Purificação baseada no sistema MultiBac e caracterização biofísica da miosina-7a humana

Resumo

Este protocolo detalha os procedimentos para produzir recombinantemente a holoenzima miosina-7a humana usando o sistema MultiBac Baculovirus e para estudar sua motilidade usando um ensaio de deslizamento de filamento in vitro personalizado.

Resumo

A miosina-7a é uma proteína motora à base de actina vital para os processos auditivos e visuais. Mutações na miosina-7a levam à síndrome de Usher tipo 1, a forma mais comum e grave de surdocegueira em humanos. Supõe-se que a miosina-7a forme um complexo de adesão transmembrana com outras proteínas de Usher, essenciais para a integridade estrutural-funcional dos fotorreceptores e das células ciliadas da cóclea. No entanto, devido aos desafios na obtenção de proteína pura e intacta, os mecanismos funcionais exatos da miosina-7a humana permanecem indefinidos, com estudos estruturais e biomecânicos limitados disponíveis. Estudos recentes mostraram que a miosina-7a de mamíferos é um complexo motor multimérico que consiste em uma cadeia pesada e três tipos de cadeias leves: cadeia leve reguladora (RLC), calmodulina e proteína 4 semelhante à calmodulina (CALML4). Ao contrário da calmodulina, o CALML4 não se liga a íons de cálcio. Tanto as calmodulinas sensíveis ao cálcio quanto as insensíveis são críticas para a miosina-7a de mamíferos para o ajuste fino adequado de suas propriedades mecânicas. Aqui, descrevemos um método detalhado para produzir holoenzima miosina-7a humana recombinante usando o sistema de expressão da proteína MultiBac Baculovirus. Isso produz quantidades de miligramas de proteína de comprimento total de alta pureza, permitindo sua caracterização bioquímica e biofísica. Apresentamos ainda um protocolo para avaliação de suas propriedades mecânicas e móveis usando ensaios de motilidade in vitro personalizados e microscopia de fluorescência. A disponibilidade da proteína miosina-7a humana intacta, juntamente com o protocolo detalhado de caracterização funcional descrito aqui, abre caminho para novas investigações sobre os aspectos moleculares da miosina-7a na visão e audição.

Introdução

As miosinas são proteínas motoras moleculares que interagem com a actina para conduzir vários processos celulares 1,2,3,4. Os seres humanos possuem 12 classes e 39 genes de miosina⁵, que estão envolvidos em uma ampla gama de funções fisiológicas, como contração muscular⁶ e processos sensoriais⁷. Cada molécula de miosina é um complexo multimérico composto por uma cadeia pesada e cadeias leves. A cadeia pesada é dividida em regiões de cabeça, pescoço e cauda. A cabeça contém sítios de ligação à actina e nucleotídeos que são responsáveis pela hidrólise do ATP e pela geração de força nos filamentos de actina². O pescoço é formado por vários motivos de QI α-helicoidais onde um conjunto específico de cadeias leves são ligadas. Juntos, eles funcionam como um braço de alavanca para amplificar as mudanças conformacionais do motor em grandes movimentos ^8,9,10. A cauda contém subdomínios específicos de classe e desempenha um papel regulador no ajuste da atividade motora da miosina e na mediação de interações com parceiros de ligação celular ^2,11.

A miosina-7a humana, membro das miosinas de classe 7, é essencial para os processos auditivos e visuais^12,13. Os motivos de QI da miosina-7a humana estão associados a uma combinação única de cadeias leves, incluindo a cadeia leve reguladora (RLC), calmodulina e proteína 4 semelhante à calmodulina (CALML4) ^{14 , 15 , 16} . Além de estabilizar o braço de alavanca, essas cadeias leves regulam as propriedades mecânicas da miosina-7a em resposta à sinalização de cálcio, uma característica que parece ser exclusiva da isoforma de mamíferos¹⁴.

Defeitos no gene que codifica a cadeia pesada da miosina-7a (MYO7A/USH1B) são responsáveis pela síndrome de Usher tipo 1, a forma mais grave de perda visual e auditiva combinada em humanos¹⁷. Além disso, o gene de cadeia leve CALML4 está entre os genes candidatos mapeados para conter o alelo causador de USH1H, outra variante da síndrome de Usher tipo 1^15,18. Na retina, a miosina-7a é expressa no epitélio pigmentar da retina e nas células fotorreceptoras¹³. Tem sido implicado na localização de melanossomos no epitélio pigmentar da retina (EPR) ¹⁹ e fagocitose de discos do segmento externo fotorreceptor pelas células RPE²⁰. Na orelha interna, a miosina-7a é encontrada principalmente nos estereocílios, onde desempenha um papel crítico no estabelecimento de feixes capilares e no bloqueio do processo de transdução mecanoelétrica 12,21,22.

Embora a importância da miosina-7a nas células sensoriais esteja bem estabelecida, seus mecanismos funcionais no nível molecular permanecem pouco compreendidos. Essa lacuna no conhecimento se deve em parte aos desafios na purificação da proteína intacta, especialmente a isoforma de mamíferos. Recentemente, um progresso significativo foi feito usando o sistema MultiBac para expressar recombinantemente a holoenzima¹⁴ completa da miosina-7a humana. Esse avanço possibilitou caracterizações estruturais e biofísicas dessa proteína motora, levando à descoberta de várias propriedades únicas da miosina-7a humana que são especificamente adaptadas para funções auditivas de mamíferos^14,23.

