلى ImageJ / FIJI مثل MTrack2 والتتبع اليدوي والأساليب المستندة إلى Python مثل Philament39.
    1. قم بتنزيل وتثبيت برنامج FAST (github.com/NeilBillington/FASTrack3 - إصدار متوافق مع python3 مع وحدة إضافية ل. تحويل ملف nd2. ملحوظة: يمكن العثور على الإصدار الأصلي من python2 في github.com/turalaksel/FASTrack).
    2. قم بتشغيل برنامج FAST كما هو موضح في38 باستخدام قيمة تفاوت 33 للاحتفاظ بالخيوط المتحركة السلسة فقط.
      ملاحظة: إذا كانت الصور تحتوي على الانجراف إلى المشكلات الميكانيكية في المسرح أو من جمع عدة سلاسل في وقت واحد ، فيجب أولا تثبيت الأفلام. لهذا ، نوصي باستخدام مثبت الصور الإضافي FIJI ، المتاح للتنزيل على العنوان التالي - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
    3. استخدم برنامج FAST لتحليل صور .tif التي تم إنشاؤها حديثا عن طريق تعيين القيم -xmax و -ymax أولا. تحدد هذه المعلمات لإخراج مخطط التشتت بواسطة البرنامج وتمثل أطول طول خيوط (بالنانومتر) وسرعة الفتيل القصوى (بالنانومتر / ثانية). استخدمنا 20,000 نانومتر ل -xmax و 20 نانومتر / ثانية ل -ymax في هذا المثال لضمان التقاط جميع البيانات (الشكل 5 د).
    4. استخدم -px لتعيين حجم البكسل للصورة المكتسبة ، والذي سيكون هنا 65 نانومتر ، و -minv لتعيين الحد الأدنى للسرعة (بالنانومتر / ثانية) المطلوبة من خيوط لإدراجها في التحليل. بالنسبة للسرعة المنخفضة للميوسين 7a في هذا المثال ، استخدم 0.1 نانومتر / ثانية.
    5. استخدم -maxd لتعيين الحد الأقصى للمسافة المسموح بها بين الإطارات لربط الخيوط. تم تعيين هذا لتجنب ربط خيوط منفصلة بين الإطارات وفي هذا المثال ، نستخدم 2000 نانومتر الافتراضي.
    6. استخدم pt لضبط التسامح مع التقلبات في سرعات الفتيل ويشمل فقط الخيوط ذات الحركات السلسة. يستخدم هذا المثال عتبة تفاوت تبلغ 33٪. هذا يعني أنه سيتم استبعاد الخيوط ذات الانحراف المعياري للسرعة أكبر من 33٪ من متوسط السرعة من مزيد من التحليل.
    7. أخيرا ، استخدم -d للإشارة إلى المجلد الذي يحتوي على مكدسات .tif للتحليل. ستكون سلسلة الأوامر بأكملها مع المعلمات والقيم المحددة: سريع -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [اسم المجلد الذي يحتوي على أفلام].
      ملاحظة: سيقوم برنامج FAST بإخراج مخططات مبعثرة (الشكل 5 د) مع البيانات الأولية المرتبطة بها ، والتي يمكن استخراجها للتحليل والتصور في برامج أخرى (الشكل 5 ج). كما سيخرج مخططا لمسارات الخيوط المتعقبة (الشكل 5 ب) ، والذي يجب استخدامه للتحقق من أن التتبع يعمل كما هو متوقع. يتم تضمين أمثلة على المخططات وغيرها من تصورات البيانات المحتملة أدناه.

النتائج

يمكن تقييم بروتينات الميوسين -7a المعقدة والسلسلة الخفيفة المنقاة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام SDS-PAGE ، كما هو موضح في الشكل 3. يتوافق النطاق الموجود فوق علامة 200 كيلو دالتون مع سلسلة الميوسين -7a الثقيلة (255 كيلو دالتون). النطاقات الثلاثة التي تهاجر بين عل...

