인간 Myosin-7a의 MultiBac 시스템 기반 정제 및 생물물리학적 특성 분석

요약

이 프로토콜은 MultiBac Baculovirus 시스템을 사용하여 인간 myosin-7a holoenzyme을 재조합 생산하고 맞춤형 in vitro 필라멘트 글라이딩 분석을 사용하여 운동성을 연구하는 절차를 자세히 설명합니다.

초록

Myosin-7a는 청각 및 시각 과정에 필수적인 액틴 기반 운동 단백질입니다. myosin-7a의 돌연변이는 인간에게 가장 흔하고 심각한 형태의 청각 실명인 어셔 증후군 1형을 유발합니다. myosin-7a는 다른 Usher 단백질과 함께 막관통 접착 복합체를 형성하며, 이는 광수용체와 달팽이관 유모 세포의 구조적-기능적 무결성에 필수적이라는 가설이 있습니다. 그러나 순수하고 온전한 단백질을 얻는 데 어려움이 있기 때문에 인간 myosin-7a의 정확한 기능 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵고 제한된 구조 및 생체 역학 연구가 있습니다. 최근 연구에 따르면 포유류의 미오신 -7a는 중쇄와 세 가지 유형의 경쇄, 즉 조절 경쇄(RLC), 칼모듈린 및 칼모듈린 유사 단백질 4(CALML4)로 구성된 다중체 운동 복합체입니다. 칼모듈린과 달리 CALML4는 칼슘 이온에 결합하지 않습니다. 칼슘에 민감한 칼모듈린과 둔감한 칼모듈린은 모두 포유류의 미오신 -7a의 기계적 특성을 적절하게 미세 조정하는 데 중요합니다. 여기에서는 MultiBac Baculovirus 단백질 발현 시스템을 사용하여 재조합 인간 myosin-7a 홀로효소를 생성하는 자세한 방법을 설명합니다. 이를 통해 밀리그램 단위의 고순도 전장 단백질을 생성하여 생화학적 및 생물물리학적 특성을 분석할 수 있습니다. 또한 맞춤형 in vitro motility assay 및 fluorescence microscopy를 사용하여 기계적 및 운동성 특성을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 여기에 설명된 상세한 기능적 특성 분석 프로토콜과 함께 온전한 인간 myosin-7a 단백질의 가용성은 시력 및 청각에서 myosin-7a의 분자 측면에 대한 추가 연구를 위한 길을 열어줍니다.

서문

미오신 (Myosin)은 액틴과 상호 작용하여 수많은 세포 과정을 주도하는 분자 운동 단백질입니다 1,2,3,4. 인간은 12개의 유전자와 39개의 미오신 유전자(myosin gene)⁵를 가지고 있으며, 이 유전자들은 근육 수축⁶ 및 감각 과정⁷과 같은 광범위한 생리적 기능에 관여한다. 각 미오신 분자는 중쇄와 경쇄로 구성된 다중체 복합체입니다. 무거운 사슬은 머리, 목, 꼬리 영역으로 나뉩니다. 헤드에는 ATP 가수분해를 담당하고 액틴 필라멘트에 힘을 생성하는 액틴 및 뉴클레오티드 결합 부위가 포함되어 있습니다². 목은 특정 라이트 체인 세트가 바인딩 된 여러 개의 α 나선형 IQ 모티브로 형성됩니다. 그들은 함께 모터의 구조적 변화를 큰 움직임 ^8,9,10

프로토콜

참고: 여기에서는 온전한 인간 myosin-7a holoenzyme을 합성하고 in vitro에서 그 운동성을 특성화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 세 부분으로 나뉩니다: 첫째, MultiBac baculovirus 단백질 발현 시스템을 사용하여 human myosin-7a를 발현하는 것; 둘째, E.coli His6-SUMO 시스템을 사용하여 myosin-7a 경쇄를 개별적으로 정제하는 단계; 마지막으로 Actin-Filament Gliding Assay를 사용하여 인간 Myosin-7A의 운동성을 연구합니다.

1. MultiBac 시스템 기반 myosin-7a 복합체 생산

1. human myosin-7a complex를 발현하기 위한 baculovirus multigene cassette 생성(16일)
   참고: myosin-7a subunit의 cDNA를 pACEBac1 벡터에 삽입하는 데 1회의 클로닝 주기(4일)가 필요하고, myosin-7a 복합체를 발현하는 데 필요한 모든 증식 모듈의 단계적 결찰을 완료하기 위해 3회의 클로닝 주기가 필요하므로 총 16일이 소요됩니다.
   1. 제조업....

토론

여기에는 곤충 세포에서 재조합 인간 myosin-7a 단백질을 생산하기 위한 자세한 프로토콜이 제시되어 있습니다. Sf9/바큘로바이러스 시스템이 다양한 미오신^40,41,42,43을 생성하는 데 사용되었지만, 최근에야 포유류 미오신 -7a가 MultiBac 바큘로바이러스 시스템⁽¹⁴.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
1X FLAG Peptide	GenScript	N/A	Custom peptide synthesis
22x22mm No. 1.5 coverslips	VWR	48366-227
250 mL Conical Centrifuge Tubes	Nunc	376814
250 mL Vented Erlenmyer Shaker Flask	IntelixBio	DBJ-SF250VP
2-Mercaptoethanol	VWR	M131
75x25x1 mm Vistavision microscope slides	VWR	16004-42
Actin Protein (>99% Pure)	Cytoskeleton	AKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220
ATP	Millipore Sigma	A7699
ATP	Millipore Sigma	A7699
Bio-Spin Disposable Chromatography Column	Bio-Rad	732-6008
BL21 Competent E. coli	New England Biolabs	C2530H
Bluo-Gal	Thermo Fisher	15519028
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	5470
BstXI Enzyme	New England Biolabs	R0113S
Calmodulin	Millipore Sigma	208694
Catalase	Millipore Sigma	C40
Champion pET-SUMO Expression System	Thermo Fisher	K30001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche Diagnostics	5056489001
Cutsmart Buffer	New England Biolabs	B6004S
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DNase I, Spectrum Chemical	Fisher Scientific	18-610-304
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
Ethanol	Thermo Fisher	BP2818
ExpiFectamine Sf Transfection Reagent	Gibco	A38915
FAST program	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements;
Fisherbrand Model 505 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB505110
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-064	10 mg/mL in distilled water
Glucose	Millipore Sigma	G5767
Glucose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Glycerol	Invitrogen	15514-011
HisPur Cobalt Resin	Thermo Fisher	89966
I-CeuI Enzyme	New England Biolabs	R0699S
Image Stabilizer Plugin	https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
Imidazole	Millipore Sigma	I2399
In-Fusion Snap Assembly Master Mix	TaKaRa	638948
IPTG	Thermo Fisher	15529019
Isopropanol	Fisher Scientific	A451SK
Kanamycin	Fisher Scientific	AAJ67354AD
Large Orifice Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-134	1-200uL
LB Agar, Ready-Made Powder	Thermo Fisher	J75851-A1
Leupeptin Protease Inhibitor	Thermo Fisher	78435
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells	Gibco	10361012
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microscope	Nikon	Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective
Microscope Camera	ORCA-Fusion BT
Microscope Laser Unit	Andor iXon Ultra
Miller's LB Broth	Corning	46-050-CM
MOPS	Millipore Sigma	M3183
MOPS	Millipore Sigma	M3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)	New England Biolabs	C2987H
NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B6003S
NIS Elements	Nikon
NIS-Elements	Nikon
Nitrocellulose	LADD Research Industries	53152
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
pACEBac1 Vector	Geneva Biotech
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
PMSF	Millipore Sigma	78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)	Invitrogen	12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	QIAGEN	28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)	QIAGEN	28104
Quick CIP	New England Biolabs	M0525S
Rhodamine phalloidin	Invitrogen	R415
S.O.C. Medium	Invitrogen	15544034
SENP2 protease		PMID:17591783	Purified in the lab
Sf9 cells	Thermo Fisher	11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media Complete	Gibco	12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mL	Thermo Fisher	A52971
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Stericup Quick Release Vacuum Driven Disposable Filtration System	Millipore Sigma	S2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GL	Cytiva	29148721
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATP	New England Biolabs	B0202A
Tetracycline Hydrochloride	Millipore Sigma	T7660-5G
Tris	Millipore Sigma	10708976001
Triton X	American Bioanalytical	9002-93-1