O sistema MultiBac é uma plataforma avançada de baculovírus / célula de inseto projetada especificamente para a expressão de complexos multiméricos eucarióticos ^24,25. Uma característica fundamental deste sistema é sua capacidade de hospedar vários de expressão gênica, cada um codificando uma subunidade do complexo, dentro de um único baculovírus MultiBac. A montagem dos de expressão multigênica é facilitada por meio de um chamado módulo de multiplicação: um local de endonuclease (HE) e um local BstXI projetado correspondente flanqueando os locais de clonagem múltipla (MCS). Este módulo permite a montagem iterativa de um único de expressão por restrição/ligação, aproveitando o fato de que os locais de restrição HE e BstXI são eliminados após sua ligação. Neste artigo, a cadeia pesada da miosina-7a humana, RLC, calmodulina e CALML4 são clonadas no módulo de multiplicação dentro do vetor pACEBac1 (Figura 1A), que são então montadas em um de expressão multigênica por meio do processo iterativo (Figura 1B). O multigênico de miosina-7a é integrado ao genoma baculoviral (bacmid) por meio da transposição do elemento mini-Tn7 do vetor pACEBac1 para o local-alvo mini-attTn7 no genoma (Figura 1C). Seguindo procedimentos para purificação de bacmid, produção de baculovírus e amplificação (Figura 1D, E), o baculovírus recombinante miosina-7a MultiBac é preparado e pode ser usado para produção de proteínas em larga escala (Figura 1F). Além disso, as cadeias leves de miosina-7a podem ser produzidas separadamente em E. coli e purificadas usando uma etiqueta His6-SUMO clivável 26,27,28. As cadeias leves purificadas são úteis para estudar sua dinâmica de ligação e regulação da miosina-7a.

A proteína miosina-7a purificada pode ser submetida a estudos estruturais, bioquímicos e biofísicos para obter informações sobre a regulação estrutural-funcional dessa proteína motora. Além disso, suas interações com a rede de actina e outras proteínas de ligação²⁹ podem ser examinadas usando uma variedade de abordagens de reconstituição in vitro. Os resultados dessas análises informarão as propriedades biofísicas dessa miosina, levando a uma compreensão mecanicista de como a miosina-7a impulsiona as alterações do citoesqueleto e, em última análise, molda a morfologia e a função únicas das células sensoriais. Neste artigo, detalhamos um fluxo de trabalho para o ensaio de deslizamento de filamentos de actina que foi especificamente adaptado para miosina-7a de mamíferos. O ensaio de deslizamento do filamento de actina é um ensaio robusto de motilidade in vitro que estuda quantitativamente o movimento de filamentos de actina fluorescentes impulsionados por um grande número de motores de miosina imobilizados em uma superfície de lamínula 30,31,32. As vantagens deste ensaio incluem sua simplicidade de configuração, requisitos mínimos de equipamento (um microscópio de fluorescência de campo amplo equipado com uma câmera digital) e alta reprodutibilidade. Além disso, como o movimento dos filamentos de actina é impulsionado por um conjunto de motores de miosina imobilizados, este ensaio é particularmente útil para estudar a motilidade de miosinas monoméricas, como a miosina-7a^14,33. Os protocolos incluem várias modificações, desde procedimentos experimentais até análises de imagem, especificamente adaptadas às propriedades móveis únicas da miosina-7a de mamíferos. Com a disponibilidade da proteína miosina-7a intacta e o protocolo de caracterização funcional descrito aqui, este artigo estabelece as bases para uma investigação mais aprofundada sobre os papéis moleculares da miosina-7a em processos fisiológicos e patológicos.

Protocolo

NOTA: Aqui descrevemos um protocolo para sintetizar a holoenzima miosina-7a humana intacta e caracterizar sua motilidade in vitro. Este protocolo é dividido em três seções: primeiro, expressar a miosina-7a humana usando o sistema de expressão da proteína baculovírus MultiBac; Em segundo lugar, purificar as cadeias leves de miosina-7a separadamente usando o sistema E.coli His6-SUMO; e, por último, estudar a motilidade da miosina-7a humana usando o ensaio de deslizamento de filamento de actina.

