JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل الإكسوسومات المشتقة من طحال الفأر باستخدام مزيج من الهضم مع الكولاجيناز من النوع الأول والطرد المركزي الفائق.

Abstract

الإكسوسومات (Exo) عبارة عن هياكل ثنائية الطبقة دهنية تفرزها خلايا مختلفة ، بما في ذلك خلايا والنباتات وبدائيات النوى. كشفت الدراسات السابقة أن Exo المشتقة من الخلط أو الخلايا الطافية هي أهداف واعدة للمؤشرات الحيوية التشخيصية أو النذيرية الجديدة ، مما يؤكد دورها المهم في التسبب في المرض. اجتذبت Exo المشتقة من الأنسجة (Ti-Exo) اهتماما متزايدا نظرا لقدرتها على عكس خصوصية الأنسجة والبيئة المكروية بدقة. يلعب Ti-Exo ، الموجود في الفضاء الخلالي ، أدوارا حاسمة في الاتصال بين الخلايا والإشارات عبر الأعضاء. على الرغم من قيمتها المعترف بها في توضيح آليات المرض ، إلا أن عزل Ti-Exo لا يزال يمثل تحديا بسبب تعقيد مصفوفات الأنسجة والتباين في طرق الاستخراج. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول عملي لعزل الإكسوسومات من أنسجة طحال الفئران ، مما يوفر تقنية قابلة للتكرار لتحليل التعريف اللاحق والدراسات الوظيفية. استخدمنا هضم الكولاجيناز من النوع الأول جنبا إلى جنب مع الطرد المركزي الفائق التفاضلي لعزل Exo المشتق من الطحال. تم تحديد خصائص Exo المعزولة من خلال المجهر الإلكتروني ، ومقياس التدفق الخلوي النانوي ، واللطخة الغربية. عرضت Exo المعزولة المشتقة من الطحال التشكل النموذجي للحويصلات ثنائية الطبقة الدهنية ، بأحجام جسيمات تتراوح من 30 نانومتر إلى 150 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، أكد ملف تعريف التعبير عن علامات الإكسوسوم وجود ونقاء الإكسوسوم. مجتمعة ، نجحنا في وضع بروتوكول عملي لعزل Exo المشتق من الطحال في الفئران.

Introduction

الإكسوسومات (Exo) هي مجموعة فرعية من الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، يتراوح حجمها من 30 إلى 150 نانومتر ، وتغطي مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية ، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية والدهون1. هذه الجزيئات الحيوية مشتقة من الخلايا الأبوية ويتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية. يسهل Exo تبادل المعلومات الجزيئية الحيوية بين الخلايا والبيئة المكروية المحيطة بها ، ويلعب أدوارا في كل من الأنظمة بدائية النواة وحقيقيةالنواة 2. خصائص الإكسوسومات ، مثل المحتوى والحجم ومكونات الغشاء والأصل الخلوي ، متغيرة للغاية وتتأثر بنوع الخلية الأصلية والحالة الخلوية والظروف البيئية.

تصنف الإكسوسومات عادة إلى ثلاث فئات بناء على مصدرها: مشتقة من زراعة الخلايا ، ومشتقة من سوائل الجسم ، ومشتقة من الأنسجة (Ti-Exo). في حين أن الإكسوسومات المشتقة من زراعة الخلايا قد تمت دراستها على نطاق واسع نظرا لإمكانية الوصول إليها وإنتاجيتها المتسقة ، فإن استخدامها محدود بسبب التغيرات المحتملة في خصائص الخلية بعد الزراعة المطولة ، والتي قد تشوه وظائفهاالبيولوجية 3،4،5. علاوة على ذلك ، يتم الحفاظ على معظم مزارع الخلايا في بيئات ثنائية الأبعاد لا تحاكي التفاعلات بين الخلايا المعقدة في الجسم الحي ، مما قد يؤثر على تفسير البيانات6. على العكس من ذلك ، توفر الإكسوسومات المعزولة من السوائل البيولوجية خيارا طفيفا التوغل لمراقبة تطور المرض في الوقت الفعلي7. ومع ذلك ، غالبا ما تحتوي هذه العينات على مزيج من الإكسوسومات من أصول مختلفة ، مما يعقد التحديد الدقيق لمصدرهاالأساسي 8. بالنظر إلى هذه التحديات ، هناك اهتمام متزايد ب Ti-Exo ، التي توجد في الخلال خارج الخلية وهي وسطاء رئيسيون للإشارات بين الخلايا.

