Purification et caractérisation biophysique de la myosine-7a humaine basée sur le système MultiBac

Résumé

Ce protocole détaille les procédures de production recombinante de l’holoenzyme myosine-7a humaine à l’aide du système de baculovirus MultiBac et d’étude de sa motilité à l’aide d’un test de glissement de filament in vitro sur mesure.

Résumé

La myosine-7a est une protéine motrice basée sur l’actine essentielle aux processus auditifs et visuels. Les mutations de la myosine-7a conduisent au syndrome d’Usher de type 1, la forme la plus courante et la plus grave de surdicécité chez l’homme. On suppose que la myosine-7a forme un complexe d’adhésion transmembranaire avec d’autres protéines Usher, essentiel à l’intégrité structurelle et fonctionnelle des cellules photoréceptrices et des cellules ciliées cochléaires. Cependant, en raison des défis liés à l’obtention de protéines pures et intactes, les mécanismes fonctionnels exacts de la myosine-7a humaine restent insaisissables, avec peu d’études structurelles et biomécaniques disponibles. Des études récentes ont montré que la myosine-7a de mammifère est un complexe moteur multimérique composé d’une chaîne lourde et de trois types de chaînes légères : la chaîne légère régulatrice (RLC), la calmoduline et la protéine 4 de type calmoduline (CALML4). Contrairement à la calmoduline, CALML4 ne se lie pas aux ions calcium. Les calmodulines, sensibles au calcium et insensibles, sont essentielles à la myosine-7a de mammifère pour un bon réglage fin de ses propriétés mécaniques. Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour produire une holoenzyme humaine recombinante de myosine-7a à l’aide du système d’expression de la protéine MultiBac Baculovirus. Cela permet d’obtenir des quantités de milligrammes de protéines complètes de haute pureté, ce qui permet leur caractérisation biochimique et biophysique. Nous présentons en outre un protocole pour évaluer ses propriétés mécaniques et mobiles à l’aide de tests de motilité in vitro sur mesure et de microscopie à fluorescence. La disponibilité de la protéine myosine-7a humaine intacte, ainsi que le protocole de caractérisation fonctionnelle détaillé décrit ici, ouvrent la voie à d’autres investigations sur les aspects moléculaires de la myosine-7a dans la vision et l’audition.

Introduction

Les myosines sont des protéines motrices moléculaires qui interagissent avec l’actine pour piloter de nombreux processus cellulaires 1,2,3,4. L’homme possède 12 classes et 39 gènes de la myosine⁵, qui sont impliqués dans un large éventail de fonctions physiologiques, telles que la contraction musculaire⁶ et les processus sensoriels⁷. Chaque molécule de myosine est un complexe multimérique composé d’une chaîne lourde et de chaînes légères. La chaîne lourde est divisée en régions de la tête, du cou et de la queue. La tête contient des sites de liaison à l’actine et aux nucléotides qui sont responsables de l’hydrolyse de l’ATP et de la génération de la force sur les filaments d’actine². Le col est formé de plusieurs motifs IQ α-hélicoïdaux où un ensemble spécifique de chaînes lumineuses sont liés. Ensemble, ils fonctionnent comme un bras de levier pour amplifier les changements conformationnels du moteur en grands mouvements ^8,9,10. La queue contient des sous-domaines spécifiques à une classe et joue un rôle régulateur dans l’ajustement de l’activité motrice de la myosine et la médiation des interactions avec les partenaires de liaison cellulaire ^2,11.

La myosine humaine 7a, membre des myosines de classe 7, est essentielle aux processus auditifs et visuels^12,13. Les motifs IQ de la myosine-7a humaine sont associés à une combinaison unique de chaînes légères, y compris la chaîne légère régulatrice (RLC), la calmoduline et la protéine 4 de type calmoduline (CALML4)14,15,16. En plus de stabiliser le bras de levier, ces chaînes légères régulent les propriétés mécaniques de la myosine-7a en réponse à la signalisation calcique, une caractéristique qui semble être unique à l’isoforme¹⁴ des mammifères.

Des défauts dans le gène codant pour la chaîne lourde de la myosine-7a (MYO7A/USH1B) sont responsables du syndrome d’Usher de type 1, la forme la plus grave de perte combinée de la vision et de l’ouïe chez l’homme¹⁷. De plus, le gène de la chaîne légère CALML4 fait partie des gènes candidats cartographiés pour contenir l’allèle causal de l’USH1H, une autre variante du syndrome d’Usher de type 1^15,18. Dans la rétine, la myosine-7a est exprimée dans l’épithélium pigmentaire rétinien et les cellules photoréceptrices¹³. Il a été impliqué dans la localisation des mélanosomes dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR)¹⁹ et la phagocytose des disques du segment externe des photorécepteurs par les cellules EPR²⁰. Dans l’oreille interne, la myosine-7a se trouve principalement dans les stéréocils, où elle joue un rôle essentiel dans l’établissement des faisceaux de cheveux et dans le déclenchement du processus de transduction mécano-électrique 12,21,22^.

Si l’importance de la myosine-7a dans les cellules sensorielles est bien établie, ses mécanismes fonctionnels au niveau moléculaire restent mal compris. Cette lacune dans les connaissances est en partie due aux défis liés à la purification de la protéine intacte, en particulier de l’isoforme de mammifère. Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés en utilisant le système MultiBac pour exprimer de manière recombinante l’holoenzyme¹⁴ complète de la myosine humaine 7a. Cette avancée a permis des caractérisations structurales et biophysiques de cette protéine motrice, conduisant à la découverte de plusieurs propriétés uniques de la myosine-7a humaine qui sont spécifiquement adaptées aux fonctions auditives des mammifères^14,23.