1. Produção complexa de miosina-7a baseada no sistema MultiBac

1. Criação de multigênico de baculovírus para expressar o complexo miosina-7a humano (16 dias)
   NOTA: Requer um ciclo de clonagem (4 dias) para inserir os cDNAs das subunidades de miosina-7a nos vetores pACEBac1 e três ciclos de clonagem para completar a ligação passo a passo de todos os módulos de multiplicação necessários para expressar o complexo miosina-7a, resultando em um total de 16 dias.
   1. Clone os cDNAs que codificam a cadeia pesada de miosina-7a (HC), calmodulina, CALML4 e RLC nos vetores pACEBac1 usando um kit comercial seguindo os protocolos do fabricante (consulte a Tabela de Materiais; Figura 1A). Uma etiqueta FLAG é inserida no terminal C do HC de miosina-7a para auxiliar na purificação.
      NOTA: A miosina-7a de mamíferos é produzida como duas isoformas de splicing, diferindo apenas por um segmento de 11 aminoácidos no terminal N²³. Essa curta extensão N-terminal desempenha um papel crítico na regulação da atividade ATPase da miosina-7a¹⁴. Foi demonstrado que a adição de uma etiqueta N-terminal pode interromper a regulação normal por essa extensão N-terminal e reduzir significativamente a atividade enzimática e a motilidade do motor¹⁴. Portanto, uma etiqueta FLAG C-terminal é empregada para evitar a interrupção da regulação natural da proteína.
   2. Construa o de expressão multigênica para a holoenzima miosina-7a usando endonuclease homing / multiplicação BstXI conforme descrito abaixo ( Figura 1B ).
      NOTA: A endonuclease de homing I-CeuI produz extremidades coesivas que são compatíveis com as extremidades geradas pelo digesto BstXI. Após a ligação, é criado um local de restrição híbrido de endonuclease / BstXI que não pode ser cortado por nenhuma das enzimas. O mesmo procedimento pode ser repetido para integrar mais módulos de multiplicação. Se vários locais de restrição para I-CeuI e BstXI estiverem presentes nas construções de inserção ou vetor, esses locais adicionais devem ser eliminados por mutagênese dirigida ao local para garantir que os locais de corte I-CeuI e BstXI sejam únicos.
   3. Preparação da pastilha: Digerir a construção da pastilha (por exemplo, pACEBac-M7a HC) com a endonuclease I-CeuI (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, purificar o plasmídeo linearizado usando um Kit de Purificação por PCR (ver Tabela de Materiais). Além disso, digerir o plasmídeo linearizado com BstXI (ver Tabela de Materiais), separar o fragmento contendo o de expressão gênica usando eletroforese em gel e purificar usando um Kit de Extração em Gel (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: I-CeuI e BstXI requerem diferentes condições de buffer, de acordo com os protocolos do fabricante, para atingir 100% de atividade. Além disso, um corte completo com I-CeuI requer um mínimo de 3 h, enquanto o BstXI requer apenas 15 min de tempo de incubação. As digestões, portanto, precisam ser realizadas sequencialmente.
   4. Preparação do vetor: Linearize a construção do vetor (por exemplo, pACEBac-CaM) por meio da digestão de BstXI. A fosfatase alcalina está incluída na preparação do vetor para evitar que o plasmídeo vetorial se ligue a si mesmo (consulte a Tabela de Materiais). Obtenha o produto da digestão por eletroforese e purifique-o com um Kit de Extração em Gel.
   5. Ligação: Ligue a inserção tratada com I-CeuI / BstXI e o vetor tratado com BstXI com T4 DNA Ligase (consulte a Tabela de Materiais). Realize reações de ligação à temperatura ambiente (20 ° C -25 ° C) por 10 min com uma proporção de 1: 1 em massa do DNA de inserção para o DNA do vetor, mantendo a massa total próxima a 100 ng em cada reação de ligação.
   6. Transformação e análise de plasmídeo: Transforme as misturas de ligação em células DH5α (consulte a Tabela de Materiais) seguindo as recomendações do fabricante e rastreie as colônias positivas quanto à resistência à gentamicina. Purifique os plasmídeos usando um kit comercial (consulte a Tabela de Materiais) e verifique os clones corretos (por exemplo, plasmídeos contendo M7a HC e CaM) com base em padrões específicos de digestão de restrição e sequenciamento de DNA das inserções.
   7. Integração de de expressão gênica múltipla: Repita as etapas 1.1.2 a 1.1.6 para integrar de genes adicionais que expressam outras subunidades de miosina-7a.
2. Produção e purificação de DNA bacmid recombinante (4 dias; Figura 1C).
   NOTA: Dia 1 - Transformação bacteriana e crescimento de colônias transformadas. Dias 2-3 - Cultivo de colônias e triagem para uma transformação bem-sucedida. Dia 3 - Seleção e seleção de colônias positivas, iniciando a inoculação durante a noite. Dia 4 - Purificação do DNA bacmid.
   1. Transformar as células competentes em DH10Bac (ver Tabela de Materiais) com 1 ng do plasmídeo pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM sequenciado seguindo as recomendações do fabricante.
   2. Colocar 20-200 μL das células em uma placa de ágar contendo 50 μg / mL de canamicina, 7 μg / mL de gentamicina, 10 μg / mL de tetraciclina, 100 μg / mL de indolil-β-galactosídeo halogenado e 40 μg / mL de IPTG (ver Tabela de Materiais) e incubar a placa a 37 ° C por 48 h para permitir o desenvolvimento de cor azul profundo em clones negativos.
      NOTA: O indolil-β-galactosídeo halogenado cora as colônias que continuam a expressar LacZ (indicando que a transposição não foi bem-sucedida), permitindo a seleção de colônias brancas onde a transposição foi bem-sucedida.
   3. Selecione cuidadosamente uma colônia branca isolada e cultive células durante a noite em 5 mL de meio LB contendo 50 μg / mL de canamicina, 7 μg / mL de gentamicina e 10 μg / mL de tetraciclina a 37 ° C em um agitador orbital a 225 rpm.
   4. Centrifugue a cultura a 2.465 x g por 10 min para granular a E coli. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 300 μL de tampão P1 do kit.
      NOTA: Embora os tampões do kit Miniprep sejam usados aqui, o protocolo para purificar o produto bacmid varia do protocolo fornecido com o kit.
   5. Adicione 300 μL do tampão P2 do kit. Misture invertendo os tubos algumas vezes e depois incube em temperatura ambiente por 3 min.
   6. Adicione 300 μL do tampão N3 do Kit e misture por inversão para interromper a reação de lise. Centrifugar a 17.885 x g durante 10 min a 4 °C.
   7. Transferir o sobrenadante para um tubo estéril limpo e repetir a centrifugação durante mais 10 minutos.
   8. Transfira 800 μL do sobrenadante para outro tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mL (ver Tabela de Materiais) e adicione 600 μL de isopropanol frio (ver Tabela de Materiais), misturando por inversão rigorosa. Em seguida, centrifugue a 17,885 x g por 20 min a 4 °C.
   9. Descarte o sobrenadante e localize o pequeno pellet branco. Lave o pellet com 800 μL de etanol a 70% frio (consulte a Tabela de Materiais) e centrifugue a 17.885 x g por 5 min a 4 °C. Adicione etanol com cuidado ao longo da parede do tubo para evitar perturbar o pellet.
   10. Rejeitar o sobrenadante e repetir a lavagem com etanol uma vez. Seque o pellet ao ar livre em temperatura ambiente por 5 min. Aspire cuidadosamente o excesso de líquido, se necessário.
   11. Dissolva o pellet com 20 μL de tampão EB do Kit. Certifique-se de que o pellet esteja totalmente dissolvido sacudindo o tubo ou misturando suavemente pipetando. Determine a concentração usando um espectrofotômetro (consulte a Tabela de Materiais).
   12. Ajustar o volume do tampão conforme necessário para atingir a concentração de bacmid a cerca de 1 μg/μL. Conservar o ADN bacmid a 4 °C até estar pronto para a produção do vírus P0.
       NOTA: O bacmid purificado pode ser mantido a 4 °C e permanece eficaz por vários meses. Vimos transfecções bem-sucedidas com produtos bacmid de até 1 ano de idade. Em alternativa, o bacmid pode ser aliquotado e armazenado a -20 °C. Vários ciclos de congelamento/descongelamento devem ser evitados, pois diminuem a eficiência da transfecção.
3. Transfectar células de insetos Sf9 com bacmid para produzir baculovírus recombinante (6 dias; Figura 1D)
   NOTA: Dia 1 - Transfecção de células com DNA bacmid. Dias 2-6 - Observe o crescimento e a expressão das células. Dia 6 - Coleta do vírus P0.
   1. Adicione células Sf9 em meios de cultura (consulte a Tabela de Materiais) a uma placa de 6 poços a uma concentração de 0,33 x 10⁶ células/mL com 3 mL por poço. Deixe a placa descansar em temperatura ambiente por 30 min para permitir que as células se prendam ao fundo da placa.
   2. Para cada poço, prepare uma mistura de transfecção combinando 10 μL de reagente de transfecção lipídica catiônica (consulte a Tabela de Materiais) com 250 μL de meio de Meio Essencial Mínimo (MEM) aprimorado (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo de microcentrífuga estéril. Misture por inversão e incube em temperatura ambiente por 5 min.
   3. Adicionar 1 μg (com base na concentração determinada no passo 1.2.12) de bacmid de miosina-7a não diluído à mistura de transfecção. Misture por inversão e incube em temperatura ambiente por 5 min.
   4. Distribua igualmente toda a mistura de DNA-lipídio gota a gota nos poços. Deixe um poço para células não transfectadas como controle negativo.
   5. Sele a placa de 6 poços com filme (consulte a Tabela de Materiais) e incube a 27 ° C por 6 dias. Observe o crescimento e o desapego ao longo desse tempo. Se houver uma etiqueta fluorescente presente na construção, verifique o desenvolvimento de fluorescência (Figura 2).
   6. Quando as células transfectadas mostrarem sinais de infecção em estágio avançado, transfira o meio contendo o vírus dos poços infectados para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 805 x g por 10 min.
   7. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico limpo de 15 mL, envolva-o em papel alumínio e armazene-o a 4 ° C. Este produto agora é o vírus P0 e pode ser armazenado e usado de forma eficaz por até quatro meses a partir de nossa experiência.
4. Amplificar o estoque de baculovírus (3-5 dias; Figura 1E)
   1. Prepare 100 mL (ou volume desejado) de células Sf9 a uma concentração de 2 x 10⁶ células / mL em meio de cultura de células Sf9 em um frasco Erlenmeyer de 250 mL (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Adicionar a proporção 1:100 (v/v) do stock do vírus P0 à cultura de suspensão de células Sf9 e incubar a 27 °C num agitador orbital a 135 rpm.
   3. Monitore o crescimento a cada 24 h até que as células atinjam ~ 90% de morte celular. Uma vez nesta faixa, centrifugar a suspensão celular a 500 x g por 10 min e coletar o sobrenadante contendo o vírus P1.
   4. Filtre o sobrenadante usando filtragem a vácuo de 0,22 μm (consulte a Tabela de Materiais). Mantenha o produto filtrado no escuro e armazene-o a 4 °C. Este produto agora é o vírus P1.
      NOTA: O título do vírus diminui com o armazenamento de longo prazo a 4 °C. Considere fazer um novo estoque de vírus se ele tiver sido armazenado por mais de 4 meses, ou titular o estoque de vírus antes de usar na expressão³⁴.
5. Expressão de proteínas (60 -72 h entre o início da expressão e a coleta do pellet celular; Figura 1E)
   1. Prepare células Sf9 em crescimento em fase logarítmica a uma concentração de 2 x 10⁶ células/mL e adicione o vírus P1 na proporção de 12 mL de vírus para 300 mL de suspensão celular.
      NOTA: O rendimento da proteína é de aproximadamente 1 mg/L. Recomenda-se o uso de um mínimo de 1,5 L de suspensão celular para a expressão desta proteína.
   2. Cultivar as células a 27 °C num agitador orbital a 135 rpm durante cerca de 60 h.
      NOTA: Pequenas amostras podem ser coletadas em diferentes momentos e analisadas usando géis SDS para avaliar os níveis de expressão de proteínas. Além disso, se as proteínas forem fundidas com marcadores fluorescentes, os níveis de expressão podem ser avaliados usando microscopia de fluorescência. As células devem ser colhidas o mais tardar no início da morte celular.
   3. Centrifugar a suspensão celular a 3,735 x g durante 5 min a 4 °C para peletar as células. Os pellets podem ser armazenados a -80 °C até uso posterior ou preservados para armazenamento de longo prazo. Normalmente usamos pellets celulares dentro de semanas, mas recuperamos a proteína ativa vários meses após o congelamento.
6. Purificação de proteínas (2 dias; Figura 1F)
   NOTA: Dia 1 - Extração e purificação de proteínas usando cromatografia de afinidade FLAG. Dia 2 - Alíquotas e congelamento de amostras após diálise noturna. O protocolo descrito abaixo é para purificar a miosina-7a de pellets de células de 1,5 L.
   1. Prepare o Master Buffer contendo 10 mM MOPS (pH 7.2), 500 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 μg/mL de leupeptina e 100 μg/mL de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF). Filtre-o com um filtro de poros de 0,22 μm e armazene o tampão a 4 °C (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: O PMSF é instável em soluções aquosas. Prepare a solução-mãe PMSF como 1 M em etanol 100% e armazene-a a -20 °C por até 6 meses.
   2. Prepare 75 mL de tampão de extração suplementando o tampão mestre com 3 comprimidos inibidores de protease livres de EDTA, 2 mM de ATP e 0,1 mM de ditiotreitol (DTT; ver Tabela de Materiais).
   3. Adicione 75 mL de tampão de extração ao pellet enquanto ainda está congelado. Deixe o pellet no tampão de extração no gelo até descongelar. Use uma pipeta sorológica para quebrar o pellet para acelerar o processo de descongelamento.
   4. Usando uma ponta de 1/2 polegada (13 mm), sonice a ressuspensão no gelo por 10 min a 50% de amplitude, 5 s ligado, 5 s desligado.
   5. Centrifugar o lisado total a 33,746 x g durante 30 min a 4 °C. Durante a centrifugação, prepare 1,5 mL de resina FLAG lavando 3 mL da pasta a 50% de resina de afinidade Anti-FLAG (ver Tabela de Materiais) com 40 mL de PBS. Pulverizar a resina centrifugando a 800 x g durante 2 min a 4 °C. Remova cuidadosamente o PBS sem mexer na resina.
   6. Adicionar o sobrenadante da centrifugação do lisado à resina lavada e incubar com rotação contínua a 4 °C durante 1 h.
   7. Pellet a resina centrifugando a 800 x g por 2 min a 4 ° C. Sem perturbar a resina, remova o sobrenadante.
   8. Ressuspenda a resina em 40 mL de Master Buffer e centrifugue a 800 x g por 2 min a 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a resina. Repita a lavagem 1x.
   9. Transfira a resina lavada para duas colunas de centrifugação de polipropileno (consulte a Tabela de Materiais). Lave cada coluna 1x com 2 mL de Master Buffer. Remova o buffer mestre centrifugando a coluna a 1.400 x g por 2 min a 4 °C. A resina será embalada na parte inferior.
   10. Prepare um tampão de eluição adicionando 100 μg/mL de peptídeo FLAG (consulte a Tabela de Materiais) ao tampão mestre.
   11. Adicione 300 μL de tampão de eluição à resina embalada em cada coluna e misture suavemente pipetando para garantir que a resina esteja completamente hidratada pelo tampão de eluição. Deixe a resina incubar com o tampão de eluição no gelo por 10 min.
   12. Centrifugue as colunas a 1.400 x g por 2 min a 4 °C. Transfira o fluxo para um tubo de microcentrífuga limpo e mantenha-o no gelo. Esta é a primeira fração.
   13. Repita as etapas 1.6.11 a 1.6.12 de modo que 4 frações sejam coletadas de cada coluna.
   14. Realize a eletroforese^{em gel SDS-PAGE 35} com as frações de eluição para determinar suas concentrações relativas. Enquanto o gel funciona, prepare um tampão de diálise contendo 500 mM de NaCl, 10 mM MOPS, 2 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA e 1 mM DTT.
   15. Combine as frações mais concentradas. Transferir a amostra para uma de diálise MWCO de 10K (ver Tabela de Materiais) e dialisar durante a noite a 4 °C. Use 1 L de tampão de diálise para aproximadamente 500 μL de proteína. Realize pelo menos três trocas do tampão de diálise.
       NOTA: A coluna de rotação e o método de eluição por centrifugação permitem que as proteínas sejam eluídas em altas concentrações (0,5-1 mg/mL). Geralmente não são necessárias etapas de concentração adicionais. No entanto, se forem desejadas proteínas mais concentradas, carregue as amostras em tubos de concentração de 100.000 MWCO (consulte a Tabela de Materiais) e centrifugue a 1.400 x g por 5 min a 4 ° C. Repita este processo até atingir o volume desejado da solução proteica.
   16. No dia seguinte, descarregue cuidadosamente a amostra do de diálise. Alíquota de 15 μL por tubo de PCR e coloque os tubos em um recipiente de nitrogênio líquido para congelamento rápido. As proteínas congeladas podem ser armazenadas a -80 °C para uso futuro (Figura 3A).
       NOTA: O rendimento da miosina-7a usando este método é geralmente entre 0,5 e 1 mg/L.

