Isolement et caractérisation d’exosomes dérivés de tissus de rate de souris

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour isoler les exosomes dérivés de la rate de souris en utilisant une combinaison de digestion avec de la collagénase de type I et d’ultracentrifugation.

Résumé

Les exosomes (Exo) sont des structures bicouches lipidiques sécrétées par diverses cellules, y compris celles des animaux, des plantes et des procaryotes. Des études antérieures ont révélé que les Exo dérivés de l’humorale ou du surnageant cellulaire sont des cibles prometteuses pour de nouveaux biomarqueurs diagnostiques ou pronostiques, soulignant leur rôle significatif dans la pathogenèse de la maladie. Les Exo d’origine tissulaire (Ti-Exo) ont attiré de plus en plus d’attention en raison de leur capacité à refléter avec précision la spécificité des tissus et le microenvironnement. Ti-Exo, présent dans l’espace interstitiel, joue un rôle crucial dans la communication intercellulaire et la signalisation inter-organes. Malgré leur valeur reconnue dans l’élucidation des mécanismes pathologiques, l’isolement de Ti-Exo reste difficile en raison de la complexité des matrices tissulaires et de la variabilité des méthodes d’extraction. Dans cette étude, nous avons développé un protocole pratique pour isoler les exosomes du tissu de la rate de souris, fournissant une technique reproductible pour l’analyse d’identification ultérieure et les études fonctionnelles. Nous avons utilisé la digestion à la collagénase de type I combinée à l’ultracentrifugation différentielle pour isoler l’exo dérivé de la rate. Les caractéristiques de l’Exo isolé ont été déterminées par microscopie électronique, cytomètre en nano-flux et transfert Western. L’Exo isolé dérivé de la rate a montré la morphologie typique des vésicules bicouches lipidiques, avec des tailles de particules allant de 30 nm à 150 nm. De plus, le profil d’expression des marqueurs d’exosomes a confirmé la présence et la pureté des exosomes. Dans l’ensemble, nous avons réussi à établir un protocole pratique pour isoler l’Exo dérivé de la rate chez la souris.

Introduction

Les exosomes (Exo) sont un sous-groupe de vésicules extracellulaires (VE), d’une taille allant de 30 à 150 nm, encapsulant un large éventail de biomolécules, notamment des protéines, des acides nucléiques et des lipides¹. Ces biomolécules sont dérivées des cellules parentales et sont libérées dans l’espace extracellulaire. Exo facilite l’échange d’informations biomoléculaires entre les cellules et leur microenvironnement environnant, jouant un rôle dans les systèmes procaryotes et eucaryotes². Les caractéristiques des exosomes, telles que le contenu, la taille, les composants membranaires et l’origine cellulaire, sont très variables et influencées par le type de cellule d’origine, l’état cellulaire et les conditions environnementales.

Les exosomes sont généralement classés en trois catégories en fonction de leur source : dérivé de la culture cellulaire, dérivé des fluides corporels et dérivé des tissus (Ti-Exo). Bien que les exosomes dérivés de cultures cellulaires aient été largement étudiés en raison de leur accessibilité et de leur rendement constant, leur utilisation est limitée par des altérations potentielles des caractéristiques cellulaires après une culture prolongée, ce qui peut dénaturer leurs fonctions biologiques ^3,4,5. De plus, la plupart des cultures cellulaires sont maintenues dans des environnements bidimensionnels qui n’imitent pas les interactions intercellulaires complexes in vivo, ce qui pourrait avoir un impact sur l’interprétation des données⁶. À l’inverse, les exosomes isolés à partir de fluides biologiques offrent une option peu invasive pour suivre la progression de la maladie en temps réel⁷. Cependant, ces échantillons contiennent souvent un mélange d’exosomes d’origines diverses, ce qui complique l’identification précise de leur source primaire⁸. Compte tenu de ces défis, il y a un intérêt croissant pour Ti-Exo, qui réside dans l’interstitium extracellulaire et sont des médiateurs clés de la signalisation intercellulaire.

