Isolamento e caracterização de exossomos derivados de tecidos de baço de camundongo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar exossomos derivados do baço de camundongo usando uma combinação de digestão com colagenase tipo I e ultracentrifugação.

Resumo

Os exossomos (Exo) são estruturas de bicamada lipídica secretadas por várias células, incluindo as de animais, plantas e procariontes. Estudos anteriores revelaram que o Exo derivado de sobrenadante humoral ou celular é alvo promissor para novos biomarcadores diagnósticos ou prognósticos, ressaltando seu papel significativo na patogênese da doença. O Exo derivado de tecido (Ti-Exo) tem atraído cada vez mais atenção devido à sua capacidade de refletir com precisão a especificidade do tecido e o microambiente. Ti-Exo, presente no espaço intersticial, desempenha papéis cruciais na comunicação intercelular e na sinalização entre órgãos. Apesar de seu valor reconhecido na elucidação de mecanismos de doenças, o isolamento de Ti-Exo continua sendo um desafio devido à complexidade das matrizes teciduais e à variabilidade nos métodos de extração. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo prático para isolar exossomos do tecido do baço de camundongos, fornecendo uma técnica reprodutível para posterior análise de identificação e estudos funcionais. Usamos digestão de colagenase tipo I combinada com ultracentrifugação diferencial para isolar Exo derivado do baço. As características do Exo isolado foram determinadas por meio de microscopia eletrônica, citômetro de nanofluxo e western blot. O Exo isolado derivado do baço exibiu a morfologia típica das vesículas de bicamada lipídica, com tamanhos de partícula variando de 30 nm a 150 nm. Além disso, o perfil de expressão dos marcadores de exossomos confirmou a presença e pureza dos exossomos. Em conjunto, estabelecemos com sucesso um protocolo prático para isolar o Exo derivado do baço em camundongos.

Introdução

Os exossomos (Exo) são um subgrupo de vesículas extracelulares (EVs), variando de 30 a 150 nm de tamanho, encapsulando uma gama diversificada de biomoléculas, incluindo proteínas, ácidos nucléicos e lipídios¹. Essas biomoléculas são derivadas das células parentais e são liberadas no espaço extracelular. O Exo facilita a troca de informações biomoleculares entre as células e seu microambiente circundante, desempenhando papéis nos sistemas procariótico e eucariótico². As características dos exossomos, como conteúdo, tamanho, componentes da membrana e origem celular, são altamente variáveis e influenciadas pelo tipo de célula de origem, estado celular e condições ambientais.

Os exossomos são comumente classificados em três categorias com base em sua fonte: derivados de cultura de células, derivados de fluidos corporais e derivados de tecidos (Ti-Exo). Embora os exossomos derivados de cultura de células tenham sido extensivamente estudados devido à sua acessibilidade e rendimento consistente, seu uso é limitado por possíveis alterações nas características celulares após cultura prolongada, o que pode deturpar suas funções biológicas ^3,4,5. Além disso, a maioria das culturas de células é mantida em ambientes bidimensionais que não imitam as complexas interações intercelulares in vivo, potencialmente impactando a interpretação dos dados⁶. Por outro lado, exossomos isolados de fluidos biológicos oferecem uma opção minimamente invasiva para monitorar a progressão da doença em tempo real⁷. No entanto, essas amostras geralmente contêm uma mistura de exossomos de várias origens, complicando a identificação precisa de sua fonte primária⁸. Dados esses desafios, há um interesse crescente no Ti-Exo, que reside no interstício extracelular e é um dos principais mediadores da sinalização intercelular.

O baço desempenha um papel crucial na função imunológica e na manutenção da homeostase interna. Apesar dos protocolos existentes para isolar Ti-Exo de órgãos como cérebro, fígado e tumores, métodos práticos para exossomos derivados do baço são relatados de forma limitada ^9,10. Este estudo teve como objetivo estabelecer um protocolo prático para isolamento de exossomos do tecido esplênico em camundongos modificado a partir de um relato anterior¹¹. Detalhamos um método que envolve a digestão da colagenase seguida de ultracentrifugação, que minimiza a ruptura da membrana celular e garante alta pureza e rendimento do Exo derivado do baço. As características do Exo isolado usando este protocolo estabelecido foram validadas por meio de microscopia eletrônica (TEM), citômetro de nanofluxo (Nano-FCM) e western blot, confirmando a eficácia do protocolo para pesquisas experimentais futuras.

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Protocolo

As amostras foram obtidas de camundongos, com aprovação ética concedida pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Guangdong. Descrições detalhadas de materiais, equipamentos e software usados neste protocolo são fornecidas na Tabela de Materiais. Os detalhes da preparação antes da extração são ilustrados na Figura 1, enquanto o processo de extração e enriquecimento do Spleen-Exo é descrito na Figura 2.

1. Preparação

1. Pré-arrefecer centrífugas de alta e ultra-alta velocidade a 4 °C e ajustar a temperatura de um agitador de mesa a 37 °C.
2. Prepare placas de cultura de células (100 mm), tubos de centrífuga estéreis de 50 mL, gelo e filtro de células estéreis (70 μm) conforme mostrado na Figura 1A, B.
3. Esterilize tesouras e pinças com spray de álcool 75%, seguido de esterilização em alta temperatura. Essas ferramentas são mostradas na Figura 1C.
4. Coloque o tecido do baço em uma placa de Petri estéril de 100 mm no gelo e lave o sangue da superfície com 1x solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) gelada. Seque os tecidos do baço com gaze estéril e pese-os após a secagem.
   NOTA: Se o tecido estiver congelado, descongele-o em um prato por 15 min no gelo antes de prosseguir.
5. Hidrate o filtro de células (70 μm) colocando 1 mL de PBS estéril no filtro usando uma pipeta de transferência estéril.
6. Prepare o tampão digestivo (0,1% colagenase tipo I) usando 1x PBS com um misturador de vórtice.
   NOTA: Use 10 mL de tampão digestivo para cada 100 mg de tecido do baço. A concentração de colagenase foi escolhida neste estudo com base nas instruções do produto. Para outros tipos de tecido, os pesquisadores podem precisar ajustar esses parâmetros com base na densidade e composição do tecido. Experimentos preliminares com concentrações e tempos de digestão variados são recomendados para determinar as condições ideais para cada tipo de tecido.

2. Digestão de tecidos

1. Pique o tecido em pequenos pedaços uniformes com uma tesoura em uma placa de cultura sobre gelo (Figura 3A) e transfira para um tubo de centrífuga de 50 mL com uma pipeta de transferência estéril.
2. Adicione o tampão de digestão ao tubo de acordo com o peso do tecido do baço, conforme indicado acima (Figura 3B), agite o tubo com um ângulo de 45° em um agitador horizontal a 37 °C. Monitore o progresso da digestão e pare a digestão quando os pedaços de tecido se dispersarem e a maioria perder a forma. O tempo de digestão deve variar entre os tecidos. Nas condições experimentais deste estudo, o tempo de digestão é de aproximadamente 30 min.
3. Transferir a mistura digerida para um filtro celular (Ф70 μm) à temperatura ambiente (RT) para remover os detritos fibrosos e de tecido maior.
   NOTA: Filtração completa imediatamente após a digestão.
4. Recolher o filtrado num novo tubo de centrifugação de 50 ml.

3. Isolamento de exossomos por centrifugação diferencial

1. Centrifugar os filtrados a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Um pellet contendo células residuais, detritos celulares e núcleos pode ser visto após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3C.
2. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar a 3000 x g durante 20 min a 4 °C. Um pellet contendo corpos apoptóticos e microssomas pode ser visto após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3D.
3. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C. Pellet contendo microvesículas e membrana plasmática pode ser visto após centrifugação, conforme mostrado na Figura 3E.
4. Ultracentrifugar o sobrenadante resultante a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C. Um pellet pode ser visto no fundo do tubo após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3F.
5. Rejeitar o sobrenadante, lavar o sedimento com PBS e voltar a fazer a ultracentrifugação a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C para obter exossomas. Um pellet pode ser visto no fundo do tubo após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3G.
6. Dissolver os exossomas isolados com PBS estéril (200 μL por baço) e armazenar os exossomas isolados num novo tubo de centrifugação de 2 ml a -80 °C.

4. Caracterização de exossomas por microscopia eletrónica de transmissão (MET)

NOTA: O TEM foi usado para determinar se o Exo extraído exibia características de vesícula. As amostras Exo identificadas por microscopia electrónica devem ser amostras frescas ou armazenadas brevemente a 4 °C durante um curto período de tempo.

1. Fixe os exossomos (2-6 μg / μL) com paraformaldeído de grau de microscopia eletrônica (EM) a 2% em RT por 2 h.
2. Coloque 10 μL de solução de exossomo em uma malha de cobre, incube em RT por 10 min, enxágue com água destilada estéril e seque o excesso de líquido com papel absorvente.
3. Manchar a malha de cobre com acetato de uranilo a 2% por 1 min, secar o excesso de líquido com papel de filtro e secar sob uma lâmpada incandescente por 2 min.
4. Observar a amostra preparada ao microscópio electrónico de transmissão a 80 kV.

5. Distribuição de tamanho e medição da concentração de partículas de exossomos

1. Carregar as nanopartículas de poliestireno padrão (250 nm) no citómetro de nanofluxo.
2. Meça a concentração de proteína de amostras Exo usando um kit de ensaio de proteína BCA. Dilua a amostra Exo com PBS de acordo com os resultados do ensaio de proteína BCA (dilua os exossomos para 1-10 ng/μL) e, em seguida, carregue as amostras Exo no nanofluxo para medir a intensidade de dispersão lateral (SSI).
3. Calcule a concentração de Exo de acordo com a proporção de SSI para concentração de partículas nas nanopartículas de poliestireno padrão.
   NOTA: Para medição de tamanho, uma curva padrão é gerada carregando nanopartículas de sílica padrão com tamanhos de gradiente (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) para o citômetro de nanofluxo. O carregamento da amostra Exo segue isso. A distribuição de tamanho do Exo foi calculada de acordo com a cura padrão.

6. Confirmação de lise e immunoblot de proteínas exossômicas

1. Adicione 100 μL de tampão de lise de ensaio de imunoprecipitação de rádio (RIPA) ao pellet de exossomo para análise de proteínas.
2. Vórtice vigorosamente, cubra com parafilme, balance por 20 min em RT e depois vórtice novamente.
3. Centrifugue brevemente a 1000 x g por 30-60 s para coletar a amostra, transfira para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e armazene a -20 ° C a -80 ° C até a análise.
4. Para immunoblot, misture amostras com tampão de carga 5x para atingir uma concentração de 1x e prepare-se para eletroforese em gel.
5. Se forem desejados controles de homogeneizado de tecido inteiro, use um tampão de lise forte com um inibidor de protease para lisar o tecido, conforme detalhado acima. Em seguida, centrifugue as amostras a 10.000 x g por 10 min e descarte a matriz extracelular restante, células inteiras ou detritos celulares intactos.
6. Ferva o tampão de amostra contendo exossomos ou homogeneizado de tecido a 95 °C por 5-10 min. Carregue a mesma proteína por pista em um gel SDS-PAGE a 10%. Carregue a proteína igual do homogeneizado do tecido como controle.
7. Prossiga com a eletroforese em gel sob uma tensão de 80 V por aproximadamente 2 h usando o tampão de eletroforese convencional. Realize a análise de western blot para confirmar a expressão da proteína Exo nos lisados purificados e comparar a abundância relativa de Exo em frações.

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Resultados

Isolamento e purificação de exossomos derivados do baço
Para isolar os exossomos do tecido do baço de camundongos, empregamos uma combinação de digestão de colagenase e ultracentrifugação diferencial (Figura 2). As etapas iniciais envolveram o pré-tratamento do tecido do baço para remover o sangue da superfície, seguido pela digestão com colagenase tipo I. Esse tratamento enzimático facilitou a quebra dos componentes da matr...

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Discussão

Pesquisas recentes relataram que os exossomos derivados do baço (Spleen-Exo) desempenham um papel crítico no tratamento do câncer gástrico¹². Para elucidar ainda mais as funções do Spleen-Exo, é necessário estabelecer um método reprodutível e ideal para sua extração do tecido do baço. Embora existam protocolos para isolar exossomos de câncer cerebral e hepático^13,14, os métodos para outros ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 µm Cell Strainer	Biologix Group Co., Ltd.USA	15-1070
Anti CD9 antibody	Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA	983275
Anti GM130 antibody	Proteintech Group, Inc.China	66662-1-lg
Anti TSG101 antibody	Abcam Plc, UK	125011
Cell Culture Dish	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	704001
Centrifuge tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	788211
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich Corp., USA	C2674
Desktop Thermostatic Shaker	Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., China	THZ-100
Electrophoresis buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2081-1L
Enhanced BCA Protein Assay Kit	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0010S
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc., China	N30E
Fluorescence/Chemiluminescence imaging system	Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China	GelView 6000Plus
HRP Goat anti-Mouse IgG	Proteintech Group, Inc.China	15014
HRP Goat anti-Rabbit IgG	Proteintech Group, Inc.China	15015
microplate reader	Molecular Devices, USA	CMax Plus
Microscissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA1010
Microscopic tweezers	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA3010
Multifuge X1R Pro centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	75009750
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	Y00030
Ophthalmic tweezers	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd., China	JD1060
Optima XPN-100 Ultrafiltration centrifuge	Beckman Coulter, USA	A94469
phosphate buffered saline (PBS)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., China	P1003
RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors)	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0013K
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0015
Transfer Pipet	Biologix Group Co., Ltd.USA	30-0238A1
Transmission Electron Microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Ultracentrifugation tube	Beckman Coulter, USA	355618
Western Transfer Buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2028-1L