يلعب الطحال دورا مهما في وظيفة المناعة والحفاظ على التوازن الداخلي. على الرغم من البروتوكولات الحالية لعزل Ti-Exo عن أعضاء مثل الدماغ والكبد والأورام ، إلا أن الطرق العملية للإكسوسومات المشتقة من الطحال يتم الإبلاغ عنها بشكل محدود9،10. تهدف هذه الدراسة إلى وضع بروتوكول عملي لعزل الإكسوسومات من أنسجة الطحال في الفئران معدلة من تقرير سابق11. نحن نفصل طريقة تتضمن هضم الكولاجيناز متبوعا بالطرد المركزي الفائق ، مما يقلل من اضطراب غشاء الخلية ويضمن نقاء عاليا وإنتاجية Exo المشتق من الطحال. تم التحقق من صحة خصائص Exo المعزولة باستخدام هذا البروتوكول المعمول به من خلال المجهر الإلكتروني (TEM) ، ومقياس التدفق الخلوي النانوي (Nano-FCM) ، واللطخة الغربية ، مما يؤكد فعالية البروتوكول لمزيد من البحث التجريبي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم الحصول على العينات من الفئران ، بموافقة أخلاقية منحتها لجنة الأخلاقيات بجامعة قوانغدونغ الطبية. يتم توفير أوصاف مفصلة للمواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. يتم توضيح تفاصيل المستحضر قبل الاستخراج في الشكل 1 ، بينما يتم وصف عملية استخراج وتخصيب الطحال في الشكل 2.

1. التحضير

  1. قم بالتبريد المسبق لأجهزة الطرد المركزي عالية السرعة وفائقة السرعة إلى 4 درجات مئوية واضبط درجة حرارة شاكر سطح المكتب على 37 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد أطباق زراعة الخلايا (figure-protocol-679100 مم) ، وأنابيب الطرد المركزي المعقمة سعة 50 مل ، والثلج ، ومصفاة الخلايا المعقمة (figure-protocol-85270 ميكرومتر) كما هو موضح في الشكل 1 أ ، ب.
  3. تعقيم المقص والملقط باستخدام رذاذ كحول 75٪ ، متبوعا بالتعقيم بدرجة حرارة عالية. هذه الأدوات موضحة في الشكل 1C.
  4. ضع أنسجة الطحال في طبق بتري معقم figure-protocol-1224مقاس 100 مم على الثلج ، واغسل الدم السطحي بمحلول ملحي معقم مثلج (PBS). جفف أنسجة الطحال بشاش معقم ووزنها بعد التجفيف.
    ملحوظة: إذا تم تجميد الأنسجة ، قم بإذابة الثلج في طبق لمدة 15 دقيقة على الثلج قبل المتابعة.
  5. رطب مصفاة الخلية (figure-protocol-155370 ميكرومتر) عن طريق إسقاط 1 مل من PBS المعقم في المصفاة باستخدام ماصة نقل معقمة.
  6. قم بإعداد المخزن المؤقت للجهاز الهضمي (0.1٪ كولاجيناز من النوع الأول) باستخدام 1x PBS مع خلاط دوامة.
    ملاحظة: استخدم 10 مل من العازلة الهضمية لكل 100 مجم من أنسجة الطحال. تم اختيار تركيز الكولاجيناز في هذه الدراسة بناء على تعليمات المنتج. بالنسبة لأنواع الأنسجة الأخرى ، قد يحتاج الباحثون إلى ضبط هذه المعلمات بناء على كثافة الأنسجة وتكوينها. يوصى بإجراء تجارب أولية بتركيزات متفاوتة وأوقات هضم لتحديد الظروف المثلى لكل نوع من أنواع الأنسجة.

2. هضم الأنسجة

  1. قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة موحدة بمقص في طبق ثقافة على الجليد (الشكل 3 أ) ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام ماصة نقل معقمة.
  2. أضف عازلة الهضم إلى الأنبوب وفقا لوزن أنسجة الطحال كما هو موضح أعلاه (الشكل 3 ب) ، ثم هز الأنبوب بزاوية 45 درجة على شاكر أفقي عند 37 درجة مئوية. راقب تقدم الهضم وأوقف عملية الهضم عندما تتشتت قطع الأنسجة ، ويفقد معظمها شكلها. يجب أن يختلف وقت الهضم بين الأنسجة. في ظل الظروف التجريبية في هذه الدراسة ، يكون وقت الهضم حوالي 30 دقيقة.
  3. انقل الخليط المهضوم إلى مصفاة خلوية (Ф70 ميكرومتر) في درجة حرارة الغرفة (RT) لإزالة بقايا الأنسجة الليفية والأكبر.
    ملاحظة: الترشيح الكامل مباشرة بعد الهضم.
  4. اجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.