Le système MultiBac est une plate-forme avancée de cellules de baculovirus/insectes spécialement conçue pour l’expression de complexes multimériques eucaryotes^24,25. Une caractéristique clé de ce système est sa capacité à héberger plusieurs cassettes d’expression génique, chacune codant pour une sous-unité du complexe, au sein d’un seul baculovirus MultiBac. L’assemblage des cassettes d’expression multigénique est facilité par un module dit de multiplication : un site d’endonucléase à tête chercheuse (HE) et un site BstXI conçu par correspondance flanquant les sites de clonage multiple (MCS). Ce module permet l’assemblage itératif d’une cassette d’expression unique par restriction/ligature, en tirant parti du fait que les sites de restriction HE et BstXI sont éliminés lors de leur ligature. Dans cet article, la chaîne lourde de la myosine-7a humaine, la RLC, la calmoduline et le CALML4 sont chacun clonés dans le module de multiplication du vecteur pACEBac1 (Figure 1A), qui sont ensuite assemblés en une cassette d’expression multigénique par le processus itératif (Figure 1B). La cassette multigénique de la myosine-7a est intégrée dans le génome du baculovirus (bacmid) par la transposition de l’élément mini-Tn7 du vecteur pACEBac1 vers le site cible de la mini-attTn7 dans le génome (Figure 1C). Suivant les procédures de purification du bacmid, de production et d’amplification du baculovirus (figures 1D, E), le baculovirus recombinant myosine-7a MultiBac est préparé et peut être utilisé pour la production de protéines à grande échelle (figure 1F). De plus, les chaînes légères de myosine-7a peuvent être produites séparément chez E. coli et purifiées à l’aide d’une étiquette His6-SUMO clivable 26,27,28. Les chaînes légères purifiées sont utiles pour étudier leur dynamique de liaison et la régulation de la myosine-7a.

La protéine myosine-7a purifiée peut être soumise à des études structurales, biochimiques et biophysiques pour mieux comprendre la régulation structurelle-fonctionnelle de cette protéine motrice. De plus, ses interactions avec le réseau d’actine et d’autres protéines de liaison²⁹ peuvent être examinées à l’aide de diverses approches de reconstitution in vitro. Les résultats de ces analyses éclaireront les propriétés biophysiques de cette myosine, conduisant à une compréhension mécaniste de la façon dont la myosine-7a entraîne les changements cytosquelettiques et, en fin de compte, façonne la morphologie et la fonction uniques des cellules sensorielles. Dans cet article, nous détaillons un flux de travail pour le test de glissement des filaments d’actine qui a été spécifiquement adapté à la myosine-7a de mammifère. Le test de glissement des filaments d’actine est un test de motilité in vitro robuste qui étudie quantitativement le mouvement des filaments d’actine fluorescents propulsés par un grand nombre de moteurs de myosine immobilisés sur une surface de lamelle 30,31,32. Les avantages de ce test comprennent sa simplicité d’installation, ses exigences minimales en matière d’équipement (un microscope à fluorescence à grand champ équipé d’un appareil photo numérique) et sa grande reproductibilité. De plus, comme le mouvement des filaments d’actine est entraîné par un groupe de moteurs de myosine immobilisés, ce test est particulièrement utile pour étudier la motilité des myosines monomères telles que la myosine-7a^14,33. Les protocoles comprennent plusieurs modifications, allant des procédures expérimentales à l’analyse d’imagerie, spécifiquement adaptées aux propriétés mobiles uniques de la myosine-7a de mammifère. Grâce à la disponibilité de la protéine myosine-7a intacte et au protocole de caractérisation fonctionnelle décrit ici, cet article jette les bases d’une étude plus approfondie des rôles moléculaires de la myosine-7a dans les processus physiologiques et pathologiques.

Protocole

REMARQUE : Nous décrivons ici un protocole permettant de synthétiser l’holoenzyme humaine intacte myosine-7a et de caractériser sa motilité in vitro. Ce protocole est divisé en trois sections : premièrement, l’expression de la myosine-7a humaine à l’aide du système d’expression de la protéine du baculovirus MultiBac ; Deuxièmement, la purification des chaînes légères de myosine-7a séparément à l’aide du système E.coli His6-SUMO ; et enfin, l’étude de la motilité de la myosine-7A humaine à l’aide du test de glissement des filaments d’actine.

1. Production de complexes myosine-7a basée sur le système MultiBac

1. Création d’une cassette multigénique de baculovirus pour l’expression du complexe myosine-7a humaine (16 jours)
   REMARQUE : Il faut un cycle de clonage (4 jours) pour insérer les ADNc des sous-unités de la myosine-7a dans les vecteurs pACEBac1 et trois cycles de clonage pour terminer la ligature par étapes de tous les modules de multiplication nécessaires à l’expression du complexe myosine-7a, ce qui donne un total de 16 jours.
   1. Cloner les ADNc codant pour la chaîne lourde (HC) de la myosine-7a, la calmoduline, le CALML4 et le RLC dans les vecteurs pACEBac1 à l’aide d’un kit commercial suivant les protocoles du fabricant (voir le tableau des matériaux ; Figure 1A). Une étiquette FLAG est insérée à l’extrémité C de la myosine-7a HC pour faciliter la purification.
      REMARQUE : La myosine-7a de mammifère est produite sous la forme de deux isoformes d’épissage, ne différant que par un segment de 11 acides aminés à l’extrémité N-terminale²³. Cette courte extension N-terminale joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité ATPase de la myosine-7a¹⁴. Il a été démontré que l’ajout d’une balise N-terminale peut perturber la régulation normale par cette extension N-terminale et réduire significativement l’activité enzymatique et la motilité du moteur¹⁴. Par conséquent, une balise C-terminale FLAG est utilisée pour éviter de perturber la régulation naturelle de la protéine.
   2. Construire la cassette d’expression multigénique de l’holoenzyme myosine-7a en utilisant la multiplication de l’endonucléase à tête chercheuse/BstXI comme décrit ci-dessous (Figure 1B).
      REMARQUE : L’endonucléase à tête chercheuse I-CeuI produit des extrémités cohésives qui sont compatibles avec les extrémités générées par la digestion BstXI. Lors de la ligature, un site de restriction hybride endonucléase/BstXI est créé qui ne peut être coupé par aucune des enzymes. La même procédure peut être répétée pour intégrer d’autres modules de multiplication. Si plusieurs sites de restriction pour l’I-CeuI et le BstXI sont présents sur l’insert ou la construction du vecteur, ces sites supplémentaires doivent être éliminés par mutagenèse dirigée pour s’assurer que les sites de coupe I-CeuI et BstXI sont uniques.
   3. Préparation de l’insert : Digérer la construction de l’insert (par exemple, pACEBac-M7a HC) avec l’endonucléase à tête chercheuse I-CeuI (voir le tableau des matériaux), puis purifier le plasmide linéarisé à l’aide d’un kit de purification PCR (voir le tableau des matériaux). De plus, digérer le plasmide linéarisé avec BstXI (voir Tableau des matériaux), séparer le fragment contenant la cassette d’expression génique par électrophorèse sur gel et purifier à l’aide d’un kit d’extraction de gel (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : I-CeuI et BstXI nécessitent des conditions de tampon différentes, selon les protocoles du fabricant, pour atteindre une activité de 100 %. De plus, une coupe complète avec I-CeuI nécessite un minimum de 3 h, tandis que BstXI ne nécessite que 15 min de temps d’incubation. Les digestions doivent donc être effectuées de manière séquentielle.
   4. Préparation des vecteurs : Linéariser la construction du vecteur (p. ex., pACEBac-CaM) par digestion BstXI. La phosphatase alcaline est incluse dans la préparation du vecteur pour empêcher le plasmide du vecteur de se ligaturer sur lui-même (voir le tableau des matériaux). Obtenez le produit de digestion par électrophorèse et purifiez-le avec un kit d’extraction de gel.
   5. Ligature : Ligate l’insert traité I-CeuI/BstXI et le vecteur traité BstXI avec l’ADN ligase T4 (voir Tableau des Matériaux). Effectuez des réactions de ligature à température ambiante (20 °C -25 °C) pendant 10 min avec un rapport de 1:1 en masse de l’ADN de l’insert à l’ADN vecteur, en maintenant la masse totale proche de 100 ng dans chaque réaction de ligature.
   6. Transformation et analyse plasmidique : Transformer les mélanges de ligature en cellules DH5α (voir Tableau des matériaux) en suivant les recommandations du fabricant et dépister la résistance à la gentamicine dans les colonies positives. Purifiez les plasmides à l’aide d’un kit commercial (voir le tableau des matériaux) et vérifiez les bons clones (par exemple, les plasmides contenant à la fois M7a HC et CaM) en fonction de modèles de digestion de restriction spécifiques et du séquençage de l’ADN des inserts.
   7. Intégration de plusieurs cassettes d’expression génique : Répétez les étapes 1.1.2 à 1.1.6 pour intégrer des cassettes de gènes supplémentaires exprimant d’autres sous-unités de la myosine-7a.
2. Production et purification de l’ADN bacmid recombinant (4 jours ; Figure 1C).
   REMARQUE : Jour 1 - Transformation bactérienne et croissance des colonies transformées. Jours 2-3 - Croissance des colonies et dépistage pour une transformation réussie. Jour 3 - Sélection et striage des colonies positives, à partir de l’inoculation pendant la nuit. Jour 4 - Purification de l’ADN de Bacmid.
   1. Transformer les cellules compétentes DH10Bac (voir Tableau des matériaux) avec 1 ng du plasmide séquencé pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM en suivant les recommandations du fabricant.
   2. Déposer sur une plaque de 20 à 200 μL de cellules une gélose contenant 50 μg/mL de kanamycine, 7 μg/mL de gentamicine, 10 μg/mL de tétracycline, 100 μg/mL d’indolyl-β-galactoside halogéné et 40 μg/mL d’IPTG (voir le tableau des matériaux) et incuber la plaque à 37 °C pendant 48 h pour permettre le développement d’une couleur bleu foncé chez les clones négatifs.
      REMARQUE : L’indolyl-β-galactoside halogéné colore les colonies qui continuent d’exprimer LacZ (indiquant que la transposition a échoué), ce qui permet de sélectionner les colonies blanches où la transposition a réussi.
   3. Sélectionnez soigneusement une colonie blanche isolée et cultivez des cellules pendant la nuit dans 5 ml de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine, 7 μg/mL de gentamicine et 10 μg/mL de tétracycline à 37 °C dans un agitateur orbital à 225 tr/min.
   4. Centrifuger la culture à 2 465 x g pendant 10 min pour granuler l’E. coli. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 300 μL de tampon P1 du kit.
      REMARQUE : Bien que les tampons du kit Miniprep soient utilisés ici, le protocole de purification du produit bacmid diffère du protocole fourni avec le kit.
   5. Ajoutez 300 μL de tampon P2 du kit. Mélangez en inversant les tubes plusieurs fois, puis incubez à température ambiante pendant 3 min.
   6. Ajouter 300 μL du tampon N3 du kit et mélanger par inversion pour arrêter la réaction de lyse. Centrifugeuse à 17 885 x g pendant 10 min à 4 °C.
   7. Transférez le surnageant dans un tube stérile propre et répétez la centrifugation pendant encore 10 min.
   8. Transvaser 800 μL du surnageant dans un autre tube de microcentrifugation stérile de 1,7 mL (voir le tableau des matériaux) et ajouter 600 μL d’isopropanol froid (voir le tableau des matériaux), en mélangeant par inversion rigoureuse. Centrifuger ensuite à 17 885 x g pendant 20 min à 4 °C.
   9. Jetez le surnageant et localisez la petite pastille blanche. Laver la pastille avec 800 μL d’éthanol à 70 % froid (voir tableau des matériaux) et centrifuger à 17 885 x g pendant 5 min à 4 °C. Ajoutez délicatement de l’éthanol le long de la paroi du tube pour éviter de déranger le granulé.
   10. Jetez le surnageant et répétez le lavage à l’éthanol une fois. Faites sécher le granulé à l’air libre à température ambiante pendant 5 min. Aspirez soigneusement tout excès de liquide, si nécessaire.
   11. Dissoudre la pastille avec 20 μL de tampon EB du kit. Assurez-vous que la pastille est complètement dissoute en agitant le tube ou en mélangeant doucement par pipetage. Déterminer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre (voir le tableau des matériaux).
   12. Ajustez le volume de la mémoire tampon au besoin pour que la concentration de bacmid soit d’environ 1 μg/μL. Conservez l’ADN du bacmid à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la production du virus P0.
       REMARQUE : Le bacmid purifié peut être conservé à 4 °C et reste efficace pendant plusieurs mois. Nous avons vu des transfections réussies avec des produits bacmid jusqu’à 1 an. Alternativement, le bacmid peut être aliquote et stocké à -20 °C. Les cycles multiples de congélation/décongélation doivent être évités car ils diminuent l’efficacité de la transfection.
3. Transfecter des cellules d’insectes Sf9 avec du bacmid pour produire un baculovirus recombinant (6 jours ; Graphique 1D)
   REMARQUE : Jour 1 - Transfection de cellules avec de l’ADN bacmid. Jours 2 à 6 - Observer la croissance et l’expression des cellules. Jour 6 - Collecte du virus P0.
   1. Ajouter des cellules Sf9 dans un milieu de culture (voir le tableau des matériaux) dans une plaque à 6 puits à une concentration de 0,33 x 10⁶ cellules/mL avec 3 mL par puits. Laissez la plaque reposer à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de se fixer au bas de la plaque.
   2. Pour chaque puits, préparer un mélange de transfection en combinant 10 μL de réactif de transfection lipidique cationique (voir le tableau des matériaux) avec 250 μL de milieu essentiel minimal (MEM) amélioré (voir le tableau des matériaux) dans un tube de microcentrifugation stérile. Mélanger par inversion et incuber à température ambiante pendant 5 min.
   3. Ajouter 1 μg (en fonction de la concentration déterminée à l’étape 1.2.12) de myosine-7a bacmid non diluée au mélange de transfection. Mélanger par inversion et incuber à température ambiante pendant 5 min.
   4. Répartissez uniformément l’ensemble du mélange ADN-lipides goutte à goutte dans les puits. Laissez-en un puits pour les cellules non transfectées comme contrôle négatif.
   5. Scellez la plaque à 6 puits avec un film (voir le tableau des matériaux) et incubez à 27 °C pendant 6 jours. Observez la croissance et le détachement tout au long de cette période. S’il y a une étiquette fluorescente présente sur la construction, vérifiez le développement de la fluorescence (Figure 2).
   6. Lorsque les cellules transfectées montrent des signes d’infection à un stade avancé, transférez le milieu contenant le virus des puits infectés dans un tube conique de 15 mL et centrifugez-le à 805 x g pendant 10 min.
   7. Transférez le surnageant dans un tube conique propre de 15 ml, enveloppez-le dans du papier d’aluminium et rangez-le à 4 °C. Ce produit est maintenant le virus P0 et peut être stocké et utilisé efficacement jusqu’à quatre mois d’après notre expérience.
4. Amplifier le stock de baculovirus (3-5 jours ; Graphique 1E)
   1. Préparez 100 mL (ou le volume désiré) de cellules Sf9 à une concentration de 2 x 10⁶ cellules/mL dans un milieu de culture cellulaire Sf9 dans un erlenmeyer de 250 mL (voir le tableau des matières).
   2. Ajouter un rapport 1:100 (v/v) de stock de virus P0 à la culture de cellules en suspension Sf9 et incuber à 27 °C dans un agitateur orbital à 135 tr/min.
   3. Surveillez la croissance toutes les 24 h jusqu’à ce que les cellules atteignent ~90% de mort cellulaire. Une fois à cette distance, centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 10 min et prélever le surnageant contenant le virus P1.
   4. Filtrez le surnageant à l’aide d’une filtration sous vide de 0,22 μm (voir tableau des matériaux). Conservez le produit filtré dans l’obscurité et à 4 °C. Ce produit est maintenant le virus P1.
      REMARQUE : Le titre du virus diminue avec un stockage à long terme à 4 °C. Envisagez de faire du stock de virus frais s’il a été stocké pendant plus de 4 mois, ou de titrer le stock de virus avant de l’utiliser dans l’expression³⁴.
5. Expression protéique (60 à 72 h entre le début de l’expression et la collecte de la cuiller cellulaire ; Graphique 1E)
   1. Préparez des cellules Sf9 en croissance en phase logarithmique à une concentration de 2 x 10⁶ cellules/mL et ajoutez le virus P1 à raison de 12 mL de virus pour 300 mL de suspension cellulaire.
      REMARQUE : Le rendement en protéines est d’environ 1 mg / L. Il est recommandé d’utiliser un minimum de 1,5 L de suspension cellulaire pour l’expression de cette protéine.
   2. Cultivez les cellules à 27 °C dans un agitateur orbital à 135 tr/min pendant environ 60 h.
      REMARQUE : De petits échantillons peuvent être prélevés à différents moments et analysés à l’aide de gels SDS pour évaluer les niveaux d’expression des protéines. De plus, si les protéines sont fusionnées avec des marqueurs fluorescents, les niveaux d’expression peuvent être évalués à l’aide de la microscopie à fluorescence. Les cellules doivent être récoltées au plus tard au début de la mort cellulaire.
   3. Centrifuger la suspension cellulaire à 3 735 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules. Les granulés peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure ou conservés pour un stockage à long terme. Nous utilisons généralement des granules cellulaires en quelques semaines, mais nous avons récupéré des protéines actives plusieurs mois après la congélation.
6. Purification des protéines (2 jours ; Graphique 1F)
   REMARQUE : Jour 1 - Extraction et purification des protéines à l’aide de la chromatographie d’affinité FLAG. Jour 2 - Aliquote et congélation des échantillons après la dialyse pendant la nuit. Le protocole décrit ci-dessous concerne la purification de la myosine-7a à partir de granules de cellules de 1,5 L.
   1. Préparez le tampon maître contenant 10 mM de MOPS (pH 7,2), 500 mM de NaCl, 10 mM de MgCl₂, 1 mM d’EGTA, 1 μg/mL de leupeptine et 100 μg/mL de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). Filtrez-le avec un filtre à pores de 0,22 μm et stockez le tampon à 4 °C (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE : Le PMSF est instable dans les solutions aqueuses. Préparez la solution mère PMSF sous forme de 1 M dans de l’éthanol à 100 % et conservez-la à -20 °C jusqu’à 6 mois.
   2. Préparez 75 ml de tampon d’extraction en complétant le tampon principal avec 3 comprimés inhibiteurs de protéase sans EDTA, 2 mM d’ATP et 0,1 mM de dithiothréitol (DTT ; voir le tableau des matériaux).
   3. Ajoutez 75 ml de tampon d’extraction à la pastille pendant qu’elle est encore congelée. Laissez les granulés dans le tampon d’extraction sur de la glace jusqu’à ce qu’ils décongèlent. À l’aide d’une pipette sérologique, on brise la pastille afin d’accélérer le processus de décongélation.
   4. À l’aide d’une pointe de 1/2 pouce (13 mm), sonicer la remise en suspension sur la glace pendant 10 min à 50 % d’amplitude, 5 s en marche, 5 s en arrêt.
   5. Centrifuger le lysat total à 33 746 x g pendant 30 min à 4 °C. Lors de la centrifugation, préparer 1,5 mL de résine FLAG en lavant 3 mL de la suspension à 50 % de résine d’affinité Anti-FLAG (voir le tableau des matériaux) avec 40 mL de PBS. Granuler la résine par centrifugation à 800 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirez délicatement le PBS sans déranger la résine.
   6. Ajouter le surnageant de la centrifugation du lysat à la résine lavée et incuber avec une rotation continue à 4 °C pendant 1 h.
   7. Granuler la résine par centrifugation à 800 x g pendant 2 min à 4°C. Sans perturber la résine, retirez le surnageant.
   8. Remettre la résine en suspension dans 40 mL de Master Buffer et centrifuger à 800 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la résine. Répétez le lavage 1 fois.
   9. Transférez la résine lavée dans deux colonnes de centrifugation en polypropylène (voir tableau des matériaux). Lavez chaque colonne 1 fois avec 2 ml de tampon principal. Retirez le tampon principal en centrifugeant la colonne à 1 400 x g pendant 2 min à 4 °C. La résine sera tassée sur le fond.
   10. Préparez un tampon d’élution en ajoutant 100 μg/mL de peptide FLAG (voir le tableau des matériaux) au tampon maître.
   11. Ajoutez 300 μL de tampon d’élution à la résine tassée dans chaque colonne et mélangez doucement par pipetage pour vous assurer que la résine est complètement hydratée par le tampon d’élution. Laissez la résine incuber avec le tampon d’élution sur de la glace pendant 10 min.
   12. Centrifuger les colonnes à 1 400 x g pendant 2 min à 4 °C. Transférez le flux dans un tube de microcentrifugation propre et maintenez-le sur de la glace. C’est la première fraction.
   13. Répétez les étapes 1.6.11 et 1.6.12 de sorte que 4 fractions soient prélevées dans chaque colonne.
   14. Effectuer l’électrophorèse sur gel SDS-PAGE³⁵ avec les fractions d’élution pour déterminer leurs concentrations relatives. Pendant que le gel fonctionne, préparez un tampon de dialyse contenant 500 mM de NaCl, 10 mM de MOPS, 2 mM de MgCl₂, 0,1 mM d’EGTA et 1 mM de DTT.
   15. Mélangez les fractions les plus concentrées. Transférez l’échantillon dans une cassette de dialyse MWCO 10K (voir tableau des matériaux) et dialysez pendant la nuit à 4 °C. Utilisez 1 L de tampon de dialyse pour environ 500 μL de protéines. Effectuez au moins trois changements du tampon de dialyse.
       REMARQUE : La méthode d’élution par colonne de spin et par centrifugation permet d’éluer les protéines à des concentrations élevées (0,5-1 mg / mL). D’autres étapes de concentration ne sont généralement pas nécessaires. Cependant, si des protéines plus concentrées sont souhaitées, chargez les échantillons dans des tubes de concentration de 100 000 MWCO (voir le tableau des matériaux) et centrifugez-les à 1 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Répétez ce processus jusqu’à ce que le volume de solution protéique souhaité soit atteint.
   16. Le lendemain, déchargez soigneusement l’échantillon de la cassette de dialyse. Aliquote 15 μL par tube PCR et déposez les tubes dans un récipient d’azote liquide pour la congélation instantanée. Les protéines congelées peuvent être stockées à -80 °C pour une utilisation future (Figure 3A).
       REMARQUE : Le rendement en myosine-7a avec cette méthode se situe généralement entre 0,5 et 1 mg/L.

2. Purification des chaînes légères RLC et CALML4 à l’aide du système E. coli His6-SUMO (7 jours)

REMARQUE : Jours 1 à 4 - Clonage et purification des plasmides. Jour 5 - Transformation bactérienne. Jours 6-7 - Purification, aliquotage et congélation des protéines finales.

1. Clonez les ADNc codant pour RLC et CALML4 dans un vecteur pET-SUMO, qui contient une séquence His6 avant SUMO pour faciliter la purification. Si nécessaire, le domaine His6-SUMO peut être clivé de la protéine de fusion à l’aide d’une protéase SENP2^26,36.
2. Pour chaque protéine à chaîne légère, transformez les cellules compétentes de BL21 E . coli (voir le tableau des matières) avec le plasmide et commencez une culture liquide de 5 mL pendant la nuit avec les cellules transformées.
3. Le lendemain, inoculer la culture de nuit de 5 mL dans 1 L de bouillon Luria-Bertani (LB) contenant 50 μg/mL de kanamycine. Laisser la culture croître à 37 °C en agitant continuellement à 270 tr/min jusqu’à ce que la densité optique (D.E.) atteigne 0,6 - 1,0.
   REMARQUE : La valeur OD double environ toutes les 20 minutes une fois qu’elle atteint 0,2. Surveillez fréquemment le diamètre extérieur.
4. Initier l’expression de la protéine en ajoutant 250 μM d’isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture. Incuber pendant 3 à 5 h à 37 °C ou 16 °C pendant la nuit avec agitation continue à 270 tr/min.
5. Granulez E . coli en centrifugeant la suspension cellulaire à 4 347 x g pendant 15 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
6. Préparez un tampon de remise en suspension contenant 50 mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, 5 mM d’imidazole et 10 % de glycérol, pH 7,4 (voir le tableau des matériaux). Restez sur la glace.
7. Remettez la pastille en suspension dans 15 à 25 ml de tampon de remise en suspension et transférez la suspension dans un bécher propre, en ajustant le volume total à 35 ml. Ajouter la DNase et la RNase à la suspension dans un rapport de 1:1000 (v/v) pour une concentration finale de 1 μg/mL et 2 μg/mL, respectivement. Ajoutez un comprimé d’inhibiteur de protéase sans EDTA, 4 mM de 2-mercaptoéthanol et 1 % de Triton X à la suspension (voir le tableau des matériaux). Garder sur la glace pendant 20 min.
8. Soniquez la suspension de granulés dans de l’eau glacée avec 1 s de marche et 1 s de repos pendant un total de 1 min à 100 % d’amplitude. Laisser le lysat homogénéisé à 4 °C avec rotation continue pendant 2 h.
   REMARQUE : L’ajout de Triton X aide à lyser les cellules en préparation de la sonication.
9. Centrifuger les lysats à 26 900 x g pendant 45 min à 4 °C. Pendant ce temps, commencez à préparer la résine de cobalt (voir le tableau des matériaux). Utilisez 500 μL de résine de cobalt pour 1 L de culture d’E. coli . Lavez la résine 2 fois avec de l’eau ultra-pure et une fois avec un tampon de suspension en centrifugeant à 4 347 x g pendant 2 min à 4 °C.
10. Après la centrifugation au lysat, mélanger le surnageant avec la résine lavée et creuser doucement à 4 °C pendant 30 min.
11. Centrifuger la suspension de lysat-résine à 4 347 x g pendant 2 min à 4 °C. La résine sera tassée au fond du tube. Sans perturber la résine, retirez le surnageant.
12. Lavez la résine avec le tampon de suspension en centrifugeant à 4 347 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirez le surnageant. Répétez les lavages jusqu’à ce que le surnageant soit incolore.
13. Préparez un tampon d’élution contenant 50 mM de Tris HCl, 300 mM de NaCl, 5 mM d’imidazole, 10 % de glycérol, 4 mM de 2-mercaptoéthanol et 0,25 μM de protéase SENP2 (voir le tableau des matériaux). Gardez-le sur de la glace.
14. Remettez la résine en suspension dans 1 mL de tampon de remise en suspension et incubez-la pendant la nuit à 4 °C avec une rotation continue.
15. Le lendemain, centrifuger à 4 347 x g pendant 2 min pour granuler la résine. Récupérez le surnageant, qui contient la protéine de la chaîne légère clivée et la protéase.
16. Ajouter 1 mL de tampon d’élution à la résine. Répétez la centrifugation et récupérez le surnageant.
17. Retirer la protéase par chromatographie liquide protéique rapide (FPLC). Préparez brièvement la colonne d’exclusion granulométrique (voir le tableau des matériaux) avec un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10 % de glycérol et 5 mM de DTT (pH 7,4). Concentrer le surnageant à 500 μL à l’aide d’un tube concentrateur de 10 000 MWCO. Chargez l’échantillon concentré sur une colonne reliée à un système de chromatographie automatisé à l’aide d’une seringue, à travers laquelle circulez avec un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10 % de glycérol et 5 mM de DTT (pH 7,4). Surveiller les fractions collectées à l’aide d’une spectrophotométrie ultraviolette. Recueillir les fractions protéiques dont le poids moléculaire correspond aux chaînes légères.
    REMARQUE : La protéase peut également être éliminée par chromatographie d’affinité si une étiquette de purification (par exemple, une étiquette GST) est intégrée à la protéase.
18. Exécutez un gel SDS-PAGE avec les fractions d’élution pour déterminer la pureté et les concentrations relatives des protéines de la chaîne légère dans chaque fraction. Les fractions souhaitées sont celles qui contiennent des protéines de chaînes légères concentrées sans bandes de protéase visibles. Combinez les fractions protéiques souhaitées et concentrez-les à l’aide d’un tube de concentration³⁵ de 10 000 MWCO.
19. Congeler instantanément des aliquotes de protéines dans de l’azote liquide et les transférer immédiatement à -80 °C pour un stockage à long terme (figure 3B).
    REMARQUE : Le rendement en RLC et CALML4 à l’aide du système E . coli His6-SUMO est d’environ 1 à 2 mg/L.

3. Test de glissement du filament d’actine adapté à la myosine-7a (3 h)

REMARQUE : Les méthodes utilisées dans cette section sont similaires à celles décrites pour d’autres myosines³¹ , les principales modifications étant l’incubation et l’application de la myosine dans un tampon à haute force ionique et le long intervalle nécessaire pour obtenir une mesure précise des déplacements d’une image à l’autre.

1. Préparez une quantité de 20 μM d’actine filamenteuse (F-actine) en polymérisant de l’actine globulaire (G-actine) dans un tampon de polymérisation (50 mM de KCl, 25 mM de MOPS, 2 mM de MgCl2, 1 mM de DTT (pH 7,0)) à 4 °C pendant la nuit. Étiquetez l’actine F en ajoutant 1,2x l’excès molaire de rhodamine-phalloïdine (voir tableau des matériaux). Couvrir de papier d’aluminium et incuber sur de la glace pendant au moins 2 h.
   REMARQUE : La G-actine peut être achetée auprès de vendeurs commerciaux (voir le tableau des matériaux) ou purifiée à partir de poudre d’acétone musculaire de lapin^31,37. L’actine F marquée peut être conservée à 4 °C jusqu’à 2 mois à cette concentration.
2. Préparez une chambre d’écoulement comme décrit précédemment³¹. Brièvement, placez deux bandes de ruban adhésif double face espacées de 2 à 3 mm sur une lame de microscope nettoyée et traitée à la nitrocellulose (voir le tableau des matériaux). Placez la lamelle côté nitrocellulose vers le bas sur les bandelettes, créant ainsi une chambre d’écoulement d’un volume approximatif de 10 μL (figure 4).
3. Réalisation d’un test de glissement des filaments d’actine
   1. Dans la chambre d’écoulement, ajoutez un volume de chambre de 0,2 mg/mL de protéine de myosine-7a humaine purifiée dans un tampon de motilité 500 mM NaCl (500 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA (pH 7,4)). Laissez incuber 5 min à température ambiante.
      REMARQUE : Il est essentiel d’ajouter de la myosine-7a dans un tampon à haute teneur en sel car cela soulage l’état auto-inhibé et permet à la myosine-7a d’adhérer à la surface dans la conformation activée.
   2. Laver la chambre d’écoulement avec des volumes à trois chambres de 1 mg/mL BSA (voir tableau des matériaux) dans un tampon de motilité NaCl de 150 mM (150 mM de NaCl, 20 mM de MOPS, 5 mM de MgCl₂, 0,1 mM d’EGTA, 1 mM de DTT (pH 7,4)) en aspirant le liquide à l’aide d’une lingette propre à la sortie pour absorber l’excès de liquide. Incuber pendant 1 min après le 3ème^lavage.
   3. Écoulez un volume de chambre de 10 nM de rhodamine phalloidine marquée à la f-actine dans un tampon de motilité NaCl de 150 mM à travers la chambre d’écoulement. Surveiller la liaison des filaments d’actine à la surface à l’aide d’un microscope fluorescent avec objectif 100x. La densité des filaments d’actine doit être optimale (figure 5A), ce qui permet d’obtenir suffisamment de filaments dans le champ de vision pour le suivi, mais suffisamment clairsemée pour éviter le chevauchement de plusieurs filaments, ce qui complique le suivi.
   4. Lavez la chambre d’écoulement avec des volumes à trois chambres de 150 mM de tampon de motilité NaCl pour éliminer les filaments d’actine non liés et l’excès de rhodamine-phalloïdine.
   5. Amorcez la motilité en ajoutant un volume de chambre du tampon final (200 mM de NaCl, 20 mM de MOPS, 5 mM de MgCl₂, 0,1 mM d’EGTA, 50 mM de DTT, 2 mM d’ATP, 2,5 mg/ml de glucose, 100 μg/mL de glucose oxydase, 2 μM de RLC, 2 μM de CaM, 2 μM de CALML4).
   6. Enregistrez des images au microscope à fluorescence en utilisant une excitation de 561 nm pour visualiser l’actine marquée à la rhodamine phalloïdine. Trouvez une zone sur la lame avec la densité d’actine souhaitée (Figure 5A) et capturez des images toutes les 30 s pendant 30 min.
      REMARQUE : La vitesse de la myosine-7a de mammifère est d’environ 5 nm / s. Lors du réglage de la fréquence d’images d’acquisition, il est important de s’assurer que les déplacements des filaments entre les images sont suffisamment longs (plus d’un pixel) pour permettre un suivi précis. Les mouvements de sous-pixels entre les images peuvent entraîner une surestimation de la vitesse. La fréquence d’images de 30 s permet aux filaments d’actine de se déplacer d’environ 150 nm entre les images, ce qui correspond à plus de deux pixels sur le microscope. Cependant, il faut veiller à ce qu’un déplacement significatif puisse être observé sur le microscope utilisé. Le cas échéant, l’enregistrement multi-positions peut être utilisé pour collecter simultanément plusieurs champs de vision à des fins d’analyse.
4. Analyse du mouvement des filaments d’actine à l’aide du programme FAST (installé sur un Mac)³⁸.
   REMARQUE : Le programme FAST utilisé ici n’est qu’une des nombreuses options pour quantifier le mouvement du filament. Nous avons choisi d’utiliser FAST car il est automatisé, rapide et ne nécessite pas de logiciel payant. D’autres options incluent des algorithmes basés sur MATLAB tels que FIESTA, des méthodes basées sur ImageJ/FIJI telles que MTrack2 et Manual Tracking, et des méthodes basées sur Python telles que Philament³⁹.
   1. Téléchargez et installez le programme FAST (github.com/NeilBillington/FASTrack3 - version compatible python3 avec un module supplémentaire pour la conversion de fichiers nd2. NB : La version originale de python2 peut être trouvée à github.com/turalaksel/FASTrack).
   2. Exécutez le programme FAST comme décrit à la^{section 38} en utilisant une valeur de tolérance de 33 pour ne conserver que les filaments en mouvement lisse.
      REMARQUE : Si les images contiennent des problèmes mécaniques avec la scène ou de la collecte de plusieurs séries simultanément, les films doivent d’abord être stabilisés. Pour cela, nous vous recommandons le plugin FIJI Image Stabilizer, disponible en téléchargement à l’adresse suivante - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
   3. Utilisez le programme FAST pour analyser les images de .tif nouvellement créées en définissant d’abord les valeurs -xmax et -ymax. Ceux-ci définissent les paramètres du nuage de points généré par le programme et représentent la plus longue longueur de filament (en nm) et la vitesse maximale du filament (en nm/s). Dans cet exemple, nous avons utilisé 20 000 nm pour -xmax et 20 nm/s pour -ymax afin de nous assurer que toutes les données sont capturées (Figure 5D).
   4. Utilisez -px pour définir la taille en pixels de l’image acquise, qui sera ici de 65 nm, et -minv pour définir la vitesse minimale (en nm/s) requise d’un filament pour l’inclusion dans l’analyse. Pour la faible vitesse de la myosine-7a dans cet exemple, utilisez 0,1 nm/s.
   5. Utilisez -maxd pour définir la distance maximale autorisée entre les cadres pour que les filaments soient liés. Ceci est réglé pour éviter de lier des filaments séparés entre les cadres et dans cet exemple, nous utilisons la valeur par défaut de 2000 nm.
   6. Utilisez -pt pour définir la tolérance aux fluctuations de vitesse des filaments et n’incluez que les filaments avec des mouvements fluides. Cet exemple utilise un seuil de tolérance de 33 %. Cela signifie que les filaments dont l’écart-type de vitesse est supérieur à 33 % de la moyenne de vitesse seront exclus d’une analyse plus approfondie.
   7. Enfin, utilisez -d pour indiquer le dossier contenant les piles de .tif à analyser. La chaîne de commande entière avec les paramètres et les valeurs donnés sera : rapide -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [nom du dossier contenant les films].
      REMARQUE : Le programme FAST produit des diagrammes de dispersion (figure 5D) avec leurs données brutes associées, qui peuvent être extraites à des fins d’analyse et de visualisation dans d’autres programmes (figure 5C). Il produira également un tracé des trajectoires des filaments suivis (figure 5B), qui devrait être utilisé pour vérifier que le suivi fonctionne comme prévu. Des exemples de graphiques et d’autres visualisations de données possibles sont inclus ci-dessous.

Résultats

Le complexe myosine-7a purifié et les protéines à chaînes légères peuvent être évalués par électrophorèse sur gel SDS-PAGE, comme le montre la figure 3. La bande au-dessus du marqueur de 200 kDa correspond à la chaîne lourde de la myosine-7a (255 kDa). Les trois bandes qui migrent entre les marqueurs de 22 et 14 kDa de haut en bas sont respectivement RLC (20 kDa), calmoduline et CALML4. Alors que la calmoduline et CALML4 ont un poids moléculair...

Discussion

Voici un protocole détaillé pour la production de la protéine myosine-7a humaine recombinante à partir de cellules d’insectes. Bien que le système Sf9/baculovirus ait été utilisé pour produire une variété de myosines 40,41,42,43, ce n’est que récemment que la myosine-7a de mammifère a été purifiée avec succès à l’aide du système de baculovirus MultiBac

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
1X FLAG Peptide	GenScript	N/A	Custom peptide synthesis
22x22mm No. 1.5 coverslips	VWR	48366-227
250 mL Conical Centrifuge Tubes	Nunc	376814
250 mL Vented Erlenmyer Shaker Flask	IntelixBio	DBJ-SF250VP
2-Mercaptoethanol	VWR	M131
75x25x1 mm Vistavision microscope slides	VWR	16004-42
Actin Protein (>99% Pure)	Cytoskeleton	AKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220
ATP	Millipore Sigma	A7699
ATP	Millipore Sigma	A7699
Bio-Spin Disposable Chromatography Column	Bio-Rad	732-6008
BL21 Competent E. coli	New England Biolabs	C2530H
Bluo-Gal	Thermo Fisher	15519028
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	5470
BstXI Enzyme	New England Biolabs	R0113S
Calmodulin	Millipore Sigma	208694
Catalase	Millipore Sigma	C40
Champion pET-SUMO Expression System	Thermo Fisher	K30001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche Diagnostics	5056489001
Cutsmart Buffer	New England Biolabs	B6004S
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	DO632
DNase I, Spectrum Chemical	Fisher Scientific	18-610-304
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
EGTA, Molecular Biology Grade	Millipore Sigma	324626-25GM
Ethanol	Thermo Fisher	BP2818
ExpiFectamine Sf Transfection Reagent	Gibco	A38915
FAST program	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements;
Fisherbrand Model 505 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB505110
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-064	10 mg/mL in distilled water
Glucose	Millipore Sigma	G5767
Glucose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Glycerol	Invitrogen	15514-011
HisPur Cobalt Resin	Thermo Fisher	89966
I-CeuI Enzyme	New England Biolabs	R0699S
Image Stabilizer Plugin	https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
Imidazole	Millipore Sigma	I2399
In-Fusion Snap Assembly Master Mix	TaKaRa	638948
IPTG	Thermo Fisher	15529019
Isopropanol	Fisher Scientific	A451SK
Kanamycin	Fisher Scientific	AAJ67354AD
Large Orifice Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-134	1-200uL
LB Agar, Ready-Made Powder	Thermo Fisher	J75851-A1
Leupeptin Protease Inhibitor	Thermo Fisher	78435
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Magnesium chloride	Thermo Fisher	J61014.=E	1M
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells	Gibco	10361012
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mL	VWR	87003-294
Microscope	Nikon	Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective
Microscope Camera	ORCA-Fusion BT
Microscope Laser Unit	Andor iXon Ultra
Miller's LB Broth	Corning	46-050-CM
MOPS	Millipore Sigma	M3183
MOPS	Millipore Sigma	M3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-ONE-W
NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)	New England Biolabs	C2987H
NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B6003S
NIS Elements	Nikon
NIS-Elements	Nikon
Nitrocellulose	LADD Research Industries	53152
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
pACEBac1 Vector	Geneva Biotech
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
PMSF	Millipore Sigma	78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)	Invitrogen	12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	QIAGEN	28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)	QIAGEN	28104
Quick CIP	New England Biolabs	M0525S
Rhodamine phalloidin	Invitrogen	R415
S.O.C. Medium	Invitrogen	15544034
SENP2 protease		PMID:17591783	Purified in the lab
Sf9 cells	Thermo Fisher	11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media Complete	Gibco	12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mL	Thermo Fisher	A52971
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Stericup Quick Release Vacuum Driven Disposable Filtration System	Millipore Sigma	S2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GL	Cytiva	29148721
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATP	New England Biolabs	B0202A
Tetracycline Hydrochloride	Millipore Sigma	T7660-5G
Tris	Millipore Sigma	10708976001
Triton X	American Bioanalytical	9002-93-1