MultiBac-Systembasierte Aufreinigung und biophysikalische Charakterisierung von humanem Myosin-7a

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur rekombinanten Herstellung des humanen Myosin-7a-Holoenzyms unter Verwendung des MultiBac-Baculovirus-Systems und zur Untersuchung seiner Motilität unter Verwendung eines maßgeschneiderten In-vitro-Filament-Gliding-Assays.

Zusammenfassung

Myosin-7a ist ein auf Aktin basierendes Motorprotein, das für auditive und visuelle Prozesse unerlässlich ist. Mutationen in Myosin-7a führen zum Usher-Syndrom Typ 1, der häufigsten und schwersten Form der Taubblindheit beim Menschen. Es wird angenommen, dass Myosin-7a mit anderen Usher-Proteinen einen Transmembran-Adhäsionskomplex bildet, der für die strukturell-funktionelle Integrität von Photorezeptor- und Cochlea-Haarzellen essentiell ist. Aufgrund der Herausforderungen bei der Gewinnung von reinem, intaktem Protein sind die genauen Funktionsmechanismen von humanem Myosin-7a jedoch nach wie vor schwer fassbar, da nur begrenzte strukturelle und biomechanische Studien verfügbar sind. Neuere Studien haben gezeigt, dass Myosin-7a bei Säugetieren ein multimerer Motorkomplex ist, der aus einer schweren Kette und drei Arten von leichten Ketten besteht: regulatorische leichte Kette (RLC), Calmodulin und Calmodulin-ähnliches Protein 4 (CALML4). Im Gegensatz zu Calmodulin bindet CALML4 nicht an Calciumionen. Sowohl die kalziumempfindlichen als auch die unempfindlichen Calmoduline sind für das Myosin-7a von Säugetieren entscheidend für die richtige Feinabstimmung seiner mechanischen Eigenschaften. Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Herstellung von rekombinanten humanen Myosin-7a-Holoenzymen unter Verwendung des MultiBac Baculovirus-Proteinexpressionssystems. Dies ergibt Milligrammmengen an hochreinem Protein in voller Länge, was seine biochemische und biophysikalische Charakterisierung ermöglicht. Darüber hinaus stellen wir ein Protokoll zur Bewertung seiner mechanischen und beweglichen Eigenschaften mit Hilfe von maßgeschneiderten in vitro Motilitätsassays und Fluoreszenzmikroskopie vor. Die Verfügbarkeit des intakten humanen Myosin-7a-Proteins sowie das hier beschriebene detaillierte funktionelle Charakterisierungsprotokoll ebnen den Weg für weitere Untersuchungen der molekularen Aspekte von Myosin-7a im Sehen und Hören.

Einleitung

Myosine sind molekulare Motorproteine, die mit Aktin interagieren, um zahlreiche zelluläre Prozesse anzutreiben 1,2,3,4. Der Mensch besitzt 12 Klassen und 39 Myosin-Gene⁵, die an einer Vielzahl physiologischer Funktionen beteiligt sind, wie z. B. der Muskelkontraktion⁶ und sensorischen Prozessen⁷. Jedes Myosinmolekül ist ein multimerer Komplex, der aus einer schweren Kette und leichten Ketten besteht. Die schwere Kette ist in Kopf-, Hal....

Protokoll

HINWEIS: Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Synthese des intakten humanen Myosin-7a-Holoenzyms und zur Charakterisierung seiner Motilität in vitro. Dieses Protokoll ist in drei Abschnitte unterteilt: erstens die Expression des humanen Myosin-7a unter Verwendung des MultiBac-Baculovirus-Proteinexpressionssystems; Zweitens, getrennte Reinigung von Myosin-7a-Leichtketten unter Verwendung des E.coli His6-SUMO-Systems; und schließlich die Untersuchung der Motilität von humanem Myosin-7a mit dem Aktin-Filament-Gleittest.

