MultiBac-Systembasierte Aufreinigung und biophysikalische Charakterisierung von humanem Myosin-7a

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur rekombinanten Herstellung des humanen Myosin-7a-Holoenzyms unter Verwendung des MultiBac-Baculovirus-Systems und zur Untersuchung seiner Motilität unter Verwendung eines maßgeschneiderten In-vitro-Filament-Gliding-Assays.

Zusammenfassung

Myosin-7a ist ein auf Aktin basierendes Motorprotein, das für auditive und visuelle Prozesse unerlässlich ist. Mutationen in Myosin-7a führen zum Usher-Syndrom Typ 1, der häufigsten und schwersten Form der Taubblindheit beim Menschen. Es wird angenommen, dass Myosin-7a mit anderen Usher-Proteinen einen Transmembran-Adhäsionskomplex bildet, der für die strukturell-funktionelle Integrität von Photorezeptor- und Cochlea-Haarzellen essentiell ist. Aufgrund der Herausforderungen bei der Gewinnung von reinem, intaktem Protein sind die genauen Funktionsmechanismen von humanem Myosin-7a jedoch nach wie vor schwer fassbar, da nur begrenzte strukturelle und biomechanische Studien verfügbar sind. Neuere Studien haben gezeigt, dass Myosin-7a bei Säugetieren ein multimerer Motorkomplex ist, der aus einer schweren Kette und drei Arten von leichten Ketten besteht: regulatorische leichte Kette (RLC), Calmodulin und Calmodulin-ähnliches Protein 4 (CALML4). Im Gegensatz zu Calmodulin bindet CALML4 nicht an Calciumionen. Sowohl die kalziumempfindlichen als auch die unempfindlichen Calmoduline sind für das Myosin-7a von Säugetieren entscheidend für die richtige Feinabstimmung seiner mechanischen Eigenschaften. Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Herstellung von rekombinanten humanen Myosin-7a-Holoenzymen unter Verwendung des MultiBac Baculovirus-Proteinexpressionssystems. Dies ergibt Milligrammmengen an hochreinem Protein in voller Länge, was seine biochemische und biophysikalische Charakterisierung ermöglicht. Darüber hinaus stellen wir ein Protokoll zur Bewertung seiner mechanischen und beweglichen Eigenschaften mit Hilfe von maßgeschneiderten in vitro Motilitätsassays und Fluoreszenzmikroskopie vor. Die Verfügbarkeit des intakten humanen Myosin-7a-Proteins sowie das hier beschriebene detaillierte funktionelle Charakterisierungsprotokoll ebnen den Weg für weitere Untersuchungen der molekularen Aspekte von Myosin-7a im Sehen und Hören.

Einleitung

Myosine sind molekulare Motorproteine, die mit Aktin interagieren, um zahlreiche zelluläre Prozesse anzutreiben 1,2,3,4. Der Mensch besitzt 12 Klassen und 39 Myosin-Gene⁵, die an einer Vielzahl physiologischer Funktionen beteiligt sind, wie z. B. der Muskelkontraktion⁶ und sensorischen Prozessen⁷. Jedes Myosinmolekül ist ein multimerer Komplex, der aus einer schweren Kette und leichten Ketten besteht. Die schwere Kette ist in Kopf-, Hals- und Schwanzbereich unterteilt. Der Kopf enthält Aktin- und Nukleotid-Bindungsstellen, die für die ATP-Hydrolyse und die Erzeugung von Kraft auf Aktinfilamente^{verantwortlich sind 2}. Den Hals bilden mehrere α-helikale IQ-Motive, an die ein bestimmter Satz von Lichtketten gebunden ist. Zusammen fungieren sie als Hebelarm, um die Konformationsänderungen des Motors zu großen Bewegungen zu verstärken ^8,9,10. Der Schwanz enthält klassenspezifische Subdomänen und spielt eine regulatorische Rolle bei der Abstimmung der motorischen Aktivität von Myosin und der Vermittlung von Interaktionen mit zellulären Bindungspartnern ^2,11.

Humanes Myosin-7a, ein Mitglied der Myosine der Klasse 7, ist essentiell für auditive und visuelle Prozesse ^12,13. Die IQ-Motive von humanem Myosin-7a sind mit einer einzigartigen Kombination von Leichtketten assoziiert, einschließlich der regulatorischen Leichtkette (RLC), Calmodulin und Calmodulin-like Protein 4 (CALML4)14,15,16. Neben der Stabilisierung des Hebelarms regulieren diese leichten Ketten die mechanischen Eigenschaften von Myosin-7a als Reaktion auf den Kalzium-Signalweg, eine Eigenschaft, die nur für die Säugetier-Isoform¹⁴ zu gelten scheint.

Defekte im Gen, das für die Myosin-7a-Schwerkette (MYO7A/USH1B) kodiert, sind für das Usher-Syndrom Typ 1 verantwortlich, die schwerste Form des kombinierten Seh- und Hörverlusts beim Menschen¹⁷. Darüber hinaus gehört das Leichtketten-Gen CALML4 zu den Kandidatengenen, die das ursächliche Allel für USH1H, eine weitere Variante des Typ-1-Usher-Syndroms, enthalten^15,18. In der Netzhaut wird Myosin-7a im retinalen Pigmentepithel und in den Photorezeptorzellen^{exprimiert 13}. Es wurde mit der Lokalisation von Melanosomen im retinalen Pigmentepithel (RPE)¹⁹ und der Phagozytose von Photorezeptorscheiben des äußeren Segments durch die RPE-Zellen in Verbindung gebracht²⁰. Im Innenohr kommt Myosin-7a hauptsächlich in den Stereozilien vor, wo es eine entscheidende Rolle bei der Etablierung von Haarbündeln und bei der Steuerung des mechanoelektrischen Transduktionsprozesses spielt 12,21,22.

Während die Bedeutung von Myosin-7a in Sinneszellen gut bekannt ist, sind seine Funktionsmechanismen auf molekularer Ebene noch wenig verstanden. Diese Wissenslücke ist zum Teil auf die Herausforderungen bei der Reinigung des intakten Proteins, insbesondere der Säugetier-Isoform, zurückzuführen. In jüngster Zeit wurden erhebliche Fortschritte bei der Verwendung des MultiBac-Systems zur rekombinanten Expression des vollständigen humanen Myosin-7a-Holoenzyms¹⁴ erzielt. Dieser Fortschritt hat strukturelle und biophysikalische Charakterisierungen dieses Motorproteins ermöglicht, was zur Entdeckung mehrerer einzigartiger Eigenschaften von humanem Myosin-7a führte, die speziell für die Hörfunktionen von Säugetieren angepasst sind^14,23.

Das MultiBac-System ist eine fortschrittliche Baculovirus/Insektenzell-Plattform, die speziell für die Expression eukaryotischer multimerer Komplexe entwickelt wurde ^24,25. Ein Hauptmerkmal dieses Systems ist seine Fähigkeit, mehrere Genexpressionskassetten, die jeweils für eine Untereinheit des Komplexes kodieren, in einem einzigen MultiBac-Baculovirus zu beherbergen. Der Aufbau der Multigen-Expressionskassetten wird durch ein sogenanntes Multiplikationsmodul erleichtert: eine Homing-Endonuklease (HE)-Stelle und eine passend gestaltete BstXI-Stelle, die die multiplen Klonierungsstellen (MCS) flankiert. Dieses Modul ermöglicht die iterative Assemblierung einer einzelnen Expressionskassette durch Restriktion/Ligation, wobei die Tatsache genutzt wird, dass die HE- und BstXI-Restriktionsstellen bei ihrer Ligation eliminiert werden. In dieser Arbeit werden humane Myosin-7a-Schwerketten, RLC, Calmodulin und CALML4 jeweils in das Multiplikationsmodul innerhalb des pACEBac1-Vektors kloniert (Abbildung 1A), die dann durch den iterativen Prozess zu einer Multigenexpressionskassette zusammengesetzt werden (Abbildung 1B). Die Myosin-7a-Multigenkassette wird durch die Transposition des mini-Tn7-Elements vom pACEBac1-Vektor zur mini-attTn7-Zielstelle im Genom in das bakulovirale Genom (Bacmid) integriert (Abbildung 1C). Nach Verfahren zur Bacmid-Aufreinigung, Baculovirus-Produktion und Amplifikation (Abbildung 1D,E) wird das rekombinante Myosin-7a-MultiBac-Baculovirus hergestellt und kann für die Proteinproduktion in großem Maßstab verwendet werden (Abbildung 1F). Zusätzlich können die Myosin-7a-Leichtketten separat in E. coli hergestellt und mit einem spaltbaren His6-SUMO-Tag 26,27,28 gereinigt werden. Die gereinigten Leichtketten sind nützlich, um ihre Bindungsdynamik und Regulation von Myosin-7a zu untersuchen.

Das gereinigte Myosin-7a-Protein kann strukturellen, biochemischen und biophysikalischen Studien unterzogen werden, um Einblicke in die strukturell-funktionelle Regulation dieses Motorproteins zu gewinnen. Darüber hinaus können seine Wechselwirkungen mit dem Aktinnetzwerk und anderen Bindungsproteinen²⁹ mit einer Vielzahl von in vitro Rekonstitutionsansätzen untersucht werden. Die Erkenntnisse aus diesen Analysen werden die biophysikalischen Eigenschaften dieses Myosins beeinflussen und zu einem mechanistischen Verständnis führen, wie Myosin-7a die Veränderungen des Zytoskeletts antreibt und letztendlich die einzigartige Morphologie und Funktion von Sinneszellen prägt. In diesem Artikel beschreiben wir einen Arbeitsablauf für den Aktin-Filament-Gleittest, der speziell für Myosin-7a bei Säugetieren angepasst wurde. Der Aktin-Filament-Gleit-Assay ist ein robuster In-vitro-Motilitätsassay, der die Bewegung von fluoreszierenden Aktinfilamenten quantitativ untersucht, die von einer großen Anzahl von Myosinmotoren angetrieben werden, die auf einer Deckglasoberfläche immobilisiert sind 30,31,32. Zu den Vorteilen dieses Assays gehören die einfache Einrichtung, der minimale Gerätebedarf (ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit Digitalkamera) und die hohe Reproduzierbarkeit. Da die Bewegung der Aktinfilamente von einem Cluster immobilisierter Myosinmotoren angetrieben wird, ist dieser Assay besonders nützlich für die Untersuchung der Motilität von monomeren Myosinen wie Myosin-7a^14,33. Die Protokolle umfassen mehrere Modifikationen, von experimentellen Verfahren bis hin zu bildgebenden Analysen, die speziell auf die einzigartigen beweglichen Eigenschaften von Säugetier-Myosin-7a zugeschnitten sind. Mit der Verfügbarkeit eines intakten Myosin-7a-Proteins und dem hier skizzierten funktionellen Charakterisierungsprotokoll legt diese Arbeit den Grundstein für weitere Untersuchungen der molekularen Rolle von Myosin-7a sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Prozessen.

Protokoll

HINWEIS: Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Synthese des intakten humanen Myosin-7a-Holoenzyms und zur Charakterisierung seiner Motilität in vitro. Dieses Protokoll ist in drei Abschnitte unterteilt: erstens die Expression des humanen Myosin-7a unter Verwendung des MultiBac-Baculovirus-Proteinexpressionssystems; Zweitens, getrennte Reinigung von Myosin-7a-Leichtketten unter Verwendung des E.coli His6-SUMO-Systems; und schließlich die Untersuchung der Motilität von humanem Myosin-7a mit dem Aktin-Filament-Gleittest.

1. MultiBac-Systembasierte Myosin-7a-Komplexproduktion

1. Erstellung einer Baculovirus-Multigenkassette zur Expression des humanen Myosin-7a-Komplexes (16 Tage)
   HINWEIS: Es ist ein Klonierungszyklus (4 Tage) erforderlich, um die cDNAs der Myosin-7a-Untereinheiten in die pACEBac1-Vektoren einzufügen, und drei Klonierungszyklen, um die schrittweise Ligation aller für die Expression des Myosin-7a-Komplexes erforderlichen Multiplikationsmodule abzuschließen, was zu einer Gesamtdauer von 16 Tagen führt.
   1. Klonieren Sie die cDNAs, die für die Myosin-7a-Schwerkette (HC), Calmodulin, CALML4 und RLC kodieren, in die pACEBac1-Vektoren mit einem kommerziellen Kit gemäß den Protokollen des Herstellers (siehe Materialtabelle; Abbildung 1A). Ein FLAG-Tag wird am C-Terminus des Myosin-7a HC eingefügt, um die Reinigung zu unterstützen.
      HINWEIS: Säugetier-Myosin-7a wird in Form von zwei Spleißisoformen produziert, die sich nur durch ein Segment von 11 Aminosäuren am N-Terminus²³ unterscheiden. Diese kurze N-terminale Verlängerung spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der ATPase-Aktivität von Myosin-7a14. Es wurde gezeigt, dass das Hinzufügen eines N-terminalen Tags die normale Regulation durch diese N-terminale Erweiterung stören und die enzymatische Aktivität und Motilität des Motors signifikant reduzieren kann¹⁴. Daher wird ein C-terminaler FLAG-Tag verwendet, um die natürliche Regulation des Proteins nicht zu stören.
   2. Die Multigen-Expressionskassette für das Myosin-7a-Holoenzym wird unter Verwendung der Homing-Endonuklease/BstXI-Multiplikation wie unten beschrieben konstruiert (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Die homing-Endonuklease I-CeuI produziert kohäsive Enden, die mit den vom BstXI-Verdau erzeugten Enden kompatibel sind. Bei der Ligation entsteht eine homing-Endonuklease/BstXI-Hybrid-Restriktionsstelle, die von keinem der beiden Enzyme geschnitten werden kann. Der gleiche Vorgang kann wiederholt werden, um weitere Multiplikationsmodule zu integrieren. Wenn mehrere Restriktionsstellen für I-CeuI und BstXI auf dem Insert- oder Vektorkonstrukt vorhanden sind, müssen diese zusätzlichen Stellen durch ortsgerichtete Mutagenese eliminiert werden, um sicherzustellen, dass die I-CeuI- und BstXI-Schnittstellen eindeutig sind.
   3. Insert-Vorbereitung: Verdauen Sie das Insert-Konstrukt (z. B. pACEBac-M7a HC) mit der Homing-Endonuklease I-CeuI (siehe Materialtabelle) und reinigen Sie dann das linearisierte Plasmid mit einem PCR-Aufreinigungskit (siehe Materialtabelle). Verdauen Sie ferner das linearisierte Plasmid mit BstXI (siehe Materialtabelle), trennen Sie das Fragment mit der Genexpressionskassette mittels Gelelektrophorese ab und reinigen Sie es mit einem Gelextraktionskit (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: I-CeuI und BstXI erfordern gemäß den Protokollen des Herstellers unterschiedliche Pufferbedingungen, um eine Aktivität von 100 % zu erreichen. Darüber hinaus benötigt ein vollständiger Schnitt mit I-CeuI mindestens 3 Stunden, während BstXI nur 15 Minuten Inkubationszeit benötigt. Die Aufschlüsse müssen daher nacheinander durchgeführt werden.
   4. Vektorvorbereitung: Linearisieren Sie das Vektorkonstrukt (z. B. pACEBac-CaM) durch BstXI-Aufschluss. Alkalische Phosphatase ist in der Vektorpräparation enthalten, um zu verhindern, dass das Vektorplasmid an sich selbst ligiert (siehe Materialtabelle). Gewinnen Sie das Aufschlussprodukt durch Elektrophorese und reinigen Sie es mit einem Gel-Extraktionskit.
   5. Ligatierung: Ligate des I-CeuI/BstXI-behandelten Inserts und des BstXI-behandelten Vektors mit T4-DNA-Ligase (siehe Materialtabelle). Ligationsreaktionen werden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 °C -25 °C) mit einem Massenverhältnis von 1:1 zwischen der Insert-DNA und der Vektor-DNA durchgeführt, wobei die Gesamtmasse bei jeder Ligationsreaktion nahe 100 ng gehalten wird.
   6. Transformation und Plasmidanalyse: Transformieren Sie die Ligationsmischungen in DH5α-Zellen (siehe Materialtabelle) gemäß den Empfehlungen des Herstellers und screenen Sie die positiven Kolonien auf Gentamicinresistenz. Reinigen Sie die Plasmide mit einem kommerziellen Kit (siehe Materialtabelle) und verifizieren Sie die korrekten Klone (z. B. Plasmide, die sowohl M7a HC als auch CaM enthalten) basierend auf spezifischen Restriktionsverdauungsmustern und DNA-Sequenzierung der Inserts.
   7. Integration mehrerer Genexpressionskassetten: Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2 bis 1.1.6, um weitere Genkassetten zu integrieren, die andere Myosin-7a-Untereinheiten exprimieren.
2. Produktion und Reinigung von rekombinanter Bacmid-DNA (4 Tage; Abbildung 1C).
   HINWEIS: Tag 1 - Bakterielle Umwandlung und Wachstum von transformierten Kolonien. Tag 2-3 - Wachsende Bienenvölker und Screening für eine erfolgreiche Transformation. Tag 3 - Auswahl und Streifen positiver Kolonien, Beginn der Inokulation über Nacht. Tag 4 - Reinigung der Bacmid-DNA.
   1. Transformieren Sie DH10Bac-kompetente Zellen (siehe Materialtabelle) mit 1 ng des sequenzierten pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM-Plasmids gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
   2. 20-200 μl der Zellen auf eine Agarplatte mit 50 μg/ml Kanamycin, 7 μg/ml Gentamicin, 10 μg/ml Tetracyclin, 100 μg/ml halogeniertes Indolyl-β-Galactosid und 40 μg/ml IPTG auflegen (siehe Materialtabelle) und die Platte 48 Stunden lang bei 37 °C inkubieren, um die Entwicklung einer tiefblauen Farbe in negativen Klonen zu ermöglichen.
      HINWEIS: Das halogenierte Indolyl-β-Galactosid färbt Kolonien, die weiterhin LacZ exprimieren (was darauf hindeutet, dass die Transposition nicht erfolgreich war), was die Selektion weißer Kolonien ermöglicht, bei denen die Transposition erfolgreich war.
   3. Wählen Sie sorgfältig eine isolierte weiße Kolonie aus und züchten Sie Zellen über Nacht in 5 ml LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin, 7 μg/ml Gentamicin und 10 μg/ml Tetracyclin bei 37 °C in einem Orbitalschüttler bei 225 U/min.
   4. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 2.465 x g für 10 Minuten, um die E-coli zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 300 μl Puffer P1 aus dem Kit.
      HINWEIS: Obwohl hier Puffer aus dem Miniprep-Kit verwendet werden, unterscheidet sich das Protokoll für die Reinigung des Bacmid-Produkts von dem mit dem Kit gelieferten Protokoll.
   5. Fügen Sie 300 μl des Puffers P2 aus dem Kit hinzu. Mischen Sie, indem Sie die Röhrchen einige Male umdrehen und dann 3 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
   6. Fügen Sie 300 μl des N3-Puffers aus dem Kit hinzu und mischen Sie durch Inversion, um die Lysereaktion zu stoppen. Zentrifugieren Sie bei 17.885 x g für 10 min bei 4 °C.
   7. Den Überstand in ein sauberes steriles Röhrchen umfüllen und die Zentrifugation für weitere 10 Minuten wiederholen.
   8. 800 μl des Überstands in ein anderes steriles 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen (siehe Materialtabelle) und 600 μl kaltes Isopropanol (siehe Materialtabelle) hinzufügen, durch rigorose Inversion mischen. Anschließend bei 17.885 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren.
   9. Entsorgen Sie den Überstand und suchen Sie das kleine, weiße Kügelchen. Das Pellet mit 800 μl kaltem 70%igem Ethanol waschen (siehe Materialtabelle) und bei 17.885 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Füge vorsichtig Ethanol entlang der Rohrwand hinzu, um das Pellet nicht zu stören.
   10. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Ethanolwäsche einmal. Trocknen Sie das Pellet 5 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Überschüssige Flüssigkeit bei Bedarf vorsichtig absaugen.
   11. Lösen Sie das Pellet mit 20 μl EB-Puffer aus dem Kit auf. Stellen Sie sicher, dass sich das Pellet vollständig aufgelöst hat, indem Sie das Röhrchen schnippen oder durch Pipettieren vorsichtig mischen. Bestimmen Sie die Konzentration mit einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).
   12. Passen Sie das Puffervolumen nach Bedarf an, um die Bacmidkonzentration auf ca. 1 μg/μl zu erhöhen. Lagern Sie die Bacmid-DNA bei 4 °C, bis sie für die P0-Virusproduktion bereit ist.
       HINWEIS: Das gereinigte Bacmid kann bei 4 °C aufbewahrt werden und bleibt mehrere Monate wirksam. Wir haben erfolgreiche Transfektionen mit Bacmid-Produkten bis zu einem Alter von 1 Jahr gesehen. Alternativ kann das Bacmid aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden. Mehrfache Gefrier-/Auftauzyklen sollten vermieden werden, da sie die Transfektionseffizienz verringern.
3. Transfect Sf9-Insektenzellen mit Bacmid, um rekombinante Baculoviren zu produzieren (6 Tage; Abbildung 1D)
   HINWEIS: Tag 1 - Transfektion von Zellen mit Bacmid-DNA. Tag 2-6 - Beobachten Sie das Wachstum und die Expression von Zellen. Tag 6 - Sammlung des P0-Virus.
   1. Geben Sie Sf9-Zellen in Kulturmedien (siehe Materialtabelle) in eine 6-Well-Platte mit einer Konzentration von 0,33 x 10⁶ Zellen/ml mit 3 mL pro Well. Lassen Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen, damit sich die Zellen am Boden der Platte festsetzen können.
   2. Bereiten Sie für jede Vertiefung eine Transfektionsmischung vor, indem Sie 10 μl kationisches Lipidtransfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) mit 250 μl verbessertem MEM-Medium (Minimal Essential Medium) (siehe Materialtabelle) in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren. Durch Inversion mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. 1 μg (bezogen auf die in Schritt 1.2.12 ermittelte Konzentration) unverdünntes Myosin-7a-Bacmid in das Transfektionsgemisch geben. Durch Inversion mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   4. Verteilen Sie das gesamte DNA-Lipid-Gemisch gleichmäßig tropfenweise in die Vertiefungen. Lassen Sie eine Vertiefung für nicht transfizierte Zellen als Negativkontrolle.
   5. Verschließen Sie die 6-Well-Platte mit Folie (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 6 Tage lang bei 27 °C. Beobachte Wachstum und Ablösung während dieser Zeit. Wenn auf dem Konstrukt ein Fluoreszenz-Tag vorhanden ist, überprüfen Sie die Fluoreszenzentwicklung (Abbildung 2).
   6. Wenn die transfizierten Zellen Anzeichen einer Infektion im Spätstadium zeigen, wird das Medium, das das Virus enthält, aus den infizierten Vertiefungen in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 805 x g zentrifugiert.
   7. Den Überstand in ein sauberes konisches 15-ml-Röhrchen umfüllen, in Aluminiumfolie einwickeln und bei 4 °C lagern. Dieses Produkt ist jetzt der P0-Virus und kann nach unserer Erfahrung bis zu vier Monate lang gelagert und effektiv verwendet werden.
4. Amplifizieren Sie den Baculovirus-Bestand (3-5 Tage ; Abbildung 1E)
   1. Bereiten Sie 100 ml (oder das gewünschte Volumen) Sf9-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml in Sf9-Zellkulturmedien in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben vor (siehe Materialtabelle).
   2. 1:100 Verhältnis (v/v) P0-Virusbestand in die Sf9-Zellsuspensionskultur geben und bei 27 °C in einem Orbitalschüttler bei 135 U/min inkubieren.
   3. Überwachen Sie das Wachstum alle 24 Stunden, bis die Zellen ~90% Zelltod erreichen. Sobald Sie diesen Bereich erreicht haben, zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 10 Minuten und sammeln Sie den Überstand, der das P1-Virus enthält.
   4. Filtrieren Sie den Überstand mit einer 0,22 μm Vakuumfiltration (siehe Materialtabelle). Bewahren Sie das gefilterte Produkt im Dunkeln auf und lagern Sie es bei 4 °C. Dieses Produkt ist jetzt der P1-Virus.
      HINWEIS: Der Virustiter nimmt bei längerer Lagerung bei 4 °C ab. Erwägen Sie, frischen Virusbestand herzustellen, wenn er länger als 4 Monate gelagert wurde, oder titern Sie den Virusbestand vor der Verwendung in Ausdruck³⁴.
5. Proteinexpression (60 -72 h zwischen Beginn der Expression und Entnahme des Zellpellets; Abbildung 1E)
   1. Bereiten Sie in der logarithmischen Phase wachsende Sf9-Zellen in einer Konzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml vor und fügen Sie das P1-Virus in einem Verhältnis von 12 ml Virus zu 300 ml Zellsuspension hinzu.