La rate joue un rôle crucial dans la fonction immunitaire et le maintien de l’homéostasie interne. Malgré les protocoles existants pour isoler Ti-Exo d’organes tels que le cerveau, le foie et les tumeurs, les méthodes pratiques pour les exosomes dérivés de la rate sont limitées ^9,10. Cette étude visait à établir un protocole pratique pour isoler les exosomes du tissu de la rate chez des souris modifiées à partir d’un rapport précédent¹¹. Nous détaillons une méthode impliquant une digestion par collagénase suivie d’une ultracentrifugation, qui minimise la perturbation de la membrane cellulaire et garantit une pureté et un rendement élevés d’Exo dérivé de la rate. Les caractéristiques de l’Exo isolé à l’aide de ce protocole établi ont été validées par microscopie électronique (MET), cytomètre en nano-flux (Nano-FCM) et transfert Western, confirmant l’efficacité du protocole pour d’autres recherches expérimentales.

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Protocole

Les échantillons ont été obtenus à partir de souris, avec l’approbation éthique accordée par le Comité d’éthique de l’Université de médecine du Guangdong. Des descriptions détaillées des matériaux, de l’équipement et des logiciels utilisés dans ce protocole sont fournies dans la Table des matériaux. Les détails de la préparation avant l’extraction sont illustrés à la figure 1, tandis que le processus d’extraction et d’enrichissement de Spleen-Exo est décrit à la figure 2.

1. Préparation

1. Pré-refroidissez les centrifugeuses à grande vitesse et à ultra-haute vitesse à 4 °C et réglez la température d’un agitateur de bureau à 37 °C.
2. Préparez des boîtes de culture cellulaire (100 mm), des tubes à centrifuger stériles de 50 ml, de la glace et une passoire à cellules stériles (70 μm) comme illustré aux figures 1A et B.
3. Stérilisez les ciseaux et les pinces à l’aide d’un spray d’alcool à 75 %, suivi d’une stérilisation à haute température. Ces outils sont illustrés à la figure 1C.
4. Placez le tissu de la rate dans une boîte de Pétri stérile de 100 mm sur de la glace et lavez le sang de surface avec 1 solution saline stérile glacée tamponnée au phosphate (PBS). Séchez les tissus de la rate avec de la gaze stérile et pesez-les après séchage.
   REMARQUE : Si le tissu est congelé, décongelez-le dans un plat pendant 15 minutes sur de la glace avant de continuer.
5. Hydratez la crépine cellulaire (70 μm) en déposant 1 mL de PBS stérile dans la passoire à l’aide d’une pipette de transfert stérile.
6. Préparez le tampon digestif (0,1 % de collagénase de type I) à l’aide de 1x PBS avec un mélangeur vortex.
   REMARQUE : Utiliser 10 ml de tampon digestif pour 100 mg de tissu de la rate. La concentration de collagénase a été choisie dans cette étude sur la base des instructions du produit. Pour d’autres types de tissus, les chercheurs peuvent avoir besoin d’ajuster ces paramètres en fonction de la densité et de la composition des tissus. Des expériences préliminaires avec des concentrations et des temps de digestion variables sont recommandées pour déterminer les conditions optimales pour chaque type de tissu.

2. Digestion des tissus

1. Coupez le tissu en petits morceaux uniformes à l’aide de ciseaux dans une boîte de culture sur de la glace (figure 3A) et transférez-le dans un tube à centrifuger de 50 ml à l’aide d’une pipette de transfert stérile.
2. Ajouter le tampon de digestion dans le tube en fonction du poids du tissu de la rate comme indiqué ci-dessus (figure 3B), puis agiter le tube avec un angle de 45° sur un agitateur horizontal à 37 °C. Surveillez la progression de la digestion et arrêtez la digestion lorsque les morceaux de tissu se sont dispersés et que la plupart ont perdu leur forme. Le temps de digestion doit varier entre les tissus. Dans les conditions expérimentales de cette étude, le temps de digestion est d’environ 30 min.
3. Transférez le mélange digéré dans une passoire cellulaire (Ф70 μm) à température ambiante (RT) pour éliminer les débris tissulaires fibreux et plus gros.
   REMARQUE : Terminer la filtration immédiatement après la digestion.
4. Recueillir le filtrat dans un tube à centrifuger neuf de 50 ml.

3. Isolement des exosomes par centrifugation différentielle

1. Filtrats de centrifugation à 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Une pastille contenant des cellules résiduelles, des débris cellulaires et des noyaux peut être observée après centrifugation, comme le montre la figure 3C.
2. Transvasez le surnageant dans un nouveau tube et centrifugez-le à 3000 x g pendant 20 min à 4 °C. Une pastille contenant des corps apoptotiques et des microsomes peut être observée après centrifugation, comme le montre la figure 3D.
3. Transvasez le surnageant dans un tube neuf et centrifugez-le à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Des pastilles contenant des microvésicules et une membrane plasmique peuvent être observées après centrifugation, comme le montre la figure 3E.
4. Ultracentrifuger le surnageant résultant à 120 000 x g pendant 2 h à 4 °C. Une pastille peut être vue au fond du tube après centrifugation, comme le montre la figure 3F.
5. Jetez le surnageant, lavez la pastille avec du PBS et ultracentrifugez-la à nouveau à 120 000 x g pendant 2 h à 4 °C pour obtenir des exosomes. Une pastille peut être vue au fond du tube après centrifugation, comme le montre la figure 3G.
6. Dissoudre les exosomes isolés avec du PBS stérile (200 μL par rate) et stocker les exosomes isolés dans un tube à centrifuger neuf de 2 mL à -80 °C.

4. Caractérisation des exosomes par microscopie électronique à transmission (MET)

REMARQUE : La MET a été utilisée pour déterminer si l’Exo extrait présentait des caractéristiques vésiculaires. Les échantillons Exo identifiés par microscopie électronique doivent être des échantillons frais ou stockés brièvement à 4 °C pendant une courte période.

1. Fixer les exosomes (2-6 μg/μL) avec du paraformaldéhyde de qualité microscopie électronique (EM) à 2 % à RT pendant 2 h.
2. Déposer 10 μL de solution d’exosomes sur un treillis de cuivre, incuber à RT pendant 10 min, rincer à l’eau distillée stérile et éponger l’excès de liquide avec du papier absorbant.
3. Teignez le treillis de cuivre avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 1 min, épongez l’excès de liquide avec du papier filtre et séchez-le sous une lampe à incandescence pendant 2 min.
4. Observez l’échantillon préparé au microscope électronique à transmission à 80 kV.

5. Mesure de la distribution granulométrique et de la concentration en particules des exosomes

1. Chargez les nanoparticules de polystyrène standard (250 nm) sur le cytomètre en nanoflux.
2. Mesurez la concentration en protéines des échantillons d’Exo à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA. Diluez l’échantillon Exo avec du PBS selon les résultats du dosage des protéines BCA (diluez les exosomes à 1-10 ng/μL), puis chargez les échantillons Exo dans le nano-flux pour mesurer l’intensité de la diffusion latérale (SSI).
3. Calculer la concentration d’Exo en fonction du rapport entre le SSI et la concentration de particules dans les nanoparticules de polystyrène standard.
   REMARQUE : Pour la mesure de la taille, une courbe standard est générée en chargeant des nanoparticules de silice standard avec des tailles de gradient (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) dans le nanocytomètre en flux. Le chargement de l’échantillon Exo s’ensuit ainsi. La distribution granulométrique d’Exo a été calculée selon la polymérisation standard.

6. Confirmation par lyse et immunoblot des protéines d’exosomes

1. Ajouter 100 μL de tampon de lyse par dosage par radio-immunoprécipitation (RIPA) à la pastille d’exosome pour l’analyse des protéines.
2. Vortex vigoureusement, couvrir de parafilm, basculer pendant 20 min à RT, puis vortex à nouveau.
3. Centrifuger brièvement à 1000 x g pendant 30 à 60 s pour recueillir l’échantillon, le transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL et le stocker à -20 °C à -80 °C jusqu’à l’analyse.
4. Pour l’immunoblot, mélanger les échantillons avec un tampon de charge 5x pour obtenir une concentration de 1x et se préparer à l’électrophorèse sur gel.
5. Si l’on souhaite des contrôles d’homogénat de tissu entier, utilisez un tampon de lyse puissant avec un inhibiteur de protéase pour lyser le tissu, comme indiqué ci-dessus. Ensuite, centrifugez les échantillons à 10 000 x g pendant 10 min et jetez la matrice extracellulaire restante, les cellules entières ou les débris cellulaires intacts.
6. Faire bouillir le tampon d’échantillon contenant des exosomes ou l’homogénat de tissu à 95 °C pendant 5 à 10 min. Chargez une quantité égale de protéines par voie dans un gel SDS-PAGE à 10 %. Charge égale de protéine de l’homogénat de tissu comme témoin.
7. Procéder à l’électrophorèse sur gel sous une tension de 80 V pendant environ 2 h à l’aide du tampon d’électrophorèse classique. Effectuer une analyse par transfert Western pour confirmer l’expression de la protéine Exo dans les lysats purifiés et comparer l’abondance relative d’Exo en fractions.

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Résultats

Isolement et purification d’exosomes dérivés de la rate
Pour isoler les exosomes du tissu de la rate de souris, nous avons utilisé une combinaison de digestion de la collagénase et d’ultracentrifugation différentielle (Figure 2). Les premières étapes consistaient à prétraiter le tissu de la rate pour éliminer le sang de surface, suivi d’une digestion avec de la collagénase de type I. Ce traitement enzymatique a facilité ...

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Discussion

Des recherches récentes ont révélé que les exosomes dérivés de la rate (Spleen-Exo) jouent un rôle essentiel dans le traitement du cancer gastrique¹². Pour élucider davantage les fonctions de Spleen-Exo, il est nécessaire d’établir une méthode reproductible et optimale pour leur extraction du tissu de la rate. Bien qu’il existe des protocoles pour isoler les exosomes du cancer du cerveau et du foie^13,14

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 µm Cell Strainer	Biologix Group Co., Ltd.USA	15-1070
Anti CD9 antibody	Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA	983275
Anti GM130 antibody	Proteintech Group, Inc.China	66662-1-lg
Anti TSG101 antibody	Abcam Plc, UK	125011
Cell Culture Dish	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	704001
Centrifuge tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	788211
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich Corp., USA	C2674
Desktop Thermostatic Shaker	Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., China	THZ-100
Electrophoresis buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2081-1L
Enhanced BCA Protein Assay Kit	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0010S
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc., China	N30E
Fluorescence/Chemiluminescence imaging system	Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China	GelView 6000Plus
HRP Goat anti-Mouse IgG	Proteintech Group, Inc.China	15014
HRP Goat anti-Rabbit IgG	Proteintech Group, Inc.China	15015
microplate reader	Molecular Devices, USA	CMax Plus
Microscissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA1010
Microscopic tweezers	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA3010
Multifuge X1R Pro centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	75009750
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	Y00030
Ophthalmic tweezers	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd., China	JD1060
Optima XPN-100 Ultrafiltration centrifuge	Beckman Coulter, USA	A94469
phosphate buffered saline (PBS)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., China	P1003
RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors)	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0013K
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0015
Transfer Pipet	Biologix Group Co., Ltd.USA	30-0238A1
Transmission Electron Microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Ultracentrifugation tube	Beckman Coulter, USA	355618
Western Transfer Buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2028-1L