2. Purificação das cadeias leves RLC e CALML4 usando o sistema E. coli His6-SUMO (7 dias)

NOTA: Dias 1-4 - Clonagem e purificação dos plasmídeos. Dia 5 - Transformação bacteriana. Dias 6-7 - Purificação, alíquota e congelamento das proteínas finais.

1. Clone os cDNAs que codificam RLC e CALML4 em um vetor pET-SUMO, que contém uma sequência His6 anterior ao SUMO para ajudar na purificação. Quando necessário, o domínio His6-SUMO pode ser clivado da proteína de fusão usando uma protease SENP2^26,36.
2. Para cada proteína de cadeia leve, transforme as células competentes de BL21 E. coli (ver Tabela de Materiais) com o plasmídeo e inicie uma cultura líquida noturna de 5 mL com as células transformadas.
3. No dia seguinte, inocular a cultura noturna de 5 mL em 1 L de caldo Luria-Bertani (LB) contendo 50 μg/mL de canamicina. Deixar a cultura crescer a 37 °C com agitação contínua a 270 rpm até que a densidade óptica (O.D.) atinja 0,6 - 1,0.
   NOTA: O valor OD dobra aproximadamente a cada 20 minutos quando atinge 0.2. Monitore o OD com frequência.
4. Inicie a expressão da proteína adicionando 250 μM de isopropil b-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) à cultura. Incubar durante 3-5 h a 37 °C ou 16 °C durante a noite, agitando continuamente a 270 rpm.
5. Pulverizar a E. coli centrifugando a suspensão celular a 4.347 x g durante 15 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
6. Prepare o tampão de ressuspensão contendo 50 mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, 5 mM de imidazol e 10% de glicerol, pH 7,4 (ver Tabela de Materiais). Mantenha no gelo.
7. Ressuspenda o pellet em 15-25 mL de tampão de ressuspensão e transfira a suspensão para um béquer limpo, ajustando o volume total para 35 mL. Adicione DNase e RNase à suspensão na proporção de 1:1000 (v/v) para uma concentração final de 1 μg/mL e 2 μg/mL, respectivamente. Adicione um comprimido inibidor de protease sem EDTA, 4 mM de 2-mercaptoetanol e 1% de Triton X à suspensão (consulte a Tabela de Materiais). Mantenha no gelo por 20 min.
8. Sonicar a suspensão de pellets em água gelada com 1 s ligado e 1 s desligado por um total de 1 min a 100% de amplitude. Deixar o lisado homogeneizado a 4 °C com rotação contínua durante 2 h.
   NOTA: A adição de Triton X ajuda na lise das células em preparação para a sonicação.
9. Centrifugue os lisados a 26.900 x g por 45 min a 4 °C. Enquanto isso está ocorrendo, comece a preparar a resina de cobalto (consulte a Tabela de Materiais). Use 500 μL de resina de cobalto para 1 L de cultura de E. coli . Lave a resina 2x com água ultrapura e uma vez com tampão de suspensão centrifugando a 4.347 x g por 2 min a 4 °C.
10. Após a centrifugação do lisado, combinar o sobrenadante com a resina lavada e agitar suavemente a 4 °C durante 30 min.
11. Centrifugar a suspensão de resina lisada a 4,347 x g durante 2 min a 4 °C. A resina será embalada no fundo do tubo. Sem perturbar a resina, remova o sobrenadante.
12. Lave a resina com tampão de ressuspensão centrifugando a 4.347 x g por 2 min a 4 °C. Remova o sobrenadante. Repita as lavagens até que o sobrenadante fique incolor.
13. Prepare o tampão de eluição contendo 50 mM de Tris HCl, 300 mM de NaCl, 5 mM de Imidazol, 10% de glicerol, 4 mM de 2-mercaptoetanol e 0,25 μM de protease SENP2 (ver Tabela de Materiais). Mantenha-o no gelo.
14. Ressuspenda a resina em 1 mL de tampão de ressuspensão e incube-a durante a noite a 4 ° C com rotação contínua.
15. No dia seguinte, centrifugue a 4.347 x g por 2 min para peletizar a resina. Colete o sobrenadante, que contém a proteína de cadeia leve clivada e a protease.
16. Adicione 1 mL de tampão de eluição à resina. Repita a centrifugação e colete o sobrenadante.
17. Remover a protease por cromatografia líquida de proteínas rápidas (FPLC). Resumidamente, prepare a coluna de exclusão de tamanho (consulte a Tabela de Materiais) com um tampão contendo 50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10% de glicerol e 5 mM de DTT (pH 7,4). Concentrar o sobrenadante a 500 μL utilizando um tubo de concentração de 10.000 MWCO. Carregar a amostra concentrada numa coluna ligada a um sistema de cromatografia automatizado utilizando uma seringa, fluir com um tampão contendo 50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10% de glicerol e 5 mM de DTT (pH 7,4). Monitorizar as fracções recolhidas através de uma espectrofotometria ultravioleta. Recolha as fracções proteicas com um peso molecular correspondente às cadeias leves.
    NOTA: A protease também pode ser removida por cromatografia de afinidade se uma etiqueta de purificação (por exemplo, etiqueta GST) for projetada na protease.
18. Execute um gel SDS-PAGE com as frações de eluição para determinar a pureza e as concentrações relativas das proteínas de cadeia leve em cada fração. As frações desejadas são aquelas que contêm proteínas de cadeia leve concentradas sem bandas de protease visíveis. Combine as frações proteicas desejadas e concentre-as usando um tubo concentrador de 10.000 MWCO³⁵.
19. Congelar rapidamente alíquotas de proteínas em azoto líquido e transferir imediatamente para -80 °C para armazenamento a longo prazo (figura 3B).
    NOTA: O rendimento de RLC e CALML4 usando o sistema E. coli His6-SUMO é de cerca de 1-2 mg / L.

3. Ensaio de deslizamento de filamento de actina adaptado à miosina-7a (3 h)

NOTA: Os métodos usados nesta seção são semelhantes aos descritos para outras miosinas³¹ , com as principais modificações sendo a incubação e aplicação de miosina em tampão de alta força iônica e o longo intervalo necessário para obter uma medição precisa dos deslocamentos quadro a quadro.

1. Preparar 20 μM de actina filamentosa (F-actina) polimerizando actina globular (G-actina) em tampão de polimerização (50 mM KCl, 25 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7,0)) a 4 °C durante a noite. Rotule a F-actina adicionando 1,2x excesso molar de rodamina-faloidina (consulte a Tabela de Materiais). Cubra com papel alumínio e incube no gelo por pelo menos 2 h.
   NOTA: A G-actina pode ser adquirida de fornecedores comerciais (ver Tabela de Materiais) ou purificada do pó de acetona muscular de coelho^31,37. A F-actina marcada pode ser armazenada a 4 °C por até 2 meses nessa concentração.
2. Prepare uma câmara de fluxo conforme descrito anteriormente³¹. Resumidamente, coloque duas tiras de fita dupla-face com 2-3 mm de distância em uma lâmina de microscópio limpa e tratada com nitrocelulose (consulte a Tabela de Materiais). Coloque a lamínula com o lado da nitrocelulose voltado para baixo nas tiras, criando uma câmara de fluxo com um volume aproximado de 10 μL (Figura 4).
3. Realização de ensaio de deslizamento de filamento de actina
   1. À câmara de fluxo, adicione um volume de câmara de 0,2 mg / mL de proteína miosina-7a humana purificada em tampão de motilidade de NaCl 500 mM (500 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA (pH 7,4)). Deixe incubar por 5 min em temperatura ambiente.
      NOTA: É fundamental adicionar miosina-7a em um tampão com alto teor de sal, pois isso alivia o estado autoinibido e permite que a miosina-7a adira à superfície na conformação ativada.
   2. Lave a câmara de fluxo com volumes de três câmaras de 1 mg/mL BSA (consulte a Tabela de Materiais) em tampão de motilidade de NaCl 150 mM (150 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)) puxando o líquido usando um pano limpo na saída para absorver o excesso de líquido. Incube por 1 min após a^3ª lavagem.
   3. Fluxo de um volume de câmara de F-actina marcada com faloidina de rodamina 10 nM em tampão de motilidade de NaCl de 150 mM através da câmara de fluxo. Monitore a ligação dos filamentos de actina à superfície sob um microscópio fluorescente com objetiva de 100x. A densidade dos filamentos de actina deve ser ótima (Figura 5A), garantindo filamentos suficientes no campo de visão para rastreamento, mas esparsos o suficiente para evitar a sobreposição de vários filamentos, o que complica o rastreamento.
   4. Lave a câmara de fluxo com volumes de três câmaras de tampão de motilidade de NaCl 150 mM para remover filamentos de actina não ligados e excesso de rodamina-faloidina.
   5. Inicie a motilidade adicionando um volume de câmara do tampão final (200 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 50 mM DTT, 2 mM ATP, 2,5 mg / ml de glicose, 100 μg / mL de glicose oxidase, 2 μM RLC, 2 μM CaM, 2 μM CALML4).
   6. Registre imagens em um microscópio de fluorescência usando excitação de 561 nm para visualizar a actina marcada com faloidina de rodamina. Encontre uma área na lâmina com a densidade de actina desejada (Figura 5A) e capture imagens a cada 30 s por 30 min.
      NOTA: A velocidade da miosina-7a em mamíferos é de aproximadamente 5 nm / s. Ao definir a taxa de quadros de aquisição, é importante garantir que os deslocamentos dos filamentos entre os quadros sejam longos o suficiente (mais de um pixel) para permitir um rastreamento preciso. Movimentos de subpixel entre quadros podem causar uma superestimação da velocidade. A taxa de quadros de 30 s permite que os filamentos de actina se movam cerca de 150 nm entre os quadros, correspondendo a mais de dois pixels no microscópio. No entanto, deve-se tomar cuidado para que um deslocamento significativo possa ser observado no microscópio que está sendo usado. Se disponível, a gravação de várias posições pode ser usada para coletar simultaneamente vários campos de visão para análise.
4. Analisar o movimento dos filamentos de actina usando o programa FAST (instalado em um Mac)³⁸.
   NOTA: O programa FAST usado aqui é apenas uma das muitas opções para quantificar o movimento do filamento. Optamos por usar o FAST porque é automatizado, rápido e não requer software pago. Outras opções incluem algoritmos baseados em MATLAB, como FIESTA, métodos baseados em ImageJ/FIJI, como MTrack2 e Manual Tracking, e métodos baseados em Python, como Philament³⁹.
   1. Baixe e instale o programa FAST (github.com/NeilBillington/FASTrack3 - versão compatível com python3 com um módulo adicional para conversão de arquivos nd2. NB: A versão original do python2 pode ser encontrada em github.com/turalaksel/FASTrack).
   2. Execute o programa FAST conforme descrito em³⁸ usando um valor de tolerância de 33 para reter apenas os filamentos em movimento suave.
      NOTA: Se as imagens contiverem problemas mecânicos com o palco ou com a coleta de várias séries simultaneamente, os filmes devem primeiro ser estabilizados. Para isso, recomendamos o plugin FIJI Image Stabilizer, disponível para download no seguinte endereço - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
   3. Use o programa FAST para analisar as imagens .tif recém-criadas, definindo primeiro os valores -xmax e -ymax. Eles definem os parâmetros para a saída do gráfico de dispersão pelo programa e representam o comprimento de filamento mais longo (em nm) e a velocidade máxima do filamento (em nm/s). Usamos 20.000 nm para -xmax e 20 nm/s para -ymax neste exemplo para garantir que todos os dados sejam capturados (Figura 5D).
   4. Use -px para definir o tamanho do pixel da imagem adquirida, que aqui será de 65 nm, e -minv para definir a velocidade mínima (em nm/s) necessária de um filamento para inclusão na análise. Para a baixa velocidade da miosina-7a neste exemplo, use 0,1 nm/s.
   5. Use -maxd para definir a distância máxima permitida entre os quadros para que os filamentos sejam vinculados. Isso é definido para evitar a vinculação de filamentos separados entre quadros e, neste exemplo, usamos o padrão de 2000 nm.
   6. Use-pt para definir a tolerância para flutuações nas velocidades dos filamentos e incluir apenas filamentos com movimentos suaves. Este exemplo usa um limite de tolerância de 33%. Isso significa que os filamentos com um desvio padrão de velocidade maior que 33% da média de velocidade serão excluídos de análises posteriores.
   7. Por fim, use -d para indicar a pasta que contém as pilhas de .tif para análise. Toda a string de comando com os parâmetros e valores fornecidos será: fast -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [nome da pasta contendo filmes].
      NOTA: O programa FAST produzirá gráficos de dispersão (Figura 5D) com seus dados brutos associados, que podem ser extraídos para análise e visualização em outros programas (Figura 5C). Ele também produzirá um gráfico dos caminhos dos filamentos rastreados (Figura 5B), que deve ser usado para verificar se o rastreamento está funcionando conforme o esperado. Exemplos dos gráficos e outras visualizações de dados possíveis estão incluídos abaixo.