      HINWEIS: Die Proteinausbeute beträgt ca. 1 mg/l. Es wird empfohlen, für diese Proteinexpression mindestens 1,5 l Zellsuspension zu verwenden.
   2. Die Zellen werden bei 27 °C in einem Orbitalschüttler bei 135 U/min für ca. 60 h kultiviert.
      HINWEIS: Kleine Proben können zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und mit SDS-Gelen analysiert werden, um die Proteinexpressionsniveaus zu beurteilen. Wenn die Proteine mit fluoreszierenden Tags fusioniert werden, können die Expressionsniveaus zusätzlich mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie bewertet werden. Die Zellen sollten spätestens mit dem Einsetzen des Zelltods geerntet werden.
   3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 3.735 x g für 5 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren. Die Pellets können bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert oder für die Langzeitlagerung konserviert werden. Wir verwenden Zellpellets in der Regel innerhalb von Wochen, haben aber einige Monate nach dem Einfrieren das aktive Protein zurückgewonnen.
6. Proteinreinigung (2 Tage ; Abbildung 1F)
   HINWEIS: Tag 1 - Proteinextraktion und -reinigung mittels FLAG-Affinitätschromatographie. Tag 2 - Aliquotieren und Einfrieren der Proben nach der Nachtdialyse. Das unten beschriebene Protokoll gilt für die Reinigung von Myosin-7a aus 1,5-l-Zellpellets.
   1. Bereiten Sie einen Master-Puffer vor, der 10 mM MOPS (pH 7,2), 500 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 μg/mL Leupeptin und 100 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthält. Filtern Sie ihn mit einem 0,22 μm Porenfilter und lagern Sie den Puffer bei 4 °C (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: PMSF ist in wässrigen Lösungen instabil. Bereiten Sie die PMSF-Stammlösung als 1 M in 100%igem Ethanol vor und lagern Sie sie bis zu 6 Monate bei -20 °C.
   2. Bereiten Sie 75 ml Extraktionspuffer vor, indem Sie den Master-Puffer mit 3 EDTA-freien Proteasehemmer-Tabletten, 2 mM ATP und 0,1 mM Dithiothreitol (DTT; siehe Materialtabelle) ergänzen.
   3. Geben Sie 75 ml Extraktionspuffer in das Pellet, während es noch gefroren ist. Lassen Sie das Pellet im Extraktionspuffer auf Eis, bis es auftaut. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um das Pellet aufzubrechen, um den Auftauprozess zu beschleunigen.
   4. Mit einer 13 mm (1/2 Zoll) großen Spitze wird die Resuspension 10 Minuten lang bei 50 % Amplitude beschallt, 5 s an, 5 s aus.
   5. Das Gesamtlysat wird bei 33.746 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Bereiten Sie während der Zentrifugation 1,5 mL FLAG-Harz vor, indem Sie 3 mL der 50%igen Aufschlämmung des Anti-FLAG-Affinitätsharzes (siehe Materialtabelle) mit 40 mL PBS waschen. Das Harz wird durch Zentrifugieren bei 800 x g für 2 min bei 4 °C pelletiert. Entfernen Sie das PBS vorsichtig, ohne das Harz zu stören.
   6. Den Überstand aus der Lysatzentrifugation zum gewaschenen Harz geben und bei kontinuierlicher Rotation bei 4 °C 1 h inkubieren.
   7. Das Harz wird durch Zentrifugieren bei 800 x g für 2 min bei 4°C pelletiert. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Harz zu stören.
   8. Resuspendieren Sie das Harz in 40 mL Master Buffer und zentrifugieren Sie es bei 800 x g für 2 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Harz zu stören. Wiederholen Sie den Waschgang 1x.
   9. Übertragen Sie das gewaschene Harz auf zwei Polypropylen-Schleudersäulen (siehe Materialtabelle). Waschen Sie jede Säule 1x mit 2 mL Master Buffer. Entfernen Sie den Master-Puffer, indem Sie die Säule 2 Minuten lang bei 4 °C bei 1.400 x g zentrifugieren. Das Harz wird auf den Boden gepackt.
   10. Bereiten Sie einen Elutionspuffer vor, indem Sie 100 μg/ml FLAG-Peptid (siehe Materialtabelle) zum Master-Puffer hinzufügen.
   11. Geben Sie 300 μl Elutionspuffer in jede Säule zum gepackten Harz und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren, um sicherzustellen, dass das Harz vollständig durch den Elutionspuffer hydratisiert wird. Lassen Sie das Harz mit dem Elution Buffer 10 min auf Eis inkubieren.
   12. Zentrifugieren Sie die Säulen bei 1.400 x g für 2 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Durchfluss in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie es auf Eis. Dies ist die erste Fraktion.
   13. Wiederholen Sie die Schritte 1.6.11 bis 1.6.12, sodass 4 Fraktionen aus jeder Spalte gesammelt werden.
   14. Es wird eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese³⁵ mit den Elutionsfraktionen durchgeführt, um deren relative Konzentrationen zu bestimmen. Während das Gel läuft, bereiten Sie einen Dialysepuffer vor, der 500 mM NaCl, 10 mM MOPS, 2 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA und 1 mM DTT enthält.
   15. Kombinieren Sie die konzentriertesten Fraktionen. Die Probe wird in eine 10-K-MWCO-Dialysekassette überführt (siehe Materialtabelle) und über Nacht bei 4 °C dialysiert. Verwenden Sie 1 l Dialysepuffer für ca. 500 μl Protein. Führen Sie mindestens drei Wechsel des Dialysepuffers durch.
       HINWEIS: Die Spin-Säulen- und Zentrifugations-Elutionsmethode ermöglicht die Eluierung von Proteinen in hohen Konzentrationen (0,5-1 mg/ml). Weitere Konzentrationsschritte sind in der Regel nicht erforderlich. Wenn jedoch konzentriertere Proteine gewünscht werden, laden Sie die Proben auf 100.000 MWCO-Konzentrationsröhrchen (siehe Materialtabelle) und zentrifugieren Sie bei 1.400 x g für 5 min bei 4 °C. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gewünschte Volumen der Proteinlösung erreicht ist.
   16. Entladen Sie die Probe am nächsten Tag vorsichtig aus der Dialysekassette. Aliquotieren Sie 15 μl pro PCR-Röhrchen und geben Sie die Röhrchen zum Schockfrosten in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff. Die gefrorenen Proteine können bei -80 °C für die zukünftige Verwendung gelagert werden (Abbildung 3A).
       HINWEIS: Die Ausbeute an Myosin-7a bei dieser Methode liegt normalerweise zwischen 0,5 und 1 mg/l.

2. Reinigung der Leichtketten RLC und CALML4 mit dem E. coli His6-SUMO-System (7 Tage)

HINWEIS: Tag 1-4 - Klonierung und Reinigung der Plasmide. Tag 5 - Bakterielle Umwandlung. Tag 6-7 - Reinigung, Aliquotierung und Einfrieren der endgültigen Proteine.

1. Klonieren Sie die cDNAs, die für RLC und CALML4 kodieren, in einen pET-SUMO-Vektor, der eine His6-Sequenz vor SUMO enthält, um die Aufreinigung zu unterstützen. Bei Bedarf kann die His6-SUMO-Domäne mit Hilfe einer SENP2-Protease^26,36 vom Fusionsprotein abgespalten werden.
2. Für jedes Leichtkettenprotein transformieren Sie BL21 E. coli-kompetente Zellen (siehe Materialtabelle) mit dem Plasmid und starten Sie eine 5-ml-Flüssigkultur über Nacht mit den transformierten Zellen.
3. Am nächsten Tag inokulieren Sie die 5-ml-Übernachtkultur in 1 l Luria-Bertani (LB)-Bouillon mit 50 μg/ml Kanamycin. Lassen Sie die Kultur bei 37 °C und kontinuierlichem Schütteln bei 270 U/min wachsen, bis die optische Dichte (OD) 0,6 - 1,0 erreicht.
   HINWEIS: Der OD-Wert verdoppelt sich etwa alle 20 Minuten, sobald er 0,2 erreicht. Überwachen Sie den Außendurchmesser regelmäßig.
4. Initiieren Sie die Proteinexpression, indem Sie der Kultur 250 μM Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zusetzen. 3-5 h bei 37 °C oder 16 °C über Nacht mit kontinuierlichem Schütteln bei 270 U/min inkubieren.
5. Pelletieren Sie die E. coli , indem Sie die Zellsuspension bei 4.347 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
6. Bereiten Sie einen Resuspensionspuffer vor, der 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 5 mM Imidazol und 10 % Glycerin, pH 7,4 enthält (siehe Materialtabelle). Bleiben Sie auf Eis.
7. Resuspendieren Sie das Pellet in 15-25 ml Resuspensionspuffer und überführen Sie die Suspension in ein sauberes Becherglas, wobei Sie das Gesamtvolumen auf 35 mL einstellen. Geben Sie DNase und RNase in einem Verhältnis von 1:1000 (v/v) zur Suspension für eine Endkonzentration von 1 μg/ml bzw. 2 μg/ml. Geben Sie eine EDTA-freie Proteasehemmer-Tablette, 4 mM 2-Mercaptoethanol und 1 % Triton X in die Suspension (siehe Materialtabelle). 20 Minuten auf Eis halten.
8. Beschallen Sie die Pelletsuspension in Eiswasser mit 1 s an und 1 s aus für insgesamt 1 min bei 100 % Amplitude. Das homogenisierte Lysat wird 2 h lang bei 4 °C und kontinuierlicher Rotation belassen.
   HINWEIS: Die Zugabe von Triton X hilft bei der Lyse der Zellen zur Vorbereitung auf die Beschallung.
9. Zentrifugieren Sie die Lysate bei 26.900 x g für 45 min bei 4 °C. Während dies geschieht, beginnen Sie mit der Vorbereitung des Kobaltharzes (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie 500 μl Kobaltharz für 1 l E. coli-Kultur . Waschen Sie das Harz 2x mit Reinstwasser und einmal mit Suspension Buffer, indem Sie bei 4.347 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren.
10. Nach der Lysatzentrifugation wird der Überstand mit dem gewaschenen Harz vermischt und 30 min lang bei 4 °C vorsichtig gerockt.
11. Die Lysat-Harz-Suspension wird bei 4.347 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugiert. Das Harz wird am Boden der Tube verpackt. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Harz zu stören.
12. Waschen Sie das Harz mit Resuspension Buffer, indem Sie es bei 4.347 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Wäschen, bis der Überstand farblos ist.
13. Bereiten Sie einen Elutionspuffer vor, der 50 mM Tris HCl, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazol, 10 % Glycerin, 4 mM 2-Mercaptoethanol und 0,25 μM SENP2-Protease enthält (siehe Materialtabelle). Bewahren Sie es auf Eis auf.
14. Resuspendieren Sie das Harz in 1 mL Resuspensionspuffer und inkubieren Sie es über Nacht bei 4 °C mit kontinuierlicher Rotation.
15. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 4.347 x g , um das Harz zu pelletieren. Sammeln Sie den Überstand, der das gespaltene Leichtkettenprotein und die Protease enthält.
16. Gib 1 ml Elutionspuffer zum Harz. Wiederholen Sie das Zentrifugieren und sammeln Sie den Überstand.
17. Entfernen Sie die Protease durch schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC). Bereiten Sie die Größenausschlusssäule (siehe Materialtabelle) kurz mit einem Puffer vor, der 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin und 5 mM DTT (pH 7,4) enthält. Der Überstand wird mit einem 10.000 MWCO-Konzentrationsröhrchen auf 500 μl konzentriert. Laden Sie die konzentrierte Probe mit einer Spritze auf eine Säule, die mit einem automatisierten Chromatographiesystem verbunden ist, und fließen Sie mit einem Puffer durch, der 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin und 5 mM DTt (pH 7,4) enthält. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen mit einer Ultraviolett-Spektrophotometrie. Sammeln Sie die Proteinfraktionen mit einem Molekulargewicht, das den leichten Ketten entspricht.
    HINWEIS: Die Protease kann auch durch Affinitätschromatographie entfernt werden, wenn ein Aufreinigungsetikett (z. B. GST-Tag) in die Protease eingearbeitet wird.
18. Führen Sie ein SDS-PAGE-Gel mit den Elutionsfraktionen durch, um die Reinheit und die relativen Konzentrationen der Leichtkettenproteine in jeder Fraktion zu bestimmen. Erwünscht sind solche, die konzentrierte Leichtkettenproteine ohne sichtbare Proteasebanden enthalten. Kombinieren Sie die gewünschten Proteinfraktionen und konzentrieren Sie sie mit einem 10.000 MWCO-Konzentrationsröhrchen³⁵.
19. Aliquoten des Proteins in flüssigem Stickstoff schockfrieren und zur Langzeitlagerung sofort auf -80 °C überführen (Abbildung 3B).
    HINWEIS: Die Ausbeute an RLC und CALML4 unter Verwendung des E. coli His6-SUMO-Systems beträgt etwa 1-2 mg/l.

3. Myosin-7a-maßgeschneiderter Aktin-Filament-Gleittest (3 h)

ANMERKUNG: Die in diesem Abschnitt verwendeten Verfahren ähneln denen, die für andere Myosine³¹ beschrieben wurden, wobei die wichtigsten Modifikationen die Inkubation und Anwendung von Myosin in einem Puffer mit hoher Ionenstärke und das lange Intervall sind, das erforderlich ist, um eine genaue Messung der Verschiebungen von Bild zu Bild zu erreichen.

1. 20 μM filamentöses Aktin (F-Aktin) durch Polymerisation von globulärem Aktin (G-Aktin) in Polymerisationspuffer (50 mM KCl, 25 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7,0)) bei 4 °C über Nacht herstellen. Markieren Sie F-Aktin durch Zugabe von 1,2x molaren Überschuss an Rhodamin-Phalloidin (siehe Materialtabelle). Mit Alufolie abdecken und mindestens 2 h auf Eis inkubieren.
   HINWEIS: G-Aktin kann bei kommerziellen Händlern gekauft werden (siehe Materialtabelle) oder aus Kaninchenmuskel-Acetonpulver gereinigt werden^31,37. Markiertes F-Aktin kann bei dieser Konzentration bis zu 2 Monate bei 4 °C gelagert werden.
2. Bereiten Sie eine Strömungskammer vor, wie zuvor beschrieben³¹. Legen Sie kurz zwei Streifen doppelseitiges Klebeband im Abstand von 2-3 mm auf einen gereinigten und mit Nitrozellulose behandelten Objektträger (siehe Materialtabelle). Legen Sie die Deckglas-Nitrozellulose-Seite nach unten auf die Streifen, so dass eine Durchflusskammer mit einem Volumen von ca. 10 μl entsteht (Abbildung 4).
3. Durchführung eines Aktin-Filament-Gleitassays
   1. Geben Sie in die Durchflusskammer ein Kammervolumen mit 0,2 mg/ml gereinigtem humanem Myosin-7a-Protein in 500 mM NaCl Motilitätspuffer (500 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA (pH 7,4)). 5 min bei Raumtemperatur inkubieren lassen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, Myosin-7a in einem Puffer mit hohem Salzgehalt hinzuzufügen, da dies den autoinhibierten Zustand aufhebt und es Myosin-7a ermöglicht, in der aktivierten Konformation an der Oberfläche zu haften.
   2. Waschen Sie die Durchflusskammer mit einem Volumen von drei Kammern von 1 mg/mL BSA (siehe Materialtabelle) in 150 mM NaCl Motilitätspuffer (150 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)) und ziehen Sie die Flüssigkeit mit einem sauberen Tuch am Auslass durch, um überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen. Nach der 3^. Wäsche 1 Minute inkubieren.
   3. Fließen Sie ein Kammervolumen von 10 nM Rhodamin-Phalloidin-markiertem F-Aktin in 150 mM NaCl-Motilitätspuffer durch die Durchflusskammer. Überwachen Sie die Bindung von Aktinfilamenten an die Oberfläche unter einem Fluoreszenzmikroskop mit 100x Objektiv. Die Dichte der Aktinfilamente sollte optimal sein (Abbildung 5A), um sicherzustellen, dass genügend Filamente im Sichtfeld für die Verfolgung vorhanden sind, aber dünn genug, um die Überlappung mehrerer Filamente zu verhindern, was die Verfolgung erschwert.
   4. Waschen Sie die Durchflusskammer mit einem Drei-Kammer-Volumen von 150 mM NaCl Motility Buffer, um ungebundene Aktinfilamente und überschüssiges Rhodamin-Phalloidin zu entfernen.
   5. Die Motilität wird durch Zugabe eines Kammervolumens des Endpuffers (200 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 50 mM DTT, 2 mM ATP, 2,5 mg/ml Glukose, 100 μg/ml Glukoseoxidase, 2 μM RLC, 2 μM CaM, 2 μM CALML4) eingeleitet.
   6. Nehmen Sie Bilder an einem Fluoreszenzmikroskop mit 561-nm-Anregung auf, um Rhodamin-Phalloidin-markiertes Aktin sichtbar zu machen. Suchen Sie einen Bereich auf der Folie mit der gewünschten Aktindichte (Abbildung 5A) und nehmen Sie 30 Minuten lang alle 30 s Bilder auf.
      HINWEIS: Die Geschwindigkeit von Myosin-7a bei Säugetieren beträgt ca. 5 nm/s. Bei der Einstellung der Erfassungsbildrate ist darauf zu achten, dass die Verschiebungen der Filamente zwischen den Frames lang genug sind (mehr als ein Pixel), um eine genaue Verfolgung zu ermöglichen. Subpixel-Bewegungen zwischen den Frames können zu einer Überschätzung der Geschwindigkeit führen. Die Bildrate von 30 s ermöglicht es den Aktinfilamenten, sich zwischen den Bildern um etwa 150 nm zu bewegen, was mehr als zwei Pixeln auf dem Mikroskop entspricht. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, dass am verwendeten Mikroskop eine signifikante Verschiebung beobachtet werden kann. Falls verfügbar, kann die Mehrpositionsaufzeichnung verwendet werden, um mehrere Sichtfelder gleichzeitig für die Analyse zu erfassen.
4. Analyse der Bewegung der Aktinfilamente mit dem FAST-Programm (installiert auf einem Mac)³⁸.
   HINWEIS: Das hier verwendete FAST-Programm ist nur eine von vielen Optionen zur Quantifizierung der Filamentbewegung. Wir haben uns für FAST entschieden, weil es automatisiert und schnell ist und keine kostenpflichtige Software erfordert. Weitere Optionen sind MATLAB-basierte Algorithmen wie FIESTA, ImageJ/FIJI-basierte Methoden wie MTrack2 und Manual Tracking sowie Python-basierte Methoden wie Philament³⁹.
   1. Laden Sie das Programm FAST (github.com/NeilBillington/FASTrack3 - python3 kompatible Version mit einem Zusatzmodul für die Konvertierung der Datei nd2 herunter und installieren Sie es. NB: Die Originalversion von python2 finden Sie unter github.com/turalaksel/FASTrack).
   2. Führen Sie das FAST-Programm wie in³⁸ beschrieben mit einem Toleranzwert von 33 aus, um nur glatt bewegte Filamente zu erhalten.
      HINWEIS: Wenn Bilder aufgrund mechanischer Probleme mit der Bühne oder durch das gleichzeitige Aufnehmen mehrerer Serien eine Drift aufweisen, sollten die Filme zuerst stabilisiert werden. Hierfür empfehlen wir das FIJI-Plugin Image Stabilizer, das unter der folgenden Adresse zum Download zur Verfügung steht - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
   3. Verwenden Sie das FAST-Programm, um die neu erstellten .tif Bilder zu analysieren, indem Sie zuerst die Werte -xmax und -ymax festlegen. Diese legen die Parameter für das vom Programm ausgegebene Streudiagramm fest und stellen die längste Filamentlänge (in nm) und die maximale Filamentgeschwindigkeit (in nm/s) dar. In diesem Beispiel haben wir 20.000 nm für -xmax und 20 nm/s für -ymax verwendet, um sicherzustellen, dass alle Daten erfasst werden (Abbildung 5D).
   4. Verwenden Sie -px, um die Pixelgröße des aufgenommenen Bildes festzulegen, die hier 65 nm beträgt, und -minv, um die minimale Geschwindigkeit (in nm/s) festzulegen, die für ein Filament erforderlich ist, um in die Analyse einbezogen zu werden. Für die niedrige Geschwindigkeit von Myosin-7a in diesem Beispiel wird 0,1 nm/s verwendet.
   5. Verwenden Sie -maxd, um den maximal zulässigen Abstand zwischen Frames für zu verknüpfende Filamente festzulegen. Dies ist so eingestellt, dass das Verknüpfen separater Filamente zwischen Frames vermieden wird, und in diesem Beispiel verwenden wir die Standardeinstellung von 2000 nm.
   6. Verwenden Sie pt, um die Toleranz für Schwankungen der Filamentgeschwindigkeiten einzustellen und nur Filamente mit gleichmäßigen Bewegungen einzubeziehen. In diesem Beispiel wird ein Toleranzschwellenwert von 33 % verwendet. Das bedeutet, dass Filamente mit einer Geschwindigkeitsstandardabweichung von mehr als 33 % des Geschwindigkeitsmittelwerts von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden.
   7. Verwenden Sie abschließend -d, um den Ordner anzugeben, der die .tif Stacks für die Analyse enthält. Die gesamte Befehlszeichenfolge mit den angegebenen Parametern und Werten lautet: fast -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [Ordnername mit Filmen].
      HINWEIS: Das FAST-Programm gibt Streudiagramme (Abbildung 5D) mit den zugehörigen Rohdaten aus, die zur Analyse und Visualisierung in anderen Programmen extrahiert werden können (Abbildung 5C). Es wird auch ein Diagramm der Pfade der verfolgten Filamente ausgegeben (Abbildung 5B), das verwendet werden sollte, um zu überprüfen, ob das Tracking wie erwartet funktioniert. Beispiele für die Diagramme und andere mögliche Datenvisualisierungen sind unten aufgeführt.

Ergebnisse

Der gereinigte Myosin-7a-Komplex und die Leichtkettenproteine können mittels SDS-PAGE-Gelelektrophorese ausgewertet werden, wie in Abbildung 3 gezeigt. Die Bande oberhalb des 200 kDa-Markers entspricht der Myosin-7a-Schwerkette (255 kDa). Die drei Banden, die zwischen den 22- und 14-kDa-Markern von oben nach unten wandern, sind RLC (20 kDa), Calmodulin bzw. CALML4. Während Calmodulin und CALML4 ein ähnliches Molekulargewicht von etwa 17 kDa haben, können...

Diskussion

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von rekombinantem humanem Myosin-7a-Protein aus Insektenzellen vorgestellt. Obwohl das Sf9/Baculovirus-System zur Herstellung einer Vielzahl von Myosinen verwendet wurde 40,41,42,43, wurde das Säugetier-Myosin-7a erst vor kurzem erfolgreich mit dem MultiBac-Baculovirus-System ^gereinig...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
1X FLAG Peptide	GenScript	N/A	Custom peptide synthesis
22x22mm No. 1.5 coverslips	VWR	48366-227
250 mL Conical Centrifuge Tubes	Nunc	376814
250 mL Vented Erlenmyer Shaker Flask	IntelixBio	DBJ-SF250VP
2-Mercaptoethanol	VWR	M131
75x25x1 mm Vistavision microscope slides	VWR	16004-42
Actin Protein (>99% Pure)	Cytoskeleton	AKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220
ATP	Millipore Sigma	A7699
ATP	Millipore Sigma	A7699
Bio-Spin Disposable Chromatography Column	Bio-Rad	732-6008
BL21 Competent E. coli	New England Biolabs	C2530H
Bluo-Gal	Thermo Fisher	15519028
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	5470
BstXI Enzyme	New England Biolabs	R0113S
Calmodulin	Millipore Sigma	208694
Catalase	Millipore Sigma	C40
Champion pET-SUMO Expression System	Thermo Fisher	K30001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche Diagnostics	5056489001
Cutsmart Buffer	New England Biolabs	B6004S
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DNase I, Spectrum Chemical	Fisher Scientific	18-610-304
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
Ethanol	Thermo Fisher	BP2818
ExpiFectamine Sf Transfection Reagent	Gibco	A38915
FAST program	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements;
Fisherbrand Model 505 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB505110
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-064	10 mg/mL in distilled water
Glucose	Millipore Sigma	G5767
Glucose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Glycerol	Invitrogen	15514-011
HisPur Cobalt Resin	Thermo Fisher	89966
I-CeuI Enzyme	New England Biolabs	R0699S
Image Stabilizer Plugin	https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
Imidazole	Millipore Sigma	I2399
In-Fusion Snap Assembly Master Mix	TaKaRa	638948
IPTG	Thermo Fisher	15529019
Isopropanol	Fisher Scientific	A451SK
Kanamycin	Fisher Scientific	AAJ67354AD
Large Orifice Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-134	1-200uL
LB Agar, Ready-Made Powder	Thermo Fisher	J75851-A1
Leupeptin Protease Inhibitor	Thermo Fisher	78435
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells	Gibco	10361012
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microscope	Nikon	Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective
Microscope Camera	ORCA-Fusion BT
Microscope Laser Unit	Andor iXon Ultra
Miller's LB Broth	Corning	46-050-CM
MOPS	Millipore Sigma	M3183
MOPS	Millipore Sigma	M3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)	New England Biolabs	C2987H
NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B6003S
NIS Elements	Nikon
NIS-Elements	Nikon
Nitrocellulose	LADD Research Industries	53152
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
pACEBac1 Vector	Geneva Biotech
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
PMSF	Millipore Sigma	78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)	Invitrogen	12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	QIAGEN	28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)	QIAGEN	28104
Quick CIP	New England Biolabs	M0525S
Rhodamine phalloidin	Invitrogen	R415
S.O.C. Medium	Invitrogen	15544034
SENP2 protease		PMID:17591783	Purified in the lab
Sf9 cells	Thermo Fisher	11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media Complete	Gibco	12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mL	Thermo Fisher	A52971
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Stericup Quick Release Vacuum Driven Disposable Filtration System	Millipore Sigma	S2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GL	Cytiva	29148721
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATP	New England Biolabs	B0202A
Tetracycline Hydrochloride	Millipore Sigma	T7660-5G
Tris	Millipore Sigma	10708976001
Triton X	American Bioanalytical	9002-93-1