Purificação baseada no sistema MultiBac e caracterização biofísica da miosina-7a humana

Resumo

Este protocolo detalha os procedimentos para produzir recombinantemente a holoenzima miosina-7a humana usando o sistema MultiBac Baculovirus e para estudar sua motilidade usando um ensaio de deslizamento de filamento in vitro personalizado.

Resumo

A miosina-7a é uma proteína motora à base de actina vital para os processos auditivos e visuais. Mutações na miosina-7a levam à síndrome de Usher tipo 1, a forma mais comum e grave de surdocegueira em humanos. Supõe-se que a miosina-7a forme um complexo de adesão transmembrana com outras proteínas de Usher, essenciais para a integridade estrutural-funcional dos fotorreceptores e das células ciliadas da cóclea. No entanto, devido aos desafios na obtenção de proteína pura e intacta, os mecanismos funcionais exatos da miosina-7a humana permanecem indefinidos, com estudos estruturais e biomecânicos limitados disponíveis. Estudos recentes mostraram que a miosina-7a de mamíferos é um complexo motor multimérico que consiste em uma cadeia pesada e três tipos de cadeias leves: cadeia leve reguladora (RLC), calmodulina e proteína 4 semelhante à calmodulina (CALML4). Ao contrário da calmodulina, o CALML4 não se liga a íons de cálcio. Tanto as calmodulinas sensíveis ao cálcio quanto as insensíveis são críticas para a miosina-7a de mamíferos para o ajuste fino adequado de suas propriedades mecânicas. Aqui, descrevemos um método detalhado para produzir holoenzima miosina-7a humana recombinante usando o sistema de expressão da proteína MultiBac Baculovirus. Isso produz quantidades de miligramas de proteína de comprimento total de alta pureza, permitindo sua caracterização bioquímica e biofísica. Apresentamos ainda um protocolo para avaliação de suas propriedades mecânicas e móveis usando ensaios de motilidade in vitro personalizados e microscopia de fluorescência. A disponibilidade da proteína miosina-7a humana intacta, juntamente com o protocolo detalhado de caracterização funcional descrito aqui, abre caminho para novas investigações sobre os aspectos moleculares da miosina-7a na visão e audição.

Introdução

As miosinas são proteínas motoras moleculares que interagem com a actina para conduzir vários processos celulares 1,2,3,4. Os seres humanos possuem 12 classes e 39 genes de miosina⁵, que estão envolvidos em uma ampla gama de funções fisiológicas, como contração muscular⁶ e processos sensoriais⁷. Cada molécula de miosina é um complexo multimérico composto por uma cadeia pesada e cadeias leves. A cadeia pesada é dividida em regiões de cabe....

Protocolo

NOTA: Aqui descrevemos um protocolo para sintetizar a holoenzima miosina-7a humana intacta e caracterizar sua motilidade in vitro. Este protocolo é dividido em três seções: primeiro, expressar a miosina-7a humana usando o sistema de expressão da proteína baculovírus MultiBac; Em segundo lugar, purificar as cadeias leves de miosina-7a separadamente usando o sistema E.coli His6-SUMO; e, por último, estudar a motilidade da miosina-7a humana usando o ensaio de deslizamento de filamento de actina.

1. Produção complexa de miosina-7a baseada no sistema MultiBac

1. Criação de multig....

Discussão

Apresentado aqui é um protocolo detalhado para a produção de proteína miosina-7a humana recombinante a partir de células de insetos. Embora o sistema Sf9 / baculovírus tenha sido usado para produzir uma variedade de miosinas 40,41,42,43, apenas recentemente a miosina-7a de mamíferos foi purificada com sucesso usando o sistema de baculovírus MultiBac¹⁴.<.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
1X FLAG Peptide	GenScript	N/A	Custom peptide synthesis
22x22mm No. 1.5 coverslips	VWR	48366-227
250 mL Conical Centrifuge Tubes	Nunc	376814
250 mL Vented Erlenmyer Shaker Flask	IntelixBio	DBJ-SF250VP
2-Mercaptoethanol	VWR	M131
75x25x1 mm Vistavision microscope slides	VWR	16004-42
Actin Protein (>99% Pure)	Cytoskeleton	AKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220
ATP	Millipore Sigma	A7699
ATP	Millipore Sigma	A7699
Bio-Spin Disposable Chromatography Column	Bio-Rad	732-6008
BL21 Competent E. coli	New England Biolabs	C2530H
Bluo-Gal	Thermo Fisher	15519028
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	5470
BstXI Enzyme	New England Biolabs	R0113S
Calmodulin	Millipore Sigma	208694
Catalase	Millipore Sigma	C40
Champion pET-SUMO Expression System	Thermo Fisher	K30001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche Diagnostics	5056489001
Cutsmart Buffer	New England Biolabs	B6004S
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DNase I, Spectrum Chemical	Fisher Scientific	18-610-304
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
Ethanol	Thermo Fisher	BP2818
ExpiFectamine Sf Transfection Reagent	Gibco	A38915
FAST program	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements;
Fisherbrand Model 505 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB505110
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-064	10 mg/mL in distilled water
Glucose	Millipore Sigma	G5767
Glucose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Glycerol	Invitrogen	15514-011
HisPur Cobalt Resin	Thermo Fisher	89966
I-CeuI Enzyme	New England Biolabs	R0699S
Image Stabilizer Plugin	https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
Imidazole	Millipore Sigma	I2399
In-Fusion Snap Assembly Master Mix	TaKaRa	638948
IPTG	Thermo Fisher	15529019
Isopropanol	Fisher Scientific	A451SK
Kanamycin	Fisher Scientific	AAJ67354AD
Large Orifice Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-134	1-200uL
LB Agar, Ready-Made Powder	Thermo Fisher	J75851-A1
Leupeptin Protease Inhibitor	Thermo Fisher	78435
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells	Gibco	10361012
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microscope	Nikon	Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective
Microscope Camera	ORCA-Fusion BT
Microscope Laser Unit	Andor iXon Ultra
Miller's LB Broth	Corning	46-050-CM
MOPS	Millipore Sigma	M3183
MOPS	Millipore Sigma	M3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)	New England Biolabs	C2987H
NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B6003S
NIS Elements	Nikon
NIS-Elements	Nikon
Nitrocellulose	LADD Research Industries	53152
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
pACEBac1 Vector	Geneva Biotech
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
PMSF	Millipore Sigma	78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)	Invitrogen	12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	QIAGEN	28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)	QIAGEN	28104
Quick CIP	New England Biolabs	M0525S
Rhodamine phalloidin	Invitrogen	R415
S.O.C. Medium	Invitrogen	15544034
SENP2 protease		PMID:17591783	Purified in the lab
Sf9 cells	Thermo Fisher	11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media Complete	Gibco	12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mL	Thermo Fisher	A52971
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Stericup Quick Release Vacuum Driven Disposable Filtration System	Millipore Sigma	S2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GL	Cytiva	29148721
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATP	New England Biolabs	B0202A
Tetracycline Hydrochloride	Millipore Sigma	T7660-5G
Tris	Millipore Sigma	10708976001
Triton X	American Bioanalytical	9002-93-1