1. MultiBac-Systembasierte Myosin-7a-Komplexproduktion

Diskussion

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von rekombinantem humanem Myosin-7a-Protein aus Insektenzellen vorgestellt. Obwohl das Sf9/Baculovirus-System zur Herstellung einer Vielzahl von Myosinen verwendet wurde 40,41,42,43, wurde das Säugetier-Myosin-7a erst vor kurzem erfolgreich mit dem MultiBac-Baculovirus-System ^{gereinig.......}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
1X FLAG Peptide	GenScript	N/A	Custom peptide synthesis
22x22mm No. 1.5 coverslips	VWR	48366-227
250 mL Conical Centrifuge Tubes	Nunc	376814
250 mL Vented Erlenmyer Shaker Flask	IntelixBio	DBJ-SF250VP
2-Mercaptoethanol	VWR	M131
75x25x1 mm Vistavision microscope slides	VWR	16004-42
Actin Protein (>99% Pure)	Cytoskeleton	AKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220
ATP	Millipore Sigma	A7699
ATP	Millipore Sigma	A7699
Bio-Spin Disposable Chromatography Column	Bio-Rad	732-6008
BL21 Competent E. coli	New England Biolabs	C2530H
Bluo-Gal	Thermo Fisher	15519028
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	5470
BstXI Enzyme	New England Biolabs	R0113S
Calmodulin	Millipore Sigma	208694
Catalase	Millipore Sigma	C40
Champion pET-SUMO Expression System	Thermo Fisher	K30001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche Diagnostics	5056489001
Cutsmart Buffer	New England Biolabs	B6004S
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DNase I, Spectrum Chemical	Fisher Scientific	18-610-304
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
Ethanol	Thermo Fisher	BP2818
ExpiFectamine Sf Transfection Reagent	Gibco	A38915
FAST program	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements;
Fisherbrand Model 505 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB505110
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-064	10 mg/mL in distilled water
Glucose	Millipore Sigma	G5767
Glucose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Glycerol	Invitrogen	15514-011
HisPur Cobalt Resin	Thermo Fisher	89966
I-CeuI Enzyme	New England Biolabs	R0699S
Image Stabilizer Plugin	https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
Imidazole	Millipore Sigma	I2399
In-Fusion Snap Assembly Master Mix	TaKaRa	638948
IPTG	Thermo Fisher	15529019
Isopropanol	Fisher Scientific	A451SK
Kanamycin	Fisher Scientific	AAJ67354AD
Large Orifice Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-134	1-200uL
LB Agar, Ready-Made Powder	Thermo Fisher	J75851-A1
Leupeptin Protease Inhibitor	Thermo Fisher	78435
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells	Gibco	10361012
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microscope	Nikon	Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective
Microscope Camera	ORCA-Fusion BT
Microscope Laser Unit	Andor iXon Ultra
Miller's LB Broth	Corning	46-050-CM
MOPS	Millipore Sigma	M3183
MOPS	Millipore Sigma	M3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)	New England Biolabs	C2987H
NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B6003S
NIS Elements	Nikon
NIS-Elements	Nikon
Nitrocellulose	LADD Research Industries	53152
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
pACEBac1 Vector	Geneva Biotech
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
PMSF	Millipore Sigma	78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)	Invitrogen	12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	QIAGEN	28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)	QIAGEN	28104
Quick CIP	New England Biolabs	M0525S
Rhodamine phalloidin	Invitrogen	R415
S.O.C. Medium	Invitrogen	15544034
SENP2 protease		PMID:17591783	Purified in the lab
Sf9 cells	Thermo Fisher	11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media Complete	Gibco	12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mL	Thermo Fisher	A52971
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Stericup Quick Release Vacuum Driven Disposable Filtration System	Millipore Sigma	S2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GL	Cytiva	29148721
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATP	New England Biolabs	B0202A
Tetracycline Hydrochloride	Millipore Sigma	T7660-5G
Tris	Millipore Sigma	10708976001
Triton X	American Bioanalytical	9002-93-1