Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מפרט את ההליכים לייצור רקומביננטי של ההולואנזים מיוזין-7a האנושי באמצעות מערכת MultiBac Baculovirus ולחקר תנועתיותו באמצעות בדיקת גלישה מותאמת אישית של חוטי להט במבחנה.

Abstract

מיוזין-7a הוא חלבון מוטורי מבוסס אקטין החיוני לתהליכים שמיעתיים וחזותיים. מוטציות במיוזין-7a מובילות לתסמונת אשר מסוג 1, הצורה הנפוצה והחמורה ביותר של עיוורון חירש בבני אדם. משערים כי מיוזין-7a יוצר קומפלקס היצמדות טרנסממברנה עם חלבוני אשר אחרים, החיוני לשלמות המבנית-תפקודית של קולטני אור ותאי שיער שבלול. עם זאת, בשל האתגרים בהשגת חלבון טהור ושלם, המנגנונים הפונקציונליים המדויקים של מיוזין-7a אנושי נותרו חמקמקים, עם מחקרים מבניים וביומכניים מוגבלים זמינים. מחקרים אחרונים הראו כי מיוזין-7a של יונקים הוא קומפלקס מוטורי מולטימרי המורכב משרשרת כבדה ומשלושה סוגים של שרשראות קלות: שרשרת קלה רגולטורית (RLC), קלמודולין וחלבון דמוי קלמודולין 4 (CALML4). שלא כמו קלמודולין, CALML4 אינו נקשר ליוני סידן. הן הקלמודולינים הרגישים לסידן והן הקלמודולינים שאינם רגישים הם קריטיים עבור מיוזין-7a של יונקים לכוונון עדין נכון של תכונותיו המכניות. במאמר זה אנו מתארים שיטה מפורטת לייצור הולואנזים רקומביננטי מסוג מיוזין-7a אנושי באמצעות מערכת ביטוי החלבונים MultiBac Baculovirus. זה מניב כמויות מיליגרם של חלבון באורך מלא טהור גבוה, המאפשר את האפיון הביוכימי והביופיזי שלו. בהמשך אנו מציגים פרוטוקול להערכת תכונותיו המכניות והתנועתיות באמצעות מבחני תנועתיות חוץ גופית ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. זמינותו של חלבון מיוזין-7a אנושי שלם, יחד עם פרוטוקול האפיון הפונקציונלי המפורט המתואר כאן, סוללים את הדרך לחקירות נוספות של ההיבטים המולקולריים של מיוזין-7a בראייה ובשמיעה.

Introduction

מיוזין הם חלבונים מוטוריים מולקולריים המקיימים אינטראקציה עם אקטין כדי להניע תהליכים תאיים רבים 1,2,3,4. לבני אדם יש 12 סוגים ו-39 גנים של מיוזין5, המעורבים במגוון רחב של תפקודים פיזיולוגיים, כגון כיווץ שרירים6 ותהליכים חושיים7. כל מולקולת מיוזין היא קומפלקס מולטימרי המורכב משרשרת כבדה ושרשראות קלות. השרשרת הכבדה מחולקת לאזורי ראש, צוואר וזנב. הראש מכיל אתרים קושרי אקטין ונוקלאוטידים האחראים על הידרוליזה של ATP ויצירת כוח על חוטי אקטין2. הצוואר נוצר על ידי מספר מוטיבים α-סליליים IQ שבו קבוצה מסוימת של שרשראות אור קשורות. יחד הם מתפקדים כזרוע מנוף להגברת שינויי הקונפורמציה של המנוע לתנועות גדולות 8,9,10. הזנב מכיל תת-דומיינים ספציפיים למחלקה וממלא תפקיד רגולטורי בכוונון הפעילות המוטורית של מיוזין ובתיווך אינטראקציות עם שותפים לקשירת תאים 2,11.

מיוזין-7a אנושי, חבר במיוזין סוג 7, חיוני לתהליכים שמיעתיים וחזותיים12,13. מוטיבים IQ של מיוזין-7a אנושי קשורים לשילוב ייחודי של שרשראות אור, כולל שרשרת האור הרגולטורית (RLC), קלמודולין וחלבון דמוי קלמודולין 4 (CALML4)14,15,16. מלבד ייצוב זרוע המנוף, שרשראות אור אלה מווסתות את התכונות המכניות של מיוזין-7a בתגובה לאיתות סידן, תכונה שנראית ייחודית לאיזופורם14 של יונקים.

פגמים בגן המקודד את השרשרת הכבדה מיוזין-7a (MYO7A/USH1B) אחראים לתסמונת אשר מסוג 1, הצורה החמורה ביותר של ליקוי ראייה ושמיעה משולב בבני אדם17. בנוסף, גן השרשרת הקלה CALML4, הוא בין הגנים המועמדים שמופו להכיל את האלל הסיבתי עבור USH1H, גרסה נוספת של תסמונת אשר מסוג 115,18. ברשתית, מיוזין-7a מתבטא באפיתל פיגמנט הרשתית ובתאי קולטני אור13. הוא היה מעורב בלוקליזציה של מלנוזומים באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE)19 ופאגוציטוזה של דיסקים בסגמנט החיצוני של קולטני האור על ידי תאי RPE20. באוזן הפנימית, מיוזין-7a נמצא בעיקר בסטריאוציליה, שם הוא ממלא תפקיד קריטי בביסוס צרורות שיער ובעיכוב תהליך הטרנסדוקציה המכנו-חשמלית 12,21,22.

בעוד חשיבותו של מיוזין-7a בתאי חישה מבוססת היטב, המנגנונים הפונקציונליים שלו ברמה המולקולרית עדיין אינם מובנים. פער הידע הזה נובע בחלקו מהאתגרים בטיהור החלבון השלם, במיוחד האיזופורם של היונקים. לאחרונה חלה התקדמות משמעותית בשימוש במערכת MultiBac כדי לבטא באופן רקומביננטי את המיוזין-7a הולואנזים האנושי המלא14. התקדמות זו אפשרה אפיונים מבניים וביופיזיקליים של חלבון מוטורי זה, מה שהוביל לגילוי מספר תכונות ייחודיות של מיוזין-7a אנושי המותאמות במיוחד לתפקודי שמיעה של יונקים14,23.

מערכת MultiBac היא פלטפורמה מתקדמת של תאי baculovirus/insect שתוכננה במיוחד לביטוי קומפלקסים מולטימריים אאוקריוטים24,25. תכונה מרכזית של מערכת זו היא יכולתה לארח קלטות ביטוי גנים מרובות, שכל אחת מהן מקודדת תת-יחידה של המתחם, בתוך בקולווירוס MultiBac יחיד. הרכבת קלטות הביטוי הרב-גניות מתאפשרת באמצעות מה שמכונה מודול כפל: אתר אנדונוקלאז ביתי (HE) ואתר BstXI תואם המקיף את אתרי השיבוט המרובים (MCS). מודול זה מאפשר הרכבה איטרטיבית של קלטת ביטוי יחיד על ידי הגבלה/קשירה, תוך מינוף העובדה שאתרי ההגבלה HE ו- BstXI מתבטלים עם קשירתם. במאמר זה, שרשרת כבדה של מיוזין-7a אנושי, RLC, קלמודולין ו-CALML4 משובטים כל אחד לתוך מודול הכפל בתוך וקטור pACEBac1 (איור 1A), אשר לאחר מכן מורכבים לקלטת ביטוי רב-גנית באמצעות התהליך האיטרטיבי (איור 1B). קלטת המולטי-גנים myosin-7a משולבת בגנום הבקולו-ויראלי (bacmid) באמצעות טרנספוזיציה של היסוד mini-Tn7 מווקטור pACEBac1 לאתר המטרה mini-attTn7 בגנום (איור 1C). בעקבות הליכים לטיהור בקמיד, ייצור בקולו-וירוס והגברה (איור 1D,E), מכינים את ה-MultiBac baculovirus הרקומביננטי מיוזין-7a ויכולים לשמש לייצור חלבונים בקנה מידה גדול (איור 1F). בנוסף, ניתן לייצר את שרשראות האור myosin-7a בנפרד ב- E. coli ולטהר באמצעות תג His6-SUMO 26,27,28 הניתן למחשוף. שרשראות האור המטוהרות שימושיות לחקר דינמיקת הקישור שלהן והרגולציה של מיוזין-7a.

חלבון מיוזין-7a מטוהר יכול לעבור מחקרים מבניים, ביוכימיים וביופיזיקליים כדי לקבל תובנות לגבי הוויסות המבני-תפקודי של חלבון מוטורי זה. בנוסף, ניתן לבחון את יחסי הגומלין שלו עם רשת האקטין וחלבונים קושרים אחרים29 באמצעות מגוון גישות של בנייה מחדש במבחנה. ממצאים מניתוחים אלה יספקו מידע על התכונות הביופיזיקליות של מיוזין זה, ויובילו להבנה מכניסטית של האופן שבו מיוזין-7a מניע את השינויים בשלד הציטו-שלד ובסופו של דבר מעצב את המורפולוגיה והתפקוד הייחודיים של תאי החישה. במאמר זה, אנו מפרטים תהליך עבודה עבור בדיקת גלישה של נימה אקטין שהותאמה במיוחד עבור מיוזין-7a של יונקים. בדיקת גלישה של נימה אקטין היא בדיקת תנועתיות חוץ גופית חזקה החוקרת כמותית את התנועה של חוטי אקטין פלואורסצנטיים המונעים על ידי מספר רב של מנועי מיוזין המשותקים על משטח כיסוי 30,31,32. היתרונות של בדיקה זו כוללים את פשטות ההתקנה שלה, דרישות ציוד מינימליות (מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה מצויד במצלמה דיגיטלית), ויכולת שחזור גבוהה. בנוסף, מכיוון שהתנועה של סיבי אקטין מונעת על ידי מקבץ של מנועי מיוזין משותקים, בדיקה זו שימושית במיוחד לחקר התנועתיות של מיוזין מונומרי כגון מיוזין-7a14,33. הפרוטוקולים כוללים מספר שינויים, החל מפרוצדורות ניסיוניות וכלה בניתוח הדמיה, המותאמים במיוחד לתכונות התנועה הייחודיות של מיוזין-7a של יונקים. עם זמינותו של חלבון מיוזין-7a שלם ופרוטוקול האפיון הפונקציונלי המתואר כאן, מאמר זה מניח את היסודות לחקירה נוספת של התפקידים המולקולריים של מיוזין-7a בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד.

Protocol

הערה: כאן אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של ההולואנזים האנושי השלם מיוזין-7a ואפיון תנועתיותו במבחנה. פרוטוקול זה מחולק לשלושה חלקים: ראשית, ביטוי מיוזין-7a אנושי באמצעות מערכת ביטוי חלבון Baculovirus MultiBac; שנית, טיהור שרשראות אור מיוזין-7a בנפרד באמצעות מערכת E.coli His6-SUMO; ולבסוף, חקר התנועתיות של מיוזין-7A אנושי באמצעות בדיקת גלישה של אקטין נימה.