Discussion

يتم تقديم بروتوكول مفصل لإنتاج بروتين الميوسين البشري المؤتلف 7a من خلايا الحشرات. على الرغم من استخدام نظام Sf9 / الفيروس العصبي لإنتاج مجموعة متنوعة من الميوسين40،41،42،43 ، إلا أنه لم يتم تنقية الميوسين ...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر مرفق التصوير المجهري والوظيفة البصرية وجوهر التشكل في جامعة ويست فيرجينيا على المناقشة والمساعدة في تحليل الصور. يتم دعم هذا العمل من خلال صناديق بدء التشغيل من كلية الطب بجامعة ويست فيرجينيا إلى RL. يتم دعم هذا العمل أيضا من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) مركز العلوم البصرية للتميز في البحوث الطبية الحيوية (Vs-CoBRE) (P20GM144230) ، وشبكة NIGMS West Virginia للتميز في البحوث الطبية الحيوية (WV-INBRE) (P20GM103434).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL microcentrifuge tubesVWR87003-294
1X FLAG PeptideGenScriptN/ACustom peptide synthesis
22x22mm No. 1.5 coverslipsVWR48366-227
250 mL Conical Centrifuge TubesNunc376814
250 mL Vented Erlenmyer Shaker FlaskIntelixBioDBJ-SF250VP
2-MercaptoethanolVWRM131
75x25x1 mm Vistavision microscope slidesVWR16004-42
Actin Protein (>99% Pure)CytoskeletonAKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220
ATPMillipore SigmaA7699
ATPMillipore SigmaA7699
Bio-Spin Disposable Chromatography ColumnBio-Rad732-6008
BL21 Competent E. coliNew England BiolabsC2530H
Bluo-GalThermo Fisher15519028
Bovine Serum AlbuminMillipore Sigma5470
BstXI EnzymeNew England BiolabsR0113S
CalmodulinMillipore Sigma208694
CatalaseMillipore SigmaC40
Champion pET-SUMO Expression SystemThermo FisherK30001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche Diagnostics5056489001
Cutsmart BufferNew England BiolabsB6004S
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DNase I, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-610-304
Double-Sided TapeOffice Depot909955
EGTA, Molecular Biology GradeMillipore Sigma324626-25GM
EGTA, Molecular Biology GradeMillipore Sigma324626-25GM
EthanolThermo FisherBP2818
ExpiFectamine Sf Transfection ReagentGibcoA38915
FAST programhttp://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements; 
Fisherbrand Model 505 Sonic DismembratorFisher ScientificFB505110
Gentamicin Reagent SolutionGibco15710-06410 mg/mL in distilled water
GlucoseMillipore SigmaG5767
Glucose OxidaseMillipore SigmaG2133
GlycerolInvitrogen15514-011
HisPur Cobalt ResinThermo Fisher89966
I-CeuI EnzymeNew England BiolabsR0699S
Image Stabilizer Pluginhttps://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
ImidazoleMillipore SigmaI2399
In-Fusion Snap Assembly Master MixTaKaRa638948
IPTGThermo Fisher15529019
IsopropanolFisher ScientificA451SK
KanamycinFisher ScientificAAJ67354AD
Large Orifice Pipet TipsFisher Scientific02-707-1341-200uL
LB Agar, Ready-Made PowderThermo FisherJ75851-A1
Leupeptin Protease InhibitorThermo Fisher78435
Magnesium chlorideThermo FisherJ61014.=E1M
Magnesium chlorideThermo FisherJ61014.=E1M
Max Efficiency DH10Bac Competent CellsGibco10361012
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
MicroscopeNikonModel: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective
Microscope CameraORCA-Fusion BT
Microscope Laser UnitAndor iXon Ultra
Miller's LB BrothCorning46-050-CM
MOPSMillipore SigmaM3183
MOPSMillipore SigmaM3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo FisherND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo FisherND-ONE-W
NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)New England BiolabsC2987H
NEBuffer r3.1New England BiolabsB6003S
NIS ElementsNikon
NIS-ElementsNikon
NitrocelluloseLADD Research Industries53152
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco31985070
pACEBac1 VectorGeneva Biotech
ParafilmMillipore SigmaP7793
PMSFMillipore Sigma78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)Invitrogen12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)QIAGEN28104
Quick CIPNew England BiolabsM0525S
Rhodamine phalloidinInvitrogenR415
S.O.C. MediumInvitrogen15544034
SENP2 proteasePMID:17591783Purified in the lab
Sf9 cellsThermo Fisher11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media CompleteGibco12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mLThermo FisherA52971
Sodium chlorideMillipore SigmaS7653
Sodium chlorideMillipore SigmaS7653
Stericup Quick Release Vacuum Driven Disposable Filtration SystemMillipore SigmaS2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATPNew England BiolabsB0202A
Tetracycline HydrochlorideMillipore SigmaT7660-5G
TrisMillipore Sigma10708976001
Triton XAmerican Bioanalytical9002-93-1

References

  1. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. J Cell Sci. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  2. Sellers, J. R. Myosins: a diverse superfamily. Biochim Biophys Acta. 1496 (1), 3-22 (2000).
  3. Titus, M. A. Myosin-driven intracellular transport. Cold Spring Harb Perspect Biol. 10 (3), a021972 (2018).
  4. Quintanilla, M. A., Hammer, J. A., Beach, J. R. Non-muscle myosin 2 at a glance. J Cell Sci. 136 (5), jcs.260890 (2023).
  5. Peckham, M. Coiled coils and SAH domains in cytoskeletal molecular motors. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1142-1148 (2011).
  6. Batters, C., Veigel, C., Homsher, E., Sellers, J. R. To understand muscle you must take it apart. Front Physiol. 5, 90 (2014).
  7. Friedman, T. B., Sellers, J. R., Avraham, K. B. Unconventional myosins and the genetics of hearing loss. Am J Med Genet. 89 (3), 147-157 (1999).
  8. Geeves, M. A., Holmes, K. C. The molecular mechanism of muscle contraction. Adv Protein Chem. 71, 161-193 (2005).
  9. Batters, C., Veigel, C. Mechanics and activation of unconventional myosins. Traffic. 17 (8), 860-871 (2016).
  10. Houdusse, A., Sweeney, H. L. How myosin generates force on actin filaments. Trends Biochem Sci. 41 (12), 989-997 (2016).
  11. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biol. 8 (9), R196 (2007).
  12. Moreland, Z. G., Bird, J. E. Myosin motors in sensory hair bundle assembly. Curr Opin Cell Biol. 79, 102132 (2022).
  13. Williams, D. S., Lopes, V. S. The many different cellular functions of MYO7A in the retina. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1207-1210 (2011).
  14. Hollo, A., et al. Molecular regulatory mechanism of human myosin-7a. J Biol Chem. 299 (10), 105243 (2023).
  15. Choi, M. S., et al. The small EF-hand protein CALML4 functions as a critical myosin light chain within the intermicrovillar adhesion complex. J Biol Chem. 295 (28), 9281-9296 (2020).
  16. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nat Commun. 7, 10833 (2016).
  17. Whatley, M., et al. Usher syndrome: Genetics and molecular links of hearing loss and directions for therapy. Front Genet. 11, 565216 (2020).
  18. Ahmed, Z. M., et al. USH1H, a novel locus for type I Usher syndrome, maps to chromosome 15q22-23. Clin Genet. 75 (1), 86-91 (2009).
  19. Liu, X., Ondek, B., Williams, D. S. Mutant myosin VIIa causes defective melanosome distribution in the RPE of shaker-1 mice. Nat Genet. 19 (2), 117-118 (1998).
  20. Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
  21. Houdusse, A., Titus, M. A. The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia. Curr Biol. 31 (10), R586-R602 (2021).
  22. Schwander, M., Kachar, B., Muller, U. Review series: The cell biology of hearing. J Cell Biol. 190 (1), 9-20 (2010).
  23. Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
  24. Fitzgerald, D. J., et al. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
  25. Sari, D., et al. The MultiBac baculovirus/insect cell expression vector system for producing complex protein biologics. Adv Exp Med Biol. 896, 199-215 (2016).
  26. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin-7 outperforms synaptotagmin-1 to promote the formation of large, stable fusion pores via robust membrane penetration. Nat Commun. 14 (1), 7761 (2023).
  27. Courtney, K. C., et al. The complexin C-terminal amphipathic helix stabilizes the fusion pore open state by sculpting membranes. Nat Struct Mol Biol. 29 (2), 97-107 (2022).
  28. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin 1 oligomerization via the juxtamembrane linker regulates spontaneous and evoked neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (48), e2113859118 (2021).
  29. Yu, I. M., et al. Myosin 7 and its adaptors link cadherins to actin. Nat Commun. 8, 15864 (2017).
  30. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  31. Sellers, J. R. In vitro motility assay to study translocation of actin by myosin. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, 13.2 (2001).
  32. Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-specific adaptations of in vitro fluorescence microscopy-based motility assays. J Vis Exp. (168), e62180 (2021).
  33. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  34. Jorio, H., Tran, R., Kamen, A. Stability of serum-free and purified baculovirus stocks under various storage conditions. Biotechnol Prog. 22 (1), 319-325 (2006).
  35. JoVE Science Education Database. Separating protein with SDS-PAGE. Basic methods in cellular and molecular biology. , (2023).
  36. Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. J Biol Chem. 282 (36), 26217-26224 (2007).
  37. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods Enzymol. 85 Pt B, 164-181 (1982).
  38. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Rep. 11 (6), 910-920 (2015).
  39. Bowser, R. M., Farman, G. P., Gregorio, C. C. Philament: A filament tracking program to quickly and accurately analyze in vitro motility assays. Biophys Rep. 4 (1), 100147 (2024).
  40. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  41. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. J Biol Chem. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  42. Billington, N., et al. Myosin 18A coassembles with nonmuscle myosin 2 to form mixed bipolar filaments. Curr Biol. 25 (7), 942-948 (2015).
  43. Lu, W., et al. Competition between kinesin-1 and myosin-V defines Drosophila posterior determination. Elife. 9, 54216 (2020).
  44. Liu, R., et al. A binding protein regulates myosin-7a dimerization and actin bundle assembly. Nat Commun. 12 (1), 563 (2021).
  45. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Myosin light chains: Teaching old dogs new tricks. Bioarchitecture. 4 (6), 169-188 (2014).
  46. Belyaev, A. S., Hails, R. S., Roy, P. High-level expression of five foreign genes by a single recombinant baculovirus. Gene. 156 (2), 229-233 (1995).
  47. Li, J., et al. Ca(2+)-induced rigidity change of the myosin VIIa IQ motif-single alpha helix lever arm extension. Structure. 25 (4), 579-591.e4 (2017).
  48. Persson, M., Bengtsson, E., ten Siethoff, L., Mansson, A. Nonlinear cross-bridge elasticity and post-power-stroke events in fast skeletal muscle actomyosin. Biophys J. 105 (8), 1871-1881 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

210 7 1 4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved