Aislamiento y caracterización de exosomas derivados de tejidos de bazo de ratón

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para aislar exosomas derivados del bazo de ratón utilizando una combinación de digestión con colagenasa tipo I y ultracentrifugación.

Resumen

Los exosomas (Exo) son estructuras bicapa lipídica secretadas por varias células, incluidas las de animales, plantas y procariotas. Estudios previos han revelado que los Exo derivados del sobrenadante humoral o celular son objetivos prometedores para nuevos biomarcadores de diagnóstico o pronóstico, lo que subraya su importante papel en la patogénesis de la enfermedad. Los Exo derivados del tejido (Ti-Exo) han atraído cada vez más la atención debido a su capacidad para reflejar con precisión la especificidad del tejido y el microambiente. Los Ti-Exo, presentes en el espacio intersticial, desempeñan un papel crucial en la comunicación intercelular y la señalización entre órganos. A pesar de su reconocido valor para dilucidar los mecanismos de la enfermedad, el aislamiento de Ti-Exo sigue siendo un desafío debido a la complejidad de las matrices de tejidos y la variabilidad en los métodos de extracción. En este estudio, desarrollamos un protocolo práctico para aislar exosomas del tejido del bazo de ratones, proporcionando una técnica reproducible para el análisis de identificación posterior y estudios funcionales. Utilizamos la digestión de colagenasa tipo I combinada con ultracentrifugación diferencial para aislar Exo derivado del bazo. Las características de Exo aislado se determinaron mediante microscopía electrónica, el citómetro de nanoflujo y el western blot. El Exo aislado derivado del bazo mostró la morfología típica de las vesículas bicapa lipídica, con tamaños de partícula que oscilaron entre 30 nm y 150 nm. Además, el perfil de expresión de los marcadores de exosomas confirmó la presencia y pureza de los exosomas. En conjunto, establecimos con éxito un protocolo práctico para aislar Exo derivado del bazo en ratones.

Introducción

Los exosomas (Exo) son un subgrupo de vesículas extracelulares (VE), de 30 a 150 nm de tamaño, que encapsulan una amplia gama de biomoléculas, incluidas proteínas, ácidos nucleicos y lípidos¹. Estas biomoléculas se derivan de las células parentales y se liberan en el espacio extracelular. Exo facilita el intercambio de información biomolecular entre las células y su microambiente circundante, desempeñando funciones tanto en el sistema procariota como en el eucariota². Las características de los exosomas, como el contenido, el tamaño, los componentes de la membrana y el origen celular, son muy variables y están influenciadas por el tipo de célula de origen, el estado celular y las condiciones ambientales.

Los exosomas se clasifican comúnmente en tres categorías según su fuente: derivados de cultivos celulares, derivados de fluidos corporales y derivados de tejidos (Ti-Exo). Si bien los exosomas derivados de cultivos celulares han sido ampliamente estudiados debido a su accesibilidad y rendimiento constante, su uso está limitado por posibles alteraciones en las características celulares después de un cultivo prolongado, lo que puede tergiversar sus funciones biológicas ^3,4,5. Además, la mayoría de los cultivos celulares se mantienen en entornos bidimensionales que no imitan las complejas interacciones intercelulares in vivo, lo que puede afectar a la interpretación de los datos⁶. Por el contrario, los exosomas aislados de fluidos biológicos ofrecen una opción mínimamente invasiva para monitorizar la progresión de la enfermedad en tiempo real⁷. Sin embargo, estas muestras a menudo contienen una mezcla de exosomas de varios orígenes, lo que complica la identificación precisa de su fuente primaria⁸. Dados estos desafíos, existe un creciente interés en los Ti-Exo, que residen en el intersticio extracelular y son mediadores clave de la señalización intercelular.

El bazo desempeña un papel crucial en la función inmunitaria y en el mantenimiento de la homeostasis interna. A pesar de los protocolos existentes para aislar el Ti-Exo de órganos como el cerebro, el hígado y los tumores, los métodos prácticos para los exosomas derivados del bazo se han reportado de manera limitada ^9,10. Este estudio tuvo como objetivo establecer un protocolo práctico para el aislamiento de exosomas del tejido del bazo en ratones modificados a partir de un informe previo¹¹. Detallamos un método que implica la digestión de la colagenasa seguida de ultracentrifugación, que minimiza la disrupción de la membrana celular y garantiza una alta pureza y rendimiento de Exo derivado del bazo. Las características de Exo aislado utilizando este protocolo establecido se validaron a través de microscopía electrónica (TEM), el citómetro de nanoflujo (Nano-FCM) y Western blot, lo que confirma la eficacia del protocolo para futuras investigaciones experimentales.

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Protocolo

Las muestras se obtuvieron de ratones, con la aprobación ética otorgada por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Guangdong. Las descripciones detalladas de los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo se proporcionan en la Tabla de Materiales. Los detalles de la preparación previa a la extracción se ilustran en la Figura 1, mientras que el proceso de extracción y enriquecimiento de Spleen-Exo se describe en la Figura 2.

1. Preparación

1. Enfríe previamente las centrífugas de alta velocidad y ultra alta velocidad a 4 °C y ajuste la temperatura de un agitador de escritorio a 37 °C.
2. Prepare placas de cultivo celular (100 mm), tubos de centrífuga estériles de 50 mL, hielo y colador de células estériles (70 μm) como se muestra en la Figura 1A, B.
3. Esterilice las tijeras y las pinzas con alcohol en aerosol al 75 %, seguido de una esterilización a alta temperatura. Estas herramientas se muestran en la Figura 1C.
4. Coloque el tejido del bazo en una placa de Petri estéril de 100 mm sobre hielo y lave la sangre de la superficie con 1 solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) helada. Seque los tejidos del bazo con una gasa estéril y péselos después del secado.
   NOTA: Si el pañuelo está congelado, descongélelo en un plato durante 15 minutos sobre hielo antes de continuar.
5. Hidrate el filtro de células (70 μm) dejando caer 1 mL de PBS estéril en el filtro con una pipeta de transferencia estéril.
6. Prepare el tampón digestivo (0,1% de colagenasa tipo I) utilizando 1x PBS con un mezclador de vórtice.
   NOTA: Use 10 mL de tampón digestivo por cada 100 mg de tejido del bazo. La concentración de colagenasa se eligió en este estudio con base en las instrucciones del producto. Para otros tipos de tejido, es posible que los investigadores deban ajustar estos parámetros en función de la densidad y la composición del tejido. Se recomiendan experimentos preliminares con diferentes concentraciones y tiempos de digestión para determinar las condiciones óptimas para cada tipo de tejido.

2. Digestión de tejidos

1. Picar el tejido en trozos pequeños uniformes con unas tijeras en una placa de cultivo con hielo (Figura 3A) y transferirlo a un tubo de centrífuga de 50 ml con una pipeta de transferencia estéril.
2. Agregue tampón de digestión al tubo de acuerdo con el peso del tejido del bazo como se indicó anteriormente (Figura 3B), luego agite el tubo con un ángulo de 45° en un agitador horizontal a 37 °C. Controle el progreso de la digestión y detenga la digestión cuando los trozos de tejido se hayan dispersado y la mayoría hayan perdido su forma. El tiempo de digestión debe variar entre tejidos. En las condiciones experimentales de este estudio, el tiempo de digestión es de aproximadamente 30 min.
3. Transfiera la mezcla digerida a un colador de células (Ф70 μm) a temperatura ambiente (RT) para eliminar los restos de tejido fibroso y más grandes.
   NOTA: Filtración completa inmediatamente después de la digestión.
4. Recoja el filtrado en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL.

3. Aislamiento de exosomas por centrifugación diferencial

1. La centrífuga filtra a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Se puede ver un pellet que contiene células residuales, restos celulares y núcleos después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3C.
2. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifugue a 3000 x g durante 20 min a 4 °C. Se puede ver un pellet que contiene cuerpos apoptóticos y microsomas después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3D.
3. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifuga a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C. Los gránulos que contienen microvesículas y membrana plasmática se pueden ver después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3E.
4. Ultracentrífuga el sobrenadante resultante a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C. Se puede ver un pellet en la parte inferior del tubo después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3F.
5. Deseche el sobrenadante, lave el pellet con PBS y vuelva a ultracentrífugar a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C para obtener exosomas. Se puede ver un pellet en el fondo del tubo después de la centrifugación, como se muestra en la Figura 3G.
6. Disuelva los exosomas aislados con PBS estéril (200 μL por bazo) y almacene los exosomas aislados en un nuevo tubo de centrífuga de 2 mL a -80 °C.

4. Caracterización de exosomas por microscopía electrónica de transmisión (TEM)

NOTA: Se utilizó TEM para determinar si el Exo extraído mostraba características vesículas. Las muestras Exo identificadas por microscopía electrónica deben ser muestras frescas o almacenadas brevemente a 4 °C durante un breve período de tiempo.

1. Fije los exosomas (2-6 μg/μL) con paraformaldehído de grado de microscopía electrónica (EM) al 2% en RT durante 2 h.
2. Coloque 10 μL de solución de exosomas en una malla de cobre, incube a RT durante 10 minutos, enjuague con agua destilada estéril y seque el exceso de líquido con papel absorbente.
3. Tiñe la malla de cobre con acetato de uranilo al 2% durante 1 min, seca el exceso de líquido con papel de filtro y seca bajo una lámpara incandescente durante 2 min.
4. Observar la muestra preparada bajo un microscopio electrónico de transmisión a 80 kV.

5. Distribución de tamaño y medición de la concentración de partículas de exosomas

1. Cargue las nanopartículas de poliestireno estándar (250 nm) en el citómetro de nanoflujo.
2. Mida la concentración de proteínas de las muestras Exo utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA. Diluya la muestra Exo con PBS de acuerdo con los resultados del ensayo de proteínas BCA (diluya los exosomas a 1-10 ng/μL), luego cargue las muestras Exo en el nanoflujo para medir la intensidad de dispersión lateral (SSI).
3. Calcule la concentración de Exo de acuerdo con la relación entre SSI y concentración de partículas en las nanopartículas de poliestireno estándar.
   NOTA: Para la medición del tamaño, se genera una curva estándar cargando nanopartículas de sílice estándar con tamaños de gradiente (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) en el citómetro de nanoflujo. La carga de la muestra Exo sigue a esto. La distribución de tamaños de Exo se calculó de acuerdo con la cura estándar.

6. Confirmación de lisis e inmunotransferencia de proteínas exosomas

1. Añada 100 μL de tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) al gránulo de exosomas para el análisis de proteínas.
2. Vórtice vigorosamente, cúbralo con parafilm, muévase durante 20 minutos en RT, luego vuelva a vórtice.
3. Centrifugar brevemente a 1000 x g durante 30-60 s para recoger la muestra, transferir a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a -20 °C a -80 °C hasta el análisis.
4. Para el inmunoblot, mezcle las muestras con un tampón de carga 5x para lograr una concentración 1x y prepárese para la electroforesis en gel.
5. Si se desean controles de homogeneización de tejido completo, utilice un tampón de lisis fuerte con un inhibidor de la proteasa para lisar el tejido, como se detalló anteriormente. A continuación, centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 10 minutos y desechar el resto de la matriz extracelular, las células enteras o los restos celulares intactos.
6. Hervir el tampón de muestra que contiene exosomas u homogeneizado de tejidos a 95 °C durante 5-10 min. Cargue la misma proteína por carril en un gel SDS-PAGE al 10%. La carga es igual a la proteína del homogeneizado del tejido como control.
7. Proceda con la electroforesis en gel a una tensión de 80 V durante aproximadamente 2 h utilizando el tampón de electroforesis convencional. Realice el análisis de Western blot para confirmar la expresión de la proteína Exo en los lisados purificados y comparar la abundancia relativa de Exo en fracciones.

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Resultados

Aislamiento y purificación de exosomas derivados del bazo
Para aislar los exosomas del tejido del bazo de ratón, empleamos una combinación de digestión de colagenasa y ultracentrifugación diferencial (Figura 2). Los pasos iniciales consistieron en el tratamiento previo del tejido del bazo para eliminar la sangre de la superficie, seguido de la digestión con colagenasa tipo I. Este tratamiento enzimático facilitó la descomposición...

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Discusión

Investigaciones recientes han reportado que los exosomas derivados del bazo (Spleen-Exo) juegan un papel crítico en el tratamiento del cáncer gástrico¹². Para dilucidar aún más las funciones de Spleen-Exo, es necesario establecer un método reproducible y óptimo para su extracción del tejido del bazo. Si bien existen protocolos para aislar exosomas del cáncer de cerebro e hígado ^13,14, los método...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 µm Cell Strainer	Biologix Group Co., Ltd.USA	15-1070
Anti CD9 antibody	Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA	983275
Anti GM130 antibody	Proteintech Group, Inc.China	66662-1-lg
Anti TSG101 antibody	Abcam Plc, UK	125011
Cell Culture Dish	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	704001
Centrifuge tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	788211
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich Corp., USA	C2674
Desktop Thermostatic Shaker	Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., China	THZ-100
Electrophoresis buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2081-1L
Enhanced BCA Protein Assay Kit	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0010S
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc., China	N30E
Fluorescence/Chemiluminescence imaging system	Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China	GelView 6000Plus
HRP Goat anti-Mouse IgG	Proteintech Group, Inc.China	15014
HRP Goat anti-Rabbit IgG	Proteintech Group, Inc.China	15015
microplate reader	Molecular Devices, USA	CMax Plus
Microscissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA1010
Microscopic tweezers	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA3010
Multifuge X1R Pro centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	75009750
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	Y00030
Ophthalmic tweezers	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd., China	JD1060
Optima XPN-100 Ultrafiltration centrifuge	Beckman Coulter, USA	A94469
phosphate buffered saline (PBS)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., China	P1003
RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors)	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0013K
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0015
Transfer Pipet	Biologix Group Co., Ltd.USA	30-0238A1
Transmission Electron Microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Ultracentrifugation tube	Beckman Coulter, USA	355618
Western Transfer Buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2028-1L