1. ייצור קומפלקס מיוזין-7a מבוסס מערכת MultiBac

  1. יצירת קלטת מולטיגן baculovirus לביטוי קומפלקס מיוזין-7a אנושי (16 ימים)
    הערה: נדרש מחזור שיבוט אחד (4 ימים) כדי להכניס את cDNA של תת-יחידות מיוזין-7a לווקטורים pACEBac1 ושלושה מחזורי שיבוט כדי להשלים את הקשירה המדורגת של כל מודולי הכפל הדרושים לביטוי קומפלקס מיוזין-7a, וכתוצאה מכך בסך הכל 16 ימים.
    1. שכפל את cDNA המקודד את השרשרת הכבדה מיוזין-7a (HC), קלמודולין, CALML4 ו-RLC לווקטורים pACEBac1 באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקולים של היצרן (ראה טבלת חומרים; איור 1A). תג FLAG מוכנס במסוף C של מיוזין-7a HC כדי לסייע בטיהור.
      הערה: מיוזין-7a של יונקים מיוצר כשני איזופורמים שחבור, הנבדלים זה מזה רק בקטע של 11 חומצות אמינו ב-N-terminus23. הרחבה קצרה זו של N-terminal ממלאת תפקיד קריטי בוויסות פעילות ATPase של מיוזין-7a14. הוכח כי הוספת תג N-terminal יכולה לשבש את הוויסות הרגיל על ידי הרחבת N-terminal זו ולהפחית באופן משמעותי את הפעילות האנזימטית והתנועתיות של המנוע14. לכן, נעשה שימוש בתג C-terminal FLAG כדי למנוע שיבוש הוויסות הטבעי של החלבון.
    2. בנו את קלטת הביטוי הרב-גנית עבור ההולואנזים מיוזין-7a באמצעות כפל אנדונוקלאז/BstXI כמתואר להלן (איור 1B).
      הערה: אנדונוקלאז הביות I-CeuI מייצר קצוות מלוכדים התואמים לקצוות שנוצרו על ידי תקציר BstXI. עם הקשירה נוצר אתר הגבלה היברידי של אנדונוקלאז/BstXI שלא ניתן לחתוך על ידי אף אנזים. ניתן לחזור על אותו הליך כדי לשלב מודולי כפל נוספים. אם קיימים אתרי הגבלה מרובים עבור I-CeuI ו- BstXI במבנים של הוספה או וקטור, יש לבטל אתרים נוספים אלה על ידי מוטגנזה מכוונת אתר כדי להבטיח שאתרי החיתוך I-CeuI ו- BstXI הם ייחודיים.
    3. הכנה: עיכול מבנה האינסרט (למשל, pACEBac-M7a HC) עם אנדונוקלאז הביות I-CeuI (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן טהרו את הפלסמיד הלינארי באמצעות ערכת טיהור PCR (ראו טבלת חומרים). יתר על כן, לעכל את פלסמיד ליניארי עם BstXI (ראה טבלה של חומרים), להפריד את המקטע המכיל את קלטת ביטוי הגן באמצעות אלקטרופורזה ג'ל, ולטהר באמצעות ערכת מיצוי ג'ל (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: I-CeuI ו- BstXI דורשים תנאי מאגר שונים, בהתאם לפרוטוקולים של היצרן, כדי להשיג 100% פעילות. בנוסף, חיתוך מלא עם I-CeuI דורש מינימום של 3 שעות, בעוד BstXI דורש רק 15 דקות של זמן הדגירה. העיכול לפיכך צריך להתבצע ברצף.
    4. הכנה וקטורית: ליניאריזציה של המבנה הווקטורי (למשל, pACEBac-CaM) באמצעות עיכול BstXI. פוספטאז אלקליין נכלל בהכנה הווקטורית כדי למנוע מהפלסמיד הווקטורי להיקשר לעצמו (ראה טבלת חומרים) . להשיג את מוצר העיכול על ידי אלקטרופורזה ולטהר אותו עם ערכת מיצוי ג'ל.
    5. קשירה: קשרו את העלון I-CeuI/BstXI שטופל ואת הווקטור שטופל ב-BstXI עם ליגאז DNA T4 (ראו טבלת חומרים). בצע תגובות קשירה בטמפרטורת החדר (20°C -25°C) במשך 10 דקות ביחס של 1:1 לפי מסת הדנ"א המוחדר לדנ"א הווקטורי, תוך שמירה על המסה הכוללת קרובה ל-100 ננוגרם בכל תגובת קשירה.
    6. טרנספורמציה וניתוח פלסמיד: הפוך את תערובות הקשירה לתאי DH5α (ראה טבלת חומרים) בהתאם להמלצות היצרן וסנן את המושבות החיוביות לעמידות לגנטמיצין. לטהר את הפלסמידים באמצעות ערכה מסחרית (ראה טבלת חומרים), ולאמת את השיבוטים הנכונים (למשל, פלסמידים המכילים גם M7a HC וגם CaM) בהתבסס על דפוסי עיכול הגבלה ספציפיים וריצוף DNA של התוספות.
    7. אינטגרציה של קלטות ביטוי גנים מרובות: חזור על שלבים 1.1.2 עד 1.1.6 כדי לשלב קלטות גנים נוספות המבטאות תת-יחידות מיוזין-7a אחרות.
  2. רקומביננטי bacmid DNA ייצור וטיהור (4 ימים; איור 1C).
    הערה: יום 1 - טרנספורמציה וגידול חיידקים של מושבות שעברו טרנספורמציה. ימים 2-3 - גידול מושבות וסינון לשינוי מוצלח. יום 3 - בחירה ופסים של מושבות חיוביות, התחלת חיסון לילה. יום 4 - טיהור DNA בקמיד.
    1. התמירו תאים מוכשרים מסוג DH10Bac (ראו טבלת חומרים) ב-1 ננוגרם של פלסמיד pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM בהתאם להמלצות היצרן.
    2. צלחת 20-200 μL של התאים על צלחת אגר המכילה 50 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין, 7 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין, 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין, 100 מיקרוגרם / מ"ל אינדוליל-β-גלקטוזיד הלוגני, ו 40 מיקרוגרם / מ"ל IPTG (ראה טבלת חומרים) ולדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות כדי לאפשר התפתחות של צבע כחול עמוק בשיבוטים שליליים.
      הערה: מושבות כתמי אינדוליל-β-גלקטוזיד הלוגניות שממשיכות לבטא LacZ (מה שמעיד על כך שהטרנספוזיציה לא הצליחה), מה שמאפשר בחירה של מושבות לבנות שבהן הטרנספוזיציה הצליחה.
    3. בחר בקפידה מושבה לבנה מבודדת וגדל תאים בן לילה ב 5 מ"ל של LB בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין, 7 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין, ו 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין ב 37 ° C בשייקר מסלול ב 225 סל"ד.
    4. צנטריפוגה את התרבית ב 2,465 x גרם במשך 10 דקות כדי להניע את E coli. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-300 מיקרוליטר של Buffer P1 מהערכה.
      הערה: בעוד חוצצים מערכת Miniprep משמשים כאן, הפרוטוקול לטיהור מוצר bacmid שונה מהפרוטוקול שסופק עם הערכה.
    5. הוסף 300 μL של Buffer P2 מהערכה. מערבבים על ידי היפוך הצינורות מספר פעמים, ולאחר מכן דוגרים בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
    6. הוסף 300 μL של חיץ N3 מהערכה וערבב בהיפוך כדי לעצור את תגובת הליזיס. צנטריפוגה ב 17,885 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    7. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור סטרילי נקי וחוזרים על הצנטריפוגה עוד 10 דקות.
    8. מעבירים 800 μL של הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי אחר של 1.7 מ"ל (ראו טבלת חומרים) ומוסיפים 600 μL של איזופרופנול קר (ראו טבלת חומרים), תוך ערבוב על ידי היפוך קפדני. ואז צנטריפוגה ב 17,885 x גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (75 °F).
    9. השליכו את הסופרנאטנט ואתרו את הגלולה הקטנה והלבנה. יש לשטוף את הגלולה עם 800 μL של אתנול קר 70% (ראה טבלה של חומרים) וצנטריפוגה ב 17,885 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות להוסיף אתנול לאורך דופן הצינור כדי למנוע הפרעה הכדור.
    10. השליכו את הסופרנאטנט וחזרו על שטיפת האתנול פעם אחת. יבשו את הגלולה באוויר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בזהירות לשאוף כל נוזל עודף, במידת הצורך.
    11. יש להמיס את הגלולה עם 20 μL של חיץ EB מהערכה. ודא שהגלולה מומסת במלואה על ידי הזזת הצינור או ערבוב עדין על ידי פיפט. קביעת ריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר (ראו טבלת חומרים).
    12. התאם את נפח המאגר לפי הצורך כדי להפוך את ריכוז ה- bacmid ל- 1 מיקרוגרם / μL בקירוב. אחסן את ה- DNA של bacmid ב- 4 ° C עד שיהיה מוכן לייצור וירוס P0.
      הערה: הבקמיד המטוהר יכול להישמר ב 4 ° C ונשאר יעיל במשך מספר חודשים. ראינו טרנספקציות מוצלחות עם מוצרי bacmid עד גיל שנה. לחלופין, bacmid יכול להיות aliquoted ומאוחסן ב -20 ° C. יש להימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה מרובים מכיוון שהם מפחיתים את יעילות ההעברה.
  3. Transfect Sf9 תאי חרק עם bacmid לייצר baculovirus רקומביננטי (6 ימים; איור 1D)
    הערה: יום 1 - טרנספקציה של תאים עם DNA bacmid. ימים 2-6 - התבוננות בגדילה ובביטוי של תאים. יום 6 - איסוף וירוס P0.
    1. הוסף תאי Sf9 במדיית תרבית (ראה טבלת חומרים) לצלחת בעלת 6 בארות בריכוז של 0.33 x 106 תאים/מ"ל עם 3 מ"ל לבאר. תנו לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית הצלחת.
    2. עבור כל באר, הכינו תערובת טרנספקציה על ידי שילוב של 10 μL של מגיב טרנספקציה קטיונית של שומנים (ראו טבלת חומרים) עם 250 μL של מדיה משופרת של Minimal Essential Medium (MEM) (ראו טבלת חומרים) בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי. מערבבים בהיפוך ודוגרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    3. הוסף 1 מיקרוגרם (מבוסס על ריכוז שנקבע בשלב 1.2.12) של מיוזין-7a bacmid לא מדולל לתערובת transfection. מערבבים בהיפוך ודוגרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    4. באופן שווה להפיץ את כל תערובת DNA-שומנים טיפה לתוך הבארות. השאירו באר אחת לתאים שאינם נגועים כבקרה שלילית.
    5. אטמו את צלחת 6 הבארות עם סרט (ראו טבלת חומרים) ודגרו בטמפרטורה של 27°C למשך 6 ימים. התבוננו בצמיחה ובניתוק לאורך כל הזמן הזה. אם קיים תג פלואורסצנטי על המבנה, בדקו התפתחות פלואורסצנטית (איור 2).
    6. כאשר התאים הנגועים מראים סימנים של זיהום בשלב מאוחר, להעביר את התווך המכיל את הנגיף מבארות נגועות לצינור חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 805 x גרם במשך 10 דקות.
    7. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי נקי בנפח 15 מ"ל, עוטפים אותו ברדיד אלומיניום ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4°C. מוצר זה הוא כעת וירוס P0 וניתן לאחסן אותו ולהשתמש בו ביעילות עד ארבעה חודשים מניסיוננו.
  4. להגביר את מלאי baculovirus (3-5 ימים ; איור 1E)
    1. הכינו 100 מ"ל (או נפח רצוי) של תאי Sf9 בריכוז של 2 x 106 תאים/מ"ל בתרבית תאים Sf9 בבקבוק Erlenmeyer של 250 מ"ל (ראה טבלת חומרים).
    2. הוסף יחס של 1:100 (v/v) של מלאי וירוס P0 לתרבית התרחיף של תאי Sf9 ודגור ב-27°C בשייקר אורביטלי ב-135 סל"ד.
    3. עקוב אחר הצמיחה כל 24 שעות עד שהתאים משיגים ~ 90% מוות תאי. ברגע שמגיעים לטווח זה, צנטריפוגו את תרחיף התא ב 500 x גרם למשך 10 דקות ואוספים את הסופרנאטנט המכיל את וירוס P1.
    4. סנן את הסופרנאטנט באמצעות סינון ואקום של 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים). שמור את המוצר המסונן בחושך ואחסן אותו ב 4 ° C. מוצר זה הוא כעת וירוס P1.
      הערה: טיטר וירוסים פוחת עם אחסון לטווח ארוך ב 4 ° C. שקול ליצור מלאי וירוסים טרי אם הוא מאוחסן במשך יותר מ-4 חודשים, או לחדש את מלאי הווירוסים לפני השימוש בביטוי34.
  5. ביטוי חלבון (60 -72 שעות בין תחילת הביטוי ואיסוף של גלולת התא ; איור 1E)
    1. הכינו תאי Sf9 לגידול בשלב היומן בריכוז של 2 x 106 תאים/מ"ל והוסיפו וירוס P1 ביחס של 12 מ"ל וירוס ל-300 מ"ל של השעיית תאים.
      הערה: תפוקת החלבון היא כ-1 מ"ג/ליטר. מומלץ להשתמש במינימום של 1.5 ליטר של תרחיף תאים לביטוי חלבון זה.
    2. תרבית את התאים בטמפרטורה של 27°C בשייקר אורביטלי במהירות 135 סל"ד למשך כ-60 שעות.
      הערה: ניתן לאסוף דגימות קטנות בנקודות זמן שונות ולנתח אותן באמצעות ג'ל SDS כדי להעריך את רמות ביטוי החלבון. בנוסף, אם החלבונים מאוחים עם תגים פלואורסצנטיים, ניתן להעריך את רמות הביטוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יש לקצור את התאים לא יאוחר מתחילת מוות תאי.
    3. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 3,735 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לגלול את התאים. ניתן לאחסן את הכדוריות בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף או לשמר אותן לאחסון לטווח ארוך. בדרך כלל אנו משתמשים בכדוריות תאים תוך שבועות, אך החלמנו חלבון פעיל מספר חודשים לאחר ההקפאה.
  6. טיהור חלבון (2 ימים ; איור 1F)
    הערה: יום 1 - מיצוי וטיהור חלבונים באמצעות כרומטוגרפיית זיקה FLAG. יום 2 - Aliquot והקפאת דגימות לאחר דיאליזה לילה. הפרוטוקול המתואר להלן הוא לטיהור מיוזין-7a מכדורי תא 1.5 ליטר.
    1. הכן מאגר ראשי המכיל 10 mM MOPS (pH 7.2), 500 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 מיקרוגרם / מ"ל leupeptin, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל פניל sulfonyl פלואוריד (PMSF). סנן אותו באמצעות מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר ואחסן את המאגר בטמפרטורה של 4°C (ראה טבלת חומרים).
      הערה: PMSF אינו יציב בתמיסות מימיות. הכינו את תמיסת מלאי PMSF כ-1 M באתנול 100% ואחסנו אותה בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים.
    2. הכינו 75 מ"ל של מאגר מיצוי על ידי השלמת המאגר הראשי עם 3 טבליות מעכבי פרוטאז ללא EDTA, 2 mM ATP ו-0.1 mM dithiothreitol (DTT; ראו טבלת חומרים).
    3. הוסף 75 מ"ל של חיץ מיצוי לגלולה בזמן שהיא עדיין קפואה. השאירו את הגלולה במאגר המיצוי על קרח עד שהיא מפשירה. השתמש פיפטה סרולוגית כדי לפרק את הגלולה כדי להאיץ את תהליך ההפשרה.
    4. בעזרת קצה של 1/2 אינץ' (13 מ"מ), הפעילו את המתלים על קרח למשך 10 דקות באמפליטודה של 50%, 5 שניות על, 5 שניות כבויות.
    5. צנטריפוגה את הליזט הכולל ב 33,746 x גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (75 °F). במהלך הצנטריפוגה, הכינו 1.5 מ"ל של שרף FLAG על ידי שטיפת 3 מ"ל של 50% שרף זיקה Anti-FLAG (ראה טבלת חומרים) עם 40 מ"ל של PBS. משחררים את השרף על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. הסר בזהירות את PBS מבלי להפריע לשרף.
    6. מוסיפים את הסופרנאטנט מצנטריפוגת הליזט לשרף השטוף ודגרים בסיבוב רציף ב-4°C למשך שעה אחת.
    7. משחררים את השרף על ידי צנטריפוגה במהירות 800 x גרם למשך 2 דקות ב-4°C. מבלי להפריע לשרף, הסירו את הסופרנטנט.
    8. השהה מחדש את השרף ב 40 מ"ל של חיץ ראשי וצנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 2 דקות ב 4 ° C. הסר בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לשרף. חזור על הכביסה 1x.
    9. מעבירים את השרף השטוף לשני עמודי ספין מפוליפרופילן (ראו טבלת חומרים). שטפו כל עמוד 1x עם 2 מ"ל של חיץ ראשי. הסר את המאגר הראשי על ידי צנטריפוגה של העמוד ב- 1,400 x גרם למשך 2 דקות ב- 4 ° C. השרף יהיה ארוז בתחתית.
    10. הכן מאגר Elution על-ידי הוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל של פפטיד FLAG (ראה טבלת חומרים) למאגר הראשי.
    11. הוסיפו 300 μL של Elution Buffer לשרף הארוז בכל עמודה, וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג כדי להבטיח שהשרף ירוויח לחלוטין על ידי מאגר Elution. תנו לשרף לדגור עם חיץ Elution על קרח במשך 10 דקות.
    12. צנטריפוגה את העמודים ב 1,400 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. מעבירים את הזרימה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי ושומרים אותו על קרח. זהו החלק הראשון.
    13. חזור על שלבים 1.6.11-1.6.12 כך שייאספו 4 שברים מכל עמודה.
    14. בצע אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE35 עם שברי elution כדי לקבוע את הריכוזים היחסיים שלהם. בזמן שהג'ל פועל, הכינו מאגר דיאליזה המכיל 500 mM NaCl, 10 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA ו-1 mM DTT.
    15. שלב את השברים המרוכזים ביותר. העבירו את הדגימה לקלטת דיאליזה MWCO 10K (ראו טבלת חומרים) ובצעו דיאליזה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. השתמש 1 L dialysis buffer עבור כ 500 μL של חלבון. בצע לפחות שלושה שינויים במאגר הדיאליזה.
      הערה: עמוד הספין ושיטת אלוציית הצנטריפוגות מאפשרות לדלל חלבונים בריכוזים גבוהים (0.5-1 מ"ג/מ"ל). בדרך כלל אין צורך בשלבי ריכוז נוספים. עם זאת, אם יש צורך בחלבונים מרוכזים יותר, יש להעמיס דגימות על צינורות ריכוז של 100,000 MWCO (ראו טבלת חומרים) וצנטריפוגות בטמפרטורה של 1,400 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. חזור על תהליך זה עד להשגת נפח תמיסת החלבון הרצויה.
    16. למחרת, פורקים בזהירות את הדגימה מקלטת הדיאליזה. Aliquot 15 μL לכל צינור PCR ולשחרר את הצינורות לתוך מיכל של חנקן נוזלי להקפאת הבזק. החלבונים הקפואים יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי (איור 3A).
      הערה: התפוקה של מיוזין-7a בשיטה זו היא בדרך כלל בין 0.5 ל -1 מ"ג / ליטר.

2. טיהור שרשראות האור RLC ו- CALML4 באמצעות מערכת E. coli His6-SUMO (7 ימים)

הערה: ימים 1-4 - שיבוט וטיהור הפלסמידים. יום 5 - טרנספורמציה חיידקית. ימים 6-7 - טיהור, הקפאה והקפאה של חלבונים סופיים.

  1. שכפל את cDNAs המקודדים RLC ו- CALML4 לווקטור pET-SUMO, המכיל רצף His6 לפני SUMO כדי לסייע בטיהור. בעת הצורך, ניתן לנתק את תחום His6-SUMO מחלבון ההיתוך באמצעות פרוטאז SENP226,36.
  2. עבור כל חלבון בשרשרת קלה, התמירו תאים מוכשרים BL21 E. coli (ראו טבלת חומרים) עם הפלסמיד והתחילו תרבית נוזלית של 5 מ"ל לילה עם התאים שעברו טרנספורמציה.
  3. למחרת, חסן את תרבית הלילה 5 מ"ל לתוך 1 ליטר של ציר לוריא-ברטאני (LB) המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין. אפשר לתרבית לגדול ב 37 ° C עם רעידות מתמשכות ב 270 סל"ד עד הצפיפות האופטית (O.D.) מגיע 0.6 - 1.0.
    הערה: ערך O.D. מכפיל את עצמו בערך כל 20 דקות ברגע שהוא מגיע ל- 0.2. עקוב אחר O.D. לעתים קרובות.
  4. להתחיל ביטוי חלבון על ידי הוספת 250 מיקרומטר איזופרופיל b-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לתרבית. יש לדגור במשך 3-5 שעות ב-37°C או 16°C למשך הלילה עם רעידות מתמשכות ב-270 סל"ד.
  5. גלול את E. coli על ידי צנטריפוגה של תרחיף התא ב 4,347 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
  6. הכינו חיץ מתלה המכיל 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 5 mM Imidazole ו-10% גליצרול, pH 7.4 (ראה טבלת חומרים). שמור על קרח.
  7. השהה מחדש את הגלולה ב 15-25 מ"ל של חיץ מתלה ולהעביר את המתלה לכד נקי, התאמת הנפח הכולל ל 35 מ"ל. הוסף DNase ו- RNase לתרחיף ביחס של 1:1000 (v/v) לקבלת ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל ו- 2 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה. יש להוסיף לתרחיף טבליה אחת ללא מעכבי פרוטאז, 4 mM 2-מרקפטואתנול ו-1% Triton X (ראו טבלת חומרים). שומרים על קרח במשך 20 דקות.
  8. סוניק את מתלה הגלולה במי קרח עם 1 שנייה דולקת, ו 1 s כבוי בסך הכל 1 דקה ב 100% משרעת. השאר את lysate הומוגני ב 4 °C עם סיבוב רציף במשך 2 שעות.
    הערה: התוספת של Triton X מסייעת בשכיבת התאים כהכנה לסוניקציה.
  9. צנטריפוגה את הליזטים ב 26,900 x גרם במשך 45 דקות ב 4 ° C. בזמן שזה קורה, התחילו להכין את שרף הקובלט (ראו טבלת חומרים). השתמש 500 μL של שרף קובלט עבור 1 ליטר של תרבית E. coli . שטפו את השרף פעמיים במים טהורים במיוחד ופעם אחת עם חיץ מתלה על ידי צנטריפוגה במהירות 4,347 x גרם למשך 2 דקות ב-4°C.
  10. לאחר צנטריפוגת ליזט, ערבבו את הסופרנאטנט עם השרף השטוף והתנדנדו בעדינות בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות.
  11. צנטריפוגה את מתלה שרף הליזט ב 4,347 x גרם למשך 2 דקות ב 4 ° C. השרף ייארז בתחתית הצינור. מבלי להפריע לשרף, הסירו את הסופרנטנט.
  12. שטפו את השרף עם חיץ מתלה על ידי צנטריפוגה במהירות 4,347 x גרם למשך 2 דקות ב-4°C. הסר את supernatant. יש לחזור על השטיפות עד שהסופרנאטנט חסר צבע.
  13. הכינו מאגר Elution המכיל 50 mM Tris HCl, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazole, 10% גליצרול, 4 mM 2-מרקפטואתנול ופרוטאז SENP2 0.25 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים). שמור אותו על קרח.
  14. יש להשהות מחדש את השרף ב-1 מ"ל של חיץ מתלה ולדגור עליו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם סיבוב רציף.
  15. למחרת, צנטריפוגה ב 4,347 x גרם במשך 2 דקות כדי לשגר את השרף. אספו את הסופרנטנט, המכיל את חלבון השרשרת הקלה השסוע ואת הפרוטאז.
  16. הוסף 1 מ"ל של חיץ Elution לשרף. חזור על הצנטריפוגה ואסף את הסופרנטנט.
  17. הסר את הפרוטאז על ידי כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC). בקצרה, הכינו את עמודת אי הכללת הגודל (ראו טבלת חומרים) עם מאגר המכיל 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10% גליצרול ו-5 mM DTT (pH 7.4). רכז את הסופרנאטנט ל- 500 μL באמצעות צינור ריכוז של 10,000 MWCO. טען את הדגימה המרוכזת על עמודה המחוברת למערכת כרומטוגרפיה אוטומטית באמצעות מזרק, זרם דרך עם חיץ המכיל 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10% גליצרול ו- 5 mM DTT (pH 7.4). עקוב אחר השברים שנאספו באמצעות ספקטרופוטומטריה אולטרה סגולה. אספו את שברי החלבונים בעלי משקל מולקולרי המתאים לשרשראות האור.
    הערה: ניתן להסיר את הפרוטאז גם באמצעות כרומטוגרפיית זיקה אם תג טיהור (למשל, תג GST) מהונדס לתוך הפרוטאז.
  18. הפעל ג'ל SDS-PAGE עם שברי האלוציה כדי לקבוע את הטוהר והריכוזים היחסיים של חלבוני שרשרת האור בכל שבר. השברים הרצויים הם אלה המכילים חלבוני שרשרת אור מרוכזים ללא פסי פרוטאז נראים לעין. שלב את שברי החלבון הרצויים ורכז אותם באמצעות צינור ריכוז35 של 10,000 MWCO.
  19. הבזק מקפיא aliquots של חלבון בחנקן נוזלי ומיד להעביר ל -80 ° C לאחסון לטווח ארוך (איור 3B).
    הערה: התפוקה של RLC ו-CALML4 באמצעות מערכת E. coli His6-SUMO היא כ-1-2 מ"ג/ליטר.

3. בדיקת גלישה של נימה אקטין מותאמת מיוזין-7A (3 שעות)

הערה: השיטות המשמשות בסעיף זה דומות לאלה המתוארות עבור מיוזין31 אחרים, כאשר השינויים העיקריים הם הדגירה והיישום של מיוזין בחיץ בעל חוזק יוני גבוה והמרווח הארוך הנדרש להשגת מדידה מדויקת של תזוזות מסגרת למסגרת.

  1. הכן 20 מיקרומטר אקטין נימי (F-actin) על ידי פילמור אקטין כדורי (G-actin) במאגר פילמור (50 mM KCl, 25 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7.0)) ב 4 ° C למשך הלילה. יש לסמן F-אקטין על ידי הוספת עודפי רודמין-פאלואדין טוחנים 1.2x (ראו טבלת חומרים). מכסים ברדיד אלומיניום ודגרים על קרח למשך שעתיים לפחות.
    הערה: ניתן לרכוש G-actin מספקים מסחריים (ראה טבלת חומרים) או מטוהר מאבקת אצטון שריר ארנב31,37. ניתן לאחסן F-אקטין בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים בריכוז זה.
  2. הכינו תא זרימה כמתואר לעיל31. בקצרה, הניחו שתי רצועות של סרט דו-צדדי במרחק של 2-3 מ"מ זו מזו על שקופית מיקרוסקופ מנוקה ומטופלת בניטרוצלולוז (ראו טבלת חומרים). הניחו את צד הניטרוצלולוז על הרצועות, וצרו תא זרימה בנפח משוער של 10 μL (איור 4).
  3. ביצוע בדיקת גלישה של נימה אקטין
    1. לתא הזרימה, הוסף נפח תא אחד של 0.2 מ"ג/מ"ל חלבון מיוזין-7a אנושי מטוהר במאגר תנועתיות NaCl של 500 מילימטר (500 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA (pH 7.4)). מניחים לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: חיוני להוסיף מיוזין-7a במאגר מלח גבוה מכיוון שזה משחרר את המצב המעוכב העצמי ומאפשר למיוזין-7a להיצמד לפני השטח בקונפורמציה המופעלת.
    2. שטפו את תא הזרימה בנפחים תלת-קאמריים של 1 מ"ג/מ"ל BSA (ראו טבלת חומרים) ב-150 mM NaCl Motility Buffer (150 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)) ומשכו את הנוזל באמצעות מגבון נקי בשקע כדי לספוג עודפי נוזלים. יש לדגור במשך דקה לאחר השטיפההשלישית .
    3. זרימה בנפח תא אחד של 10 ננומטר רודאמין פלואידין המסומן F-actin ב 150 mM NaCl Motility Buffer דרך תא הזרימה. עקוב אחר קשירת חוטי אקטין לפני השטח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרה של 100x. צפיפות חוטי האקטין צריכה להיות אופטימלית (איור 5A), מה שמבטיח מספיק חוטים בשדה הראייה למעקב, אך דליל מספיק כדי למנוע חפיפה של חוטים מרובים, מה שמקשה על המעקב.
    4. שטפו את תא הזרימה עם נפחים תלת-קאמריים של 150 mM NaCl Motility Buffer כדי להסיר חוטי אקטין לא קשורים ועודפי רודאמין-פאלואדין.
    5. התחל את התנועתיות על ידי הוספת נפח תא אחד של המאגר הסופי (200 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 50 mM DTT, 2 mM ATP, 2.5 מ"ג / מ"ל גלוקוז, 100 מיקרוגרם / מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 2 μM RLC, 2 μM CaM, 2 μM CALML4).
    6. הקלט תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות עירור של 561 ננומטר כדי להמחיש אקטין המסומן ברודמין פאלואדין. מצאו אזור בשקופית עם צפיפות האקטין הרצויה (איור 5A) ולכדו תמונות כל 30 שניות במשך 30 דקות.
      הערה: המהירות של מיוזין-7a של יונקים היא בערך 5 ננומטר לשנייה. בעת קביעת קצב הפריימים לרכישה, חשוב לוודא שהתזוזות של החוטים בין מסגרות ארוכות מספיק (יותר מפיקסל אחד) כדי לאפשר מעקב מדויק. תנועות תת-פיקסלים בין מסגרות עלולות לגרום להערכת יתר של המהירות. קצב המסגרות של 30 שניות מאפשר לחוטי האקטין לנוע כ -150 ננומטר בין מסגרות, המקביל ליותר משני פיקסלים במיקרוסקופ. עם זאת, יש להקפיד כי ניתן לראות עקירה משמעותית במיקרוסקופ בו משתמשים. אם זמין, ניתן להשתמש בהקלטה מרובת מיקומים כדי לאסוף בו זמנית מספר שדות ראייה לניתוח.
  4. ניתוח התנועה של חוטי אקטין באמצעות תוכנית FAST (מותקן על Mac)38.
    הערה: תוכנית FAST המשמשת כאן היא רק אפשרות אחת מני רבות לכימות תנועת חוט להט. בחרנו להשתמש ב-FAST מכיוון שהוא אוטומטי, מהיר ואינו דורש תוכנה בתשלום. אפשרויות אחרות כוללות אלגוריתמים מבוססי MATLAB כגון FIESTA, שיטות מבוססות ImageJ/FIJI כגון MTrack2 ומעקב ידני, ושיטות מבוססות Python כגון Philament39.
    1. הורד והתקן את התוכנית FAST (github.com/NeilBillington/FASTrack3 - python3 גרסה תואמת עם מודול נוסף עבור. המרת קובץ ND2. הערה: גרסת python2 מקורית ניתן למצוא בכתובת github.com/turalaksel/FASTrack).
    2. הפעל את התוכנית FAST כמתואר ב-38 באמצעות ערך סובלנות של 33 כדי לשמור על חוטים נעים חלקים בלבד.
      הערה: אם התמונות מכילות סחף לבעיות מכניות עם הבמה או מאיסוף מספר סדרות במקביל, יש לייצב תחילה את הסרטים. לשם כך, אנו ממליצים על תוסף FIJI Image Stabilizer, הזמין להורדה בכתובת הבאה - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
    3. השתמש בתוכנית FAST כדי לנתח את התמונות החדשות שנוצרו .tif על-ידי הגדרת הערכים -xmax ו- -ymax. אלה קובעים את הפרמטרים עבור פלט תרשים הפיזור על ידי התוכנית ומייצגים את אורך חוט הלהט הארוך ביותר (בננומטר) ואת מהירות הנימה המרבית (בננומטר לשנייה). בדוגמה זו השתמשנו ב- 20,000 ננומטר עבור -xmax וב- 20 ננומטר לשנייה עבור -ymax כדי להבטיח שכל הנתונים נלכדים (איור 5D).
    4. השתמש ב- -px כדי להגדיר את גודל הפיקסלים של התמונה שנרכשה, שכאן יהיה 65 ננומטר, וב- -minv כדי להגדיר את המהירות המינימלית (בננומטר לשנייה) הנדרשת מחוט להט להכללה בניתוח. עבור המהירות הנמוכה של מיוזין-7a בדוגמה זו, השתמש ב- 0.1 ננומטר לשנייה.
    5. השתמש ב- -maxd כדי להגדיר את המרחק המרבי המותר בין מסגרות לקישור חוטים. הגדרה זו מוגדרת כדי למנוע קישור חוטים נפרדים בין מסגרות ובדוגמה זו, אנו משתמשים בברירת המחדל של 2000 nm.
    6. Use-pt כדי להגדיר את הסיבולת לתנודות במהירויות חוט הלהט ולכלול רק חוטים עם תנועות חלקות. דוגמה זו משתמשת בסף סובלנות של 33%. משמעות הדבר היא כי חוטים עם סטיית תקן מהירות גדולה מ -33% מממוצע המהירות לא ייכללו בניתוח נוסף.
    7. לבסוף, השתמש ב- -d כדי לציין את התיקיה המכילה את ערימות .tif לניתוח. מחרוזת הפקודה כולה עם הפרמטרים והערכים הנתונים תהיה: מהיר -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [שם תיקיה המכילה סרטים].
      הערה: תוכנית FAST תפיק תרשימי פיזור (איור 5D) עם הנתונים הגולמיים המשויכים אליהם, שניתן לחלץ לצורך ניתוח והדמיה בתוכניות אחרות (איור 5C). הוא גם יפיק תרשים של נתיבי החוטים המסומנים (איור 5B), שבו יש להשתמש כדי לוודא שהמעקב פועל כצפוי. דוגמאות של מגרשים ותצוגות חזותיות אפשריות אחרות של נתונים כלולות להלן.

תוצאות

ניתן להעריך את קומפלקס מיוזין-7a המטוהר ואת חלבוני שרשרת האור באמצעות אלקטרופורזה בג'ל SDS-PAGE, כפי שמוצג באיור 3. הרצועה מעל סמן 200 kDa מתאימה לשרשרת הכבדה myosin-7a (255 kDa). שלושת הפסים הנודדים בין סמני 22 ו-14 kDa מלמעלה למטה הם RLC (20 kDa), קלמודולין ו-CALML4, בהתאמה. בעוד שלקלמ...

Discussion

מוצג כאן פרוטוקול מפורט לייצור חלבון רקומביננטי אנושי מיוזין-7a מתאי חרקים. למרות שמערכת Sf9/baculovirus שימשה לייצור מגוון של מיוזין 40,41,42,43, רק לאחרונה המיוזין-7a של היונקים טוהר בהצלחה באמצעות מערכת MultiBac baculovirus14.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

אנו מודים למתקן הדמיה מיקרוסקופית וליבת תפקוד חזותי ומורפולוגיה באוניברסיטת מערב וירג'יניה על הדיון והעזרה בניתוח תמונה. עבודה זו נתמכת על ידי קרנות סטארט-אפ במסלול קביעות מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מערב וירג'יניה ועד R.L. עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (NIGMS) המרכז למצוינות במחקר ביו-רפואי (Vs-CoBRE) (P20GM144230), ורשת NIGMS מערב וירג'יניה למצוינות במחקר ביו-רפואי (WV-INBRE) (P20GM103434).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL microcentrifuge tubesVWR87003-294
1X FLAG PeptideGenScriptN/ACustom peptide synthesis
22x22mm No. 1.5 coverslipsVWR48366-227
250 mL Conical Centrifuge TubesNunc376814
250 mL Vented Erlenmyer Shaker FlaskIntelixBioDBJ-SF250VP
2-MercaptoethanolVWRM131
75x25x1 mm Vistavision microscope slidesVWR16004-42
Actin Protein (>99% Pure)CytoskeletonAKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220
ATPMillipore SigmaA7699
ATPMillipore SigmaA7699
Bio-Spin Disposable Chromatography ColumnBio-Rad732-6008
BL21 Competent E. coliNew England BiolabsC2530H
Bluo-GalThermo Fisher15519028
Bovine Serum AlbuminMillipore Sigma5470
BstXI EnzymeNew England BiolabsR0113S
CalmodulinMillipore Sigma208694
CatalaseMillipore SigmaC40
Champion pET-SUMO Expression SystemThermo FisherK30001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche Diagnostics5056489001
Cutsmart BufferNew England BiolabsB6004S
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DNase I, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-610-304
Double-Sided TapeOffice Depot909955
EGTA, Molecular Biology GradeMillipore Sigma324626-25GM
EGTA, Molecular Biology GradeMillipore Sigma324626-25GM
EthanolThermo FisherBP2818
ExpiFectamine Sf Transfection ReagentGibcoA38915
FAST programhttp://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements; 
Fisherbrand Model 505 Sonic DismembratorFisher ScientificFB505110
Gentamicin Reagent SolutionGibco15710-06410 mg/mL in distilled water
GlucoseMillipore SigmaG5767
Glucose OxidaseMillipore SigmaG2133
GlycerolInvitrogen15514-011
HisPur Cobalt ResinThermo Fisher89966
I-CeuI EnzymeNew England BiolabsR0699S
Image Stabilizer Pluginhttps://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
ImidazoleMillipore SigmaI2399
In-Fusion Snap Assembly Master MixTaKaRa638948
IPTGThermo Fisher15529019
IsopropanolFisher ScientificA451SK
KanamycinFisher ScientificAAJ67354AD
Large Orifice Pipet TipsFisher Scientific02-707-1341-200uL
LB Agar, Ready-Made PowderThermo FisherJ75851-A1
Leupeptin Protease InhibitorThermo Fisher78435
Magnesium chlorideThermo FisherJ61014.=E1M
Magnesium chlorideThermo FisherJ61014.=E1M
Max Efficiency DH10Bac Competent CellsGibco10361012
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
MicroscopeNikonModel: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective
Microscope CameraORCA-Fusion BT
Microscope Laser UnitAndor iXon Ultra
Miller's LB BrothCorning46-050-CM
MOPSMillipore SigmaM3183
MOPSMillipore SigmaM3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo FisherND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo FisherND-ONE-W
NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)New England BiolabsC2987H
NEBuffer r3.1New England BiolabsB6003S
NIS ElementsNikon
NIS-ElementsNikon
NitrocelluloseLADD Research Industries53152
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco31985070
pACEBac1 VectorGeneva Biotech
ParafilmMillipore SigmaP7793
PMSFMillipore Sigma78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)Invitrogen12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)QIAGEN28104
Quick CIPNew England BiolabsM0525S
Rhodamine phalloidinInvitrogenR415
S.O.C. MediumInvitrogen15544034
SENP2 proteasePMID:17591783Purified in the lab
Sf9 cellsThermo Fisher11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media CompleteGibco12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mLThermo FisherA52971
Sodium chlorideMillipore SigmaS7653
Sodium chlorideMillipore SigmaS7653
Stericup Quick Release Vacuum Driven Disposable Filtration SystemMillipore SigmaS2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATPNew England BiolabsB0202A
Tetracycline HydrochlorideMillipore SigmaT7660-5G
TrisMillipore Sigma10708976001
Triton XAmerican Bioanalytical9002-93-1

References

  1. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. J Cell Sci. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  2. Sellers, J. R. Myosins: a diverse superfamily. Biochim Biophys Acta. 1496 (1), 3-22 (2000).
  3. Titus, M. A. Myosin-driven intracellular transport. Cold Spring Harb Perspect Biol. 10 (3), a021972 (2018).
  4. Quintanilla, M. A., Hammer, J. A., Beach, J. R. Non-muscle myosin 2 at a glance. J Cell Sci. 136 (5), jcs.260890 (2023).
  5. Peckham, M. Coiled coils and SAH domains in cytoskeletal molecular motors. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1142-1148 (2011).
  6. Batters, C., Veigel, C., Homsher, E., Sellers, J. R. To understand muscle you must take it apart. Front Physiol. 5, 90 (2014).
  7. Friedman, T. B., Sellers, J. R., Avraham, K. B. Unconventional myosins and the genetics of hearing loss. Am J Med Genet. 89 (3), 147-157 (1999).
  8. Geeves, M. A., Holmes, K. C. The molecular mechanism of muscle contraction. Adv Protein Chem. 71, 161-193 (2005).
  9. Batters, C., Veigel, C. Mechanics and activation of unconventional myosins. Traffic. 17 (8), 860-871 (2016).
  10. Houdusse, A., Sweeney, H. L. How myosin generates force on actin filaments. Trends Biochem Sci. 41 (12), 989-997 (2016).
  11. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biol. 8 (9), R196 (2007).
  12. Moreland, Z. G., Bird, J. E. Myosin motors in sensory hair bundle assembly. Curr Opin Cell Biol. 79, 102132 (2022).
  13. Williams, D. S., Lopes, V. S. The many different cellular functions of MYO7A in the retina. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1207-1210 (2011).
  14. Hollo, A., et al. Molecular regulatory mechanism of human myosin-7a. J Biol Chem. 299 (10), 105243 (2023).
  15. Choi, M. S., et al. The small EF-hand protein CALML4 functions as a critical myosin light chain within the intermicrovillar adhesion complex. J Biol Chem. 295 (28), 9281-9296 (2020).
  16. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nat Commun. 7, 10833 (2016).
  17. Whatley, M., et al. Usher syndrome: Genetics and molecular links of hearing loss and directions for therapy. Front Genet. 11, 565216 (2020).
  18. Ahmed, Z. M., et al. USH1H, a novel locus for type I Usher syndrome, maps to chromosome 15q22-23. Clin Genet. 75 (1), 86-91 (2009).
  19. Liu, X., Ondek, B., Williams, D. S. Mutant myosin VIIa causes defective melanosome distribution in the RPE of shaker-1 mice. Nat Genet. 19 (2), 117-118 (1998).
  20. Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
  21. Houdusse, A., Titus, M. A. The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia. Curr Biol. 31 (10), R586-R602 (2021).
  22. Schwander, M., Kachar, B., Muller, U. Review series: The cell biology of hearing. J Cell Biol. 190 (1), 9-20 (2010).
  23. Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
  24. Fitzgerald, D. J., et al. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
  25. Sari, D., et al. The MultiBac baculovirus/insect cell expression vector system for producing complex protein biologics. Adv Exp Med Biol. 896, 199-215 (2016).
  26. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin-7 outperforms synaptotagmin-1 to promote the formation of large, stable fusion pores via robust membrane penetration. Nat Commun. 14 (1), 7761 (2023).
  27. Courtney, K. C., et al. The complexin C-terminal amphipathic helix stabilizes the fusion pore open state by sculpting membranes. Nat Struct Mol Biol. 29 (2), 97-107 (2022).
  28. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin 1 oligomerization via the juxtamembrane linker regulates spontaneous and evoked neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (48), e2113859118 (2021).
  29. Yu, I. M., et al. Myosin 7 and its adaptors link cadherins to actin. Nat Commun. 8, 15864 (2017).
  30. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  31. Sellers, J. R. In vitro motility assay to study translocation of actin by myosin. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, 13.2 (2001).
  32. Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-specific adaptations of in vitro fluorescence microscopy-based motility assays. J Vis Exp. (168), e62180 (2021).
  33. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  34. Jorio, H., Tran, R., Kamen, A. Stability of serum-free and purified baculovirus stocks under various storage conditions. Biotechnol Prog. 22 (1), 319-325 (2006).
  35. JoVE Science Education Database. Separating protein with SDS-PAGE. Basic methods in cellular and molecular biology. , (2023).
  36. Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. J Biol Chem. 282 (36), 26217-26224 (2007).
  37. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods Enzymol. 85 Pt B, 164-181 (1982).
  38. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Rep. 11 (6), 910-920 (2015).
  39. Bowser, R. M., Farman, G. P., Gregorio, C. C. Philament: A filament tracking program to quickly and accurately analyze in vitro motility assays. Biophys Rep. 4 (1), 100147 (2024).
  40. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  41. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. J Biol Chem. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  42. Billington, N., et al. Myosin 18A coassembles with nonmuscle myosin 2 to form mixed bipolar filaments. Curr Biol. 25 (7), 942-948 (2015).
  43. Lu, W., et al. Competition between kinesin-1 and myosin-V defines Drosophila posterior determination. Elife. 9, 54216 (2020).
  44. Liu, R., et al. A binding protein regulates myosin-7a dimerization and actin bundle assembly. Nat Commun. 12 (1), 563 (2021).
  45. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Myosin light chains: Teaching old dogs new tricks. Bioarchitecture. 4 (6), 169-188 (2014).
  46. Belyaev, A. S., Hails, R. S., Roy, P. High-level expression of five foreign genes by a single recombinant baculovirus. Gene. 156 (2), 229-233 (1995).
  47. Li, J., et al. Ca(2+)-induced rigidity change of the myosin VIIa IQ motif-single alpha helix lever arm extension. Structure. 25 (4), 579-591.e4 (2017).
  48. Persson, M., Bengtsson, E., ten Siethoff, L., Mansson, A. Nonlinear cross-bridge elasticity and post-power-stroke events in fast skeletal muscle actomyosin. Biophys J. 105 (8), 1871-1881 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

2107aactin motor14

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved