בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אקסוזומים שמקורם בטחול עכברים באמצעות שילוב של עיכול עם קולגן מסוג I ואולטרה-צנטריפוגה.

Abstract

אקסוזומים (Exo) הם מבנים דו-שכבתיים ליפידים המופרשים על ידי תאים שונים, כולל אלה של בעלי חיים, צמחים ופרוקריוטים. מחקרים קודמים גילו כי אקסו שמקורו בהומור או בסופרנאטנט תאי הם מטרות מבטיחות לסמנים ביולוגיים אבחוניים או פרוגנוסטיים חדשים, מה שמדגיש את תפקידם המשמעותי בפתוגנזה של מחלות. Exo שמקורו ברקמה (Ti-Exo) משך תשומת לב גוברת בשל יכולתו לשקף במדויק את ספציפיות הרקמה ואת המיקרו-סביבה. Ti-Exo, הנוכח בחלל הבין-תאי, ממלא תפקידים מכריעים בתקשורת בין-תאית ובאיתות חוצה איברים. למרות הערך המוכר שלהם בהבהרת מנגנוני המחלה, בידוד Ti-Exo נותר מאתגר בשל מורכבות מטריצות הרקמה והשונות בשיטות החילוץ. במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול מעשי לבידוד אקסוזומים מרקמת הטחול של עכברים, המספק טכניקה הניתנת לשחזור לניתוח זיהוי עוקב ולמחקרים פונקציונליים. השתמשנו בעיכול קולגנאז מסוג I בשילוב עם אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד אקסו שמקורו בטחול. המאפיינים של אקסו המבודד נקבעו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, ציטומטר זרימת ננו וכתם מערבי. אקסו המבודד שמקורו בטחול הציג את המורפולוגיה האופיינית של שלפוחיות דו-שכבתיות ליפידיות, עם גדלי חלקיקים הנעים בין 30 ננומטר ל-150 ננומטר. בנוסף, פרופיל הביטוי של סמנים אקסוזום אישר את נוכחותם וטוהרתם של אקסוזומים. יחד, ביססנו בהצלחה פרוטוקול מעשי לבידוד אקסו שמקורו בטחול בעכברים.

Introduction

אקסוזומים (Exo) הם תת-קבוצה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), שגודלן נע בין 30 ל-150 ננומטר, והיא מכילה מגוון רחב של ביומולקולות, כולל חלבונים, חומצות גרעין ושומנים¹. ביומולקולות אלה נגזרות מתאי ההורים ומשוחררות לחלל החוץ תאי. אקסו מאפשרת חילופי מידע ביומולקולריים בין תאים והמיקרו-סביבה הסובבת אותם, וממלאת תפקידים הן במערכות פרוקריוטיות והן במערכות אאוקריוטיות². המאפיינים של אקסוזומים, כגון תוכן, גודל, מרכיבי קרום ומקור תאי, משתנים מאוד ומושפעים מסוג התא המקורי, מצב התא ותנאי הסביבה.

אקסוזומים מסווגים בדרך כלל לשלוש קטגוריות בהתבסס על המקור שלהם: תרבית תאים, נוזל גוף, נגזר רקמה (Ti-Exo). בעוד אקסוזומים שמקורם בתרביות תאים נחקרו בהרחבה בשל נגישותם ותפוקתם העקבית, השימוש בהם מוגבל על ידי שינויים פוטנציאליים במאפייני התא לאחר תרבית ממושכת, אשר עשויים להציג באופן שגוי את תפקודיהם הביולוגיים ^3,4,5. יתר על כן, רוב תרביות התאים נשמרות בסביבות דו-ממדיות שאינן מחקות את האינטראקציות הבין-תאיות המורכבות in vivo, מה שעלול להשפיע על פירוש הנתונים⁶. לעומת זאת, אקסוזומים שבודדו מנוזלים ביולוגיים מציעים אפשרות זעיר פולשנית לעקוב אחר התקדמות המחלה בזמן אמת⁷. עם זאת, דגימות אלה מכילות לעתים קרובות תערובת של אקסוזומים ממקורות שונים, מה שמסבך את הזיהוי המדויק של המקור העיקרי שלהם⁸. בהתחשב באתגרים אלה, יש עניין גובר ב- Ti-Exo, השוכנים באינטרסטיציום החוץ תאי והם מתווכים מרכזיים של איתות בין-תאי.

הטחול ממלא תפקיד מכריע בתפקוד מערכת החיסון ובשמירה על הומאוסטזיס פנימי. למרות הפרוטוקולים הקיימים לבידוד Ti-Exo מאיברים כגון המוח, הכבד והגידולים, שיטות מעשיות לאקסוזומים שמקורם בטחול מדווחות באופן מוגבל ^9,10. מחקר זה נועד לבסס פרוטוקול מעשי לבידוד אקסוזומים מרקמת הטחול בעכברים שונה מדו"ח קודם¹¹. אנו מפרטים שיטה המערבת עיכול collagenase ואחריו אולטרה צנטריפוגה, אשר ממזער את ההפרעה של קרום התא ומבטיח טוהר גבוה ותשואה של Exo נגזר הטחול. המאפיינים של אקסו מבודד באמצעות פרוטוקול מבוסס זה אומתו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), ציטומטר זרימת ננו (Nano-FCM) וכתם מערבי, ואישרו את יעילות הפרוטוקול למחקר ניסיוני נוסף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הדגימות נלקחו מעכברים, עם אישור אתי שניתן על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית גואנגדונג. תיאורים מפורטים של חומרים, ציוד ותוכנות המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים. פרטי ההכנה לפני השאיבה מתוארים באיור 1, בעוד שתהליך המיצוי וההעשרה של הטחול-אקסו מתואר באיור 2.

1. הכנה

1. קירור מראש של צנטריפוגות במהירות גבוהה ובמהירות גבוהה במיוחד ל -4 ° C והגדר את הטמפרטורה של שייקר שולחני ל -37 ° C.
2. הכינו צלחות תרבית תאים (100 מ"מ), צינורות צנטריפוגות סטריליות בנפח 50 מ"ל, קרח ומסננת תאים סטרילית (70 מיקרומטר) כפי שמוצג באיור 1A, B.
3. יש לעקר מספריים ומלקחיים באמצעות תרסיס 75% אלכוהול, ולאחר מכן לבצע עיקור בטמפרטורה גבוהה. הכלים האלה מוצגים באיור 1C.
4. הניחו את רקמת הטחול בצלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ על קרח, ושטפו את הדם שעל פני השטח עם מי מלח סטריליים חוצצים פוספט (PBS). יבש את רקמות הטחול עם גזה סטרילית ולשקול אותם לאחר ייבוש.
   הערה: אם הרקמה קפואה, הפשירו אותה בצלחת במשך 15 דקות על קרח לפני שתמשיכו.
5. לחות מסננת התא (70 מיקרומטר) על ידי הטלת 1 מ"ל של PBS סטרילי לתוך המסננת באמצעות פיפט העברה סטרילי.
6. מכינים את מאגר העיכול (0.1% סוג I collagenase) באמצעות 1x PBS עם מערבל מערבולת.
   הערה: יש להשתמש ב-10 מ"ל של חיץ עיכול עבור כל 100 מ"ג של רקמת טחול. ריכוז הקולגנאז נבחר במחקר זה על סמך הוראות המוצר. עבור סוגי רקמות אחרים, ייתכן שהחוקרים יצטרכו להתאים פרמטרים אלה בהתבסס על צפיפות הרקמה והרכבה. ניסויים מקדימים עם ריכוזים משתנים וזמני עיכול מומלצים כדי לקבוע את התנאים האופטימליים עבור כל סוג רקמה.

2. עיכול רקמות

1. קוצצים את הרקמה לחתיכות קטנות ואחידות בעזרת מספריים בצלחת תרבית על קרח (איור 3A) ומעבירים לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל בעזרת צינור העברה סטרילי.
2. הוסיפו חיץ עיכול לצינור בהתאם למשקל רקמת הטחול כפי שצוין לעיל (איור 3B), ואז נערו את הצינור בזווית של 45° על שייקר אופקי ב-37°C. עקוב אחר התקדמות העיכול ועצור את העיכול כאשר גושי רקמות התפזרו, ורובם איבדו את צורתם. זמן העיכול צריך להשתנות בין רקמות. בתנאי הניסוי במחקר זה, זמן העיכול הוא כ -30 דקות.
3. העבירו את התערובת המעוכלת למסננת תאים (Ф70 מיקרומטר) בטמפרטורת החדר (RT) כדי להסיר פסולת רקמות סיבית וגדולה יותר.
   הערה: יש להשלים את הסינון מיד לאחר העיכול.
4. אספו את התסנין בצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל.

3. בידוד אקסוזום על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית

1. צנטריפוגה מסננת ב 500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. גלולה שמכילה תאים שיורית, פסולת תאים וגרעינים נראית אחרי צנטריפוגה, כפי שמוצג באיור 3C.
2. העבר את supernatant לצינור חדש צנטריפוגה ב 3000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. גלולה שמכילה גופים אפופטוטיים ומיקרוזומים נראית אחרי צנטריפוגה, כפי שמוצג באיור 3D.
3. העבר את הסופרנאטנט לצינור וצנטריפוגה חדשים ב 10,000 x גרם למשך 30 דקות ב 4 ° C. ניתן לראות גלולות המכילות מיקרו-שלפוחיות וקרום פלזמה לאחר צנטריפוגה, כפי שניתן לראות באיור 3E.
4. אולטרה-צנטריפוגה את הסופרנאטנט שנוצר ב 120,000 x גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C. ניתן לראות גלולה בתחתית הצינור לאחר צנטריפוגה, כפי שניתן לראות באיור 3F.
5. השליכו את הסופרנטנט, שטפו את הגלולה עם PBS, ואולטרה-צנטריפוגה שוב ב-120,000 x גרם במשך שעתיים ב-4°C כדי לקבל אקסוזומים. ניתן לראות גלולה בתחתית הצינור לאחר צנטריפוגה, כפי שניתן לראות באיור 3G.
6. ממיסים את האקסוזומים המבודדים עם PBS סטרילי (200 מיקרוליטר לטחול) ומאחסנים את האקסוזומים המבודדים בצינור צנטריפוגה חדש של 2 מ"ל בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

4. אפיון אקסוזום במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)

הערה: TEM שימש כדי לקבוע אם Exo שחולץ הציג מאפייני שלפוחית. דגימות אקסו המזוהות במיקרוסקופ אלקטרונים חייבות להיות דגימות טריות או מאוחסנות לזמן קצר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לזמן קצר.

1. תקן אקסוזומים (2-6 מיקרוגרם/μL) עם פרפורמלדהיד ברמת מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) של 2% ב-RT למשך שעתיים.
2. מניחים 10 מיקרוליטר של תמיסה אקסוזום על רשת נחושת, דוגרים ב-RT למשך 10 דקות, שוטפים במים מזוקקים סטריליים ומכסים את עודפי הנוזל בנייר סופג.
3. מכתימים את רשת הנחושת עם 2% אורניל אצטט למשך דקה אחת, מכסים את עודפי הנוזל בנייר פילטר ומייבשים תחת מנורת ליבון למשך 2 דקות.
4. צפו בדגימה המוכנה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת ב 80 קילו וולט.

5. התפלגות גודל ומדידת ריכוז חלקיקים של אקסוזומים

1. טען את חלקיקי הפוליסטירן הסטנדרטיים (250 ננומטר) לציטומטר זרימת ננו.
2. מדוד את ריכוז החלבון של דגימות Exo באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA. יש לדלל את דגימת Exo עם PBS בהתאם לתוצאות בדיקת חלבון BCA (לדלל את האקסוזומים ל-1-10 ננוגרם/μL), ולאחר מכן לטעון את דגימות Exo לננו-זרימה כדי למדוד את עוצמת פיזור הצד (SSI).
3. חישוב ריכוז Exo לפי היחס בין SSI לריכוז החלקיקים בננו-חלקיקי פוליסטירן סטנדרטיים.
   הערה: עבור מדידת גודל, עקומה סטנדרטית נוצרת על ידי טעינת ננו-חלקיקי סיליקה סטנדרטיים עם גדלי שיפוע (68 ננומטר, 91 ננומטר, 113 ננומטר, 155 ננומטר) לציטומטר זרימת ננו. הטעינה של מדגם Exo עוקבת אחר כך. התפלגות הגודל של אקסו חושבה על פי התרופה הסטנדרטית.

6. ליזה ואישור אימונובלוט של חלבונים אקסוזום

1. הוסף 100 μL של חיץ ליזה של בדיקת משקעים חיסוניים ברדיו (RIPA) לכדורית האקזוזום לצורך ניתוח חלבונים.
2. מערבולת במרץ, מכסה עם פאראפילם, רוק במשך 20 דקות ב- RT, ואז מערבולת שוב.
3. צנטריפוגה קצרה ב 1000 x גרם עבור 30-60 שניות לאסוף את הדגימה, להעביר צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל, ולאחסן ב -20 ° C עד -80 ° C עד הניתוח.
4. עבור אימונובלוט, יש לערבב דגימות עם מאגר העמסה 5x כדי להשיג ריכוז של 1x ולהתכונן לאלקטרופורזה בג'ל.
5. אם רוצים בקרות הומוגניות של כל הרקמה, השתמשו בחיץ ליזה חזק עם מעכב פרוטאז כדי ליזה את הרקמה, כמפורט לעיל. לאחר מכן, צנטריפוגו את הדגימות במהירות של 10,000 x גרם למשך 10 דקות והשליכו את המטריצה החוץ-תאית הנותרת, תאים שלמים או פסולת תאית שלמה.
6. מרתיחים את מאגר הדגימה המכיל אקסוזומים או הומוגנט רקמות ב 95 ° C למשך 5-10 דקות. טען חלבון שווה לכל נתיב לתוך ג'ל SDS-PAGE 10%. עומס חלבון שווה של הומוגנט רקמה כבקרה.
7. המשך עם אלקטרופורזה ג'ל תחת מתח של 80 V במשך כשעתיים באמצעות מאגר אלקטרופורזה קונבנציונאלי. בצע ניתוח כתמים מערביים כדי לאשר ביטוי חלבון אקסו בליזטים המטוהרים ולהשוות שפע אקסו יחסי בשברים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בידוד וטיהור של אקסוזומים שמקורם בטחול
כדי לבודד אקסוזומים מרקמת הטחול של עכבר השתמשנו בשילוב של עיכול קולגן ואולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית (איור 2). השלבים הראשונים כללו טיפול מקדים ברקמת הטחול כדי להסיר דם פני השטח, ולאחר מכן עיכול עם collagenase מ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מחקרים אחרונים דיווחו כי אקסוזומים שמקורם בטחול (Spleen-Exo) ממלאים תפקיד קריטי בטיפול בסרטן קיבה¹². כדי להבהיר עוד יותר את הפונקציות של טחול-Exo, יש צורך להקים שיטה לשחזור אופטימלי עבור מיצוי שלהם מרקמת הטחול. בעוד שקיימים פרוטוקולים לבידוד אקסוזומים מסרטן המוח ו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 µm Cell Strainer	Biologix Group Co., Ltd.USA	15-1070
Anti CD9 antibody	Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA	983275
Anti GM130 antibody	Proteintech Group, Inc.China	66662-1-lg
Anti TSG101 antibody	Abcam Plc, UK	125011
Cell Culture Dish	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	704001
Centrifuge tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	788211
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich Corp., USA	C2674
Desktop Thermostatic Shaker	Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., China	THZ-100
Electrophoresis buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2081-1L
Enhanced BCA Protein Assay Kit	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0010S
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc., China	N30E
Fluorescence/Chemiluminescence imaging system	Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China	GelView 6000Plus
HRP Goat anti-Mouse IgG	Proteintech Group, Inc.China	15014
HRP Goat anti-Rabbit IgG	Proteintech Group, Inc.China	15015
microplate reader	Molecular Devices, USA	CMax Plus
Microscissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA1010
Microscopic tweezers	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA3010
Multifuge X1R Pro centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	75009750
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	Y00030
Ophthalmic tweezers	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd., China	JD1060
Optima XPN-100 Ultrafiltration centrifuge	Beckman Coulter, USA	A94469
phosphate buffered saline (PBS)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., China	P1003
RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors)	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0013K
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0015
Transfer Pipet	Biologix Group Co., Ltd.USA	30-0238A1
Transmission Electron Microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Ultracentrifugation tube	Beckman Coulter, USA	355618
Western Transfer Buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2028-1L