Resultados

O complexo miosina-7a purificado e as proteínas de cadeia leve podem ser avaliados por eletroforese em gel SDS-PAGE, conforme mostrado na Figura 3. A banda acima do marcador de 200 kDa corresponde à cadeia pesada da miosina-7a (255 kDa). As três bandas que migram entre os marcadores de 22 e 14 kDa de cima para baixo são RLC (20 kDa), calmodulina e CALML4, respectivamente. Embora a calmodulina e o CALML4 tenham um peso molecular semelhante de aproximadame...

Discussão

Apresentado aqui é um protocolo detalhado para a produção de proteína miosina-7a humana recombinante a partir de células de insetos. Embora o sistema Sf9 / baculovírus tenha sido usado para produzir uma variedade de miosinas 40,41,42,43, apenas recentemente a miosina-7a de mamíferos foi purificada com sucesso usando o sistema de baculovírus MultiBac¹⁴.<...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
1X FLAG Peptide	GenScript	N/A	Custom peptide synthesis
22x22mm No. 1.5 coverslips	VWR	48366-227
250 mL Conical Centrifuge Tubes	Nunc	376814
250 mL Vented Erlenmyer Shaker Flask	IntelixBio	DBJ-SF250VP
2-Mercaptoethanol	VWR	M131
75x25x1 mm Vistavision microscope slides	VWR	16004-42
Actin Protein (>99% Pure)	Cytoskeleton	AKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220
ATP	Millipore Sigma	A7699
ATP	Millipore Sigma	A7699
Bio-Spin Disposable Chromatography Column	Bio-Rad	732-6008
BL21 Competent E. coli	New England Biolabs	C2530H
Bluo-Gal	Thermo Fisher	15519028
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	5470
BstXI Enzyme	New England Biolabs	R0113S
Calmodulin	Millipore Sigma	208694
Catalase	Millipore Sigma	C40
Champion pET-SUMO Expression System	Thermo Fisher	K30001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche Diagnostics	5056489001
Cutsmart Buffer	New England Biolabs	B6004S
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DNase I, Spectrum Chemical	Fisher Scientific	18-610-304
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
Ethanol	Thermo Fisher	BP2818
ExpiFectamine Sf Transfection Reagent	Gibco	A38915
FAST program	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements;
Fisherbrand Model 505 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB505110
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-064	10 mg/mL in distilled water
Glucose	Millipore Sigma	G5767
Glucose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Glycerol	Invitrogen	15514-011
HisPur Cobalt Resin	Thermo Fisher	89966
I-CeuI Enzyme	New England Biolabs	R0699S
Image Stabilizer Plugin	https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
Imidazole	Millipore Sigma	I2399
In-Fusion Snap Assembly Master Mix	TaKaRa	638948
IPTG	Thermo Fisher	15529019
Isopropanol	Fisher Scientific	A451SK
Kanamycin	Fisher Scientific	AAJ67354AD
Large Orifice Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-134	1-200uL
LB Agar, Ready-Made Powder	Thermo Fisher	J75851-A1
Leupeptin Protease Inhibitor	Thermo Fisher	78435
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells	Gibco	10361012
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microscope	Nikon	Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective
Microscope Camera	ORCA-Fusion BT
Microscope Laser Unit	Andor iXon Ultra
Miller's LB Broth	Corning	46-050-CM
MOPS	Millipore Sigma	M3183
MOPS	Millipore Sigma	M3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)	New England Biolabs	C2987H
NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B6003S
NIS Elements	Nikon
NIS-Elements	Nikon
Nitrocellulose	LADD Research Industries	53152
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
pACEBac1 Vector	Geneva Biotech
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
PMSF	Millipore Sigma	78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)	Invitrogen	12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	QIAGEN	28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)	QIAGEN	28104
Quick CIP	New England Biolabs	M0525S
Rhodamine phalloidin	Invitrogen	R415
S.O.C. Medium	Invitrogen	15544034
SENP2 protease		PMID:17591783	Purified in the lab
Sf9 cells	Thermo Fisher	11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media Complete	Gibco	12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mL	Thermo Fisher	A52971
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Stericup Quick Release Vacuum Driven Disposable Filtration System	Millipore Sigma	S2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GL	Cytiva	29148721
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATP	New England Biolabs	B0202A
Tetracycline Hydrochloride	Millipore Sigma	T7660-5G
Tris	Millipore Sigma	10708976001
Triton X	American Bioanalytical	9002-93-1