3. عزل الإكسوسوم عن طريق الطرد المركزي التفاضلي

  1. يتم ترشيح أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. يمكن رؤية الحبيبات التي تحتوي على الخلايا المتبقية وحطام الخلايا والنوى بعد الطرد المركزي ، كما هو موضح في الشكل 3C.
  2. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي عند 3000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يمكن رؤية الحبيبات التي تحتوي على أجسام موت الخلايا المبرمج والميكروسومات بعد الطرد المركزي ، كما هو موضح في الشكل 3D.
  3. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يمكن رؤية الحبيبات التي تحتوي على الحويصلات الدقيقة وغشاء البلازما بعد الطرد المركزي ، كما هو موضح في الشكل 3E.
  4. الطرد المركزي الفائق الناتج عند 120,000 × غرام لمدة 2 ساعة عند 4 درجة مئوية. يمكن رؤية الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب بعد الطرد المركزي ، كما هو موضح في الشكل 3F.
  5. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات باستخدام PBS ، وجهاز الطرد المركزي الفائق مرة أخرى عند 120,000 × جم لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية للحصول على الإكسوسومات. يمكن رؤية الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب بعد الطرد المركزي ، كما هو موضح في الشكل 3G.
  6. قم بإذابة الإكسوسومات المعزولة باستخدام PBS معقم (200 ميكرولتر لكل طحال) وتخزين الإكسوسومات المعزولة في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 2 مل عند -80 درجة مئوية.

4. توصيف الإكسوسوم عن طريق المجهر الإلكتروني (TEM)

ملاحظة: تم استخدام TEM لتحديد ما إذا كان Exo المستخرج يعرض خصائص الحويصلة. يجب أن تكون عينات Exo التي تم تحديدها بواسطة المجهر الإلكتروني عينات جديدة أو مخزنة لفترة وجيزة عند 4 درجات مئوية لفترة قصيرة.

  1. إصلاح الإكسوسومات (2-6 ميكروغرام / ميكرولتر) مع 2٪ من المجهر الإلكتروني (EM) درجة بارافورمالدهيد في RT لمدة ساعتين.
  2. ضع 10 ميكرولتر من محلول الإكسوسوم على شبكة نحاسية ، واحتضنه في RT لمدة 10 دقائق ، واشطفه بالماء المقطر المعقم ، وامسح السائل الزائد بورق ماص.
  3. قم بتلطيخ الشبكة النحاسية بخلات اليورانيل بنسبة 2٪ لمدة دقيقة واحدة ، وامسح السوائل الزائدة بورق الترشيح ، وجففها تحت مصباح متوهج لمدة دقيقتين.
  4. راقب العينة المحضرة تحت المجهر الإلكتروني الناقل عند 80 كيلو فولت.

5. توزيع الحجم وقياس تركيز الجسيمات للإكسوسومات

  1. قم بتحميل جزيئات البوليسترين النانوية القياسية (250 نانومتر) إلى مقياس التدفق الخلوي النانوي.
  2. قم بقياس تركيز البروتين في عينات Exo باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA. قم بتخفيف عينة Exo باستخدام PBS وفقا لنتائج فحص البروتين BCA (قم بتخفيف الإكسوسومات إلى 1-10 نانوغرام / ميكرولتر) ، ثم قم بتحميل عينات Exo إلى التدفق النانوي لقياس شدة التشتت الجانبي (SSI).
  3. احسب تركيز Exo وفقا لنسبة SSI إلى تركيز الجسيمات في جزيئات البوليسترين النانوية القياسية.
    ملاحظة: لقياس الحجم ، يتم إنشاء منحنى قياسي عن طريق تحميل جزيئات السيليكا النانوية القياسية بأحجام التدرج (68 نانومتر ، 91 نانومتر ، 113 نانومتر ، 155 نانومتر) إلى مقياس التدفق الخلوي النانوي. يتبع تحميل عينة Exo. تم حساب توزيع حجم Exo وفقا للعلاج القياسي.

6. تأكيد التحلل واللطخة المناعية لبروتينات الإكسوسوم

  1. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل مقايسة الترسيب المناعي الراديوي (RIPA) إلى حبيبات الإكسوسوم لتحليل البروتين.
  2. دوامة بقوة ، قم بتغطيتها مع parafilm ، صخرة لمدة 20 دقيقة في RT ، ثم دوامة مرة أخرى.
  3. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة عند 1000 × جم لمدة 30-60 ثانية لجمع العينة ، ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل ، وتخزينه عند -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية حتى التحليل.
  4. بالنسبة للبقعة المناعية ، امزج العينات مع مخزن مؤقت للتحميل 5x لتحقيق تركيز 1x والاستعداد للرحلان الكهربائي للهلام.
  5. إذا كانت أدوات التحكم في تجانس الأنسجة الكاملة مطلوبة ، فاستخدم عازلة تحلل قوية مع مثبط للبروتياز لتحلل الأنسجة ، كما هو مفصل أعلاه. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المصفوفة خارج الخلية المتبقية أو الخلايا الكاملة أو الحطام الخلوي السليم.
  6. قم بغلي المخزن المؤقت للعينة الذي يحتوي على الإكسوسومات أو تجانس الأنسجة عند 95 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق. قم بتحميل بروتين متساو لكل حارة في جل SDS-PAGE بنسبة 10٪. تحميل بروتين متساو من تجانس الأنسجة كمراقبة.
  7. استمر في الرحلان الكهربائي للهلام تحت جهد 80 فولت لمدة 2 ساعة تقريبا باستخدام المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي التقليدي. قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية لتأكيد تعبير بروتين Exo في المحللات المنقاة ومقارنة وفرة Exo النسبية في الكسور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

عزل وتنقية الإكسوسومات المشتقة من الطحال
لعزل الإكسوسومات من أنسجة طحال الفأر ، استخدمنا مزيجا من هضم الكولاجيناز والطرد المركزي التفاضلي (الشكل 2). تضمنت الخطوات الأولية المعالجة المسبقة لأنسجة الطحال لإزالة الدم السطحي ، متبوعا بالهضم باست...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

أفادت الأبحاث الحديثة أن الإكسوسومات المشتقة من الطحال (Spleen-Exo) تلعب دورا مهما في علاج سرطانالمعدة 12. لتوضيح وظائف Spleen-Exo بشكل أكبر ، من الضروري إنشاء طريقة قابلة للتكرار ومثالية لاستخراجها من أنسجة الطحال. في حين أن البروتوكولات موجودة لعزل الإكسوسومات من س?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82370281 ، 81870222) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة قوانغدونغ (2022A1515012103) ، ومشروع التخصيص التنافسي للصندوق الخاص لتطوير التكنولوجيا في مدينة تشانجيانغ (2021A05086) ، ومؤسسة بدء التشغيل من المستشفى الثاني التابع لجامعة قوانغدونغ الطبية (23H03).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
70 µm Cell StrainerBiologix Group Co., Ltd.USA15-1070
Anti CD9 antibodyCell Signaling Technology, Inc (CST), USA983275
Anti GM130 antibodyProteintech Group, Inc.China 66662-1-lg
Anti TSG101 antibodyAbcam Plc, UK125011
Cell Culture DishWuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China704001
Centrifuge tubeWuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China788211
Collagenase Type ISigma-Aldrich Corp., USAC2674
Desktop Thermostatic ShakerShanghai bluepard instruments Co., Ltd., ChinaTHZ-100
Electrophoresis bufferWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China G2081-1L
Enhanced BCA Protein Assay KitShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China P0010S
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc., ChinaN30E
Fluorescence/Chemiluminescence imaging system Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., ChinaGelView 6000Plus
HRP Goat anti-Mouse IgGProteintech Group, Inc.China 15014
HRP Goat anti-Rabbit IgGProteintech Group, Inc.China 15015
microplate readerMolecular Devices, USACMax Plus
MicroscissorsShanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,ChinaWA1010
Microscopic tweezersShanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,ChinaWA3010
Multifuge X1R Pro centrifugeThermo Fisher Scientific, USA75009750
Ophthalmic scissorsShanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,ChinaY00030
Ophthalmic tweezersShanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd., China JD1060
Optima XPN-100 Ultrafiltration centrifugeBeckman Coulter, USAA94469
phosphate buffered saline (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., ChinaP1003
RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China P0013K
RulerDeli Manufacturing Company, China
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China P0015
Transfer PipetBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
Transmission Electron MicroscopeHitachi, JapanH-7650
Ultracentrifugation tubeBeckman Coulter, USA355618
Western Transfer Buffer Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China G2028-1L

References

  1. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).
  2. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  3. Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  4. de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine. Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).
  5. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  6. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  7. Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics. Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).
  8. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).
  9. Wang, X., et al. An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue. J Vis Exp. (192), e64499(2023).
  10. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
  11. Hoshino, A., et al. Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers. Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).
  12. Chen, Y., et al. Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes. Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).
  13. Useckaite, Z., et al. Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles. Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).
  14. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).
  15. Lai, J. J., et al. Exosome processing and characterization approaches for research and technology development. Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).
  16. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  17. Roh, Y. J., et al. Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model. PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).
  18. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).
  19. Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review. Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).
  20. Menu, E., Vanderkerken, K. Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).
  21. Shen, S., et al. Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins. iScience. 26 (4), 106521(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved