小鼠脾脏组织来源的外泌体的分离和表征

摘要

在这里，我们提出了一种使用消化与 I 型胶原酶和超速离心相结合来分离小鼠脾脏衍生的外泌体的方案。

摘要

外泌体 （Exo） 是由各种细胞（包括动物、植物和原核生物的细胞）分泌的脂质双层结构。先前的研究表明，来自体液或细胞上清液的 Exo 是新型诊断或预后生物标志物的有希望的靶标，强调了它们在疾病发病机制中的重要作用。组织来源的 Exo （Ti-Exo） 因其能够准确反映组织特异性和微环境而受到越来越多的关注。Ti-Exo 存在于间质间隙中，在细胞间通讯和跨器官信号传导中起着至关重要的作用。尽管它们在阐明疾病机制方面具有公认的价值，但由于组织基质的复杂性和提取方法的可变性，分离 Ti-Exo 仍然具有挑战性。在这项研究中，我们开发了一种从小鼠脾组织中分离外泌体的实用方案，为随后的鉴定分析和功能研究提供了一种可重复的技术。我们使用 I 型胶原酶消化结合差异超速离心分离脾源性 Exo。通过电子显微镜、纳流式细胞仪和 western blot 确定分离的 Exo 特性。分离的脾源性 Exo 显示出脂质双层囊泡的典型形态，粒径范围为 30 nm 至 150 nm。此外，外泌体标志物的表达谱证实了外泌体的存在和纯度。综上所述，我们成功地建立了一种在小鼠中分离脾脏衍生的 Exo 的实用方案。

引言

外泌体 （Exo） 是细胞外囊泡 （EV） 的一个亚组，大小范围为 30 至 150 nm，封装了多种生物分子，包括蛋白质、核酸和脂质¹。这些生物分子来源于亲本细胞并释放到细胞外空间。外显生物促进细胞与其周围微环境之间的生物分子信息交换，在原核和真核系统中发挥作用²。外泌体的特性，如含量、大小、膜成分和细胞起源，是高度可变的，并受起始细胞类型、细胞状态和环境条件的影响。

外泌体通常根据其来源分为三类:细胞培养来源、体液来源和组织来源 （Ti-Exo）。虽然细胞培养衍生的外泌体因其可及性和一致的产量而被广泛研究，但它们的使用受到长时间培养后细胞特性潜在变化的限制，这可能会歪曲其生物学功能 ^3,4,5。此外，大多数细胞培养物维持在二维环境中，这些环境不模拟复杂的体内细胞间相互作用，这可能会影响数据解释⁶。相反，从生物体液中分离的外泌体提供了一种微创选择，可以实时监测疾病进展⁷。然而，这些样品通常包含来自不同来源的外泌体混合物，这使得准确鉴定其主要来源变得复杂⁸。鉴于这些挑战，人们对 Ti-Exo 越来越感兴趣，Ti-Exo 位于细胞外间质中，是细胞间信号传导的关键介质。

脾脏在免疫功能和维持内部稳态中起着至关重要的作用。尽管已有从脑、肝脏和肿瘤等器官中分离 Ti-Exo 的方案，但脾源性外泌体的实用方法报道有限 ^9,10。本研究旨在建立一种从小鼠脾组织中分离外泌体的实用方案，该方案根据先前的报告修改而来¹¹.我们详细介绍了一种涉及胶原酶消化后超速离心的方法，该方法最大限度地减少了细胞膜的破坏，并确保了脾源性 Exo 的高纯度和产量。使用这种既定方案的分离 Exo 的特性通过电子显微镜 （TEM）、纳流式细胞仪 （Nano-FCM） 和蛋白质印迹进行了验证，证实了该方案对进一步实验研究的有效性。

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研究方案

样本来自小鼠，并获得了广东医科大学伦理委员会的伦理批准。 材料表中提供了本协议中使用的材料、设备和软件的详细说明。提取前的制备细节如图 1 所示，而脾外显生提取和富集的过程如图 2 所示。

1. 准备工作

1. 将高速和超高速离心机预冷至 4 °C，并将台式摇床的温度设置为 37 °C。
2. 准备细胞培养皿 （100 mm）、50 mL 无菌离心管、冰和无菌细胞过滤器 （70 μm），如图 1A、B 所示。
3. 使用 75% 酒精喷雾对剪刀和镊子进行消毒，然后进行高温消毒。 这些工具如图 1C 所示。
4. 将脾组织置于冰上的无菌 100 mm 培养皿中，并用 1x 冰无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗去表面血液。用无菌纱布擦干脾组织，晾干后称重。
   注意:如果组织被冷冻，请在培养皿中冰解冻 15 分钟，然后再继续。
5. 使用无菌移液管将 1 mL 无菌 PBS 滴入过滤器 （70 μm） 中，以润湿细胞过滤器 （70 μm）。
6. 使用带有涡旋混合器的 1x PBS 制备消化缓冲液（0.1% I 型胶原酶）。
   注意:每 10 毫克脾组织使用 100 mL 消化缓冲液。本研究根据产品说明选择胶原酶浓度。对于其他组织类型，研究人员可能需要根据组织密度和成分调整这些参数。建议对不同浓度和消化时间进行初步实验，以确定每种组织类型的最佳条件。

2. 组织消化

1. 在冰上的培养皿中用剪刀将组织切成均匀的小块（图 3A），然后用无菌移液管转移到 50 mL 离心管中。
2. 如上所述，根据脾组织重量向试管中加入消化缓冲液（图 3B），然后在 37 °C 的水平振荡器上以 45° 的角度摇动试管。 监测消化进度，并在组织块分散且大多数组织块变形时停止消化。消化时间应因组织而异。在本研究的实验条件下，消化时间约为 30 分钟。
3. 在室温 （RT） 下将消化的混合物转移到细胞过滤器 （Ф70 μm） 中，以去除纤维状和较大的组织碎片。
   注:消解后立即完成过滤。
4. 将滤液收集在新的 50 mL 离心管中。

3. 通过差速离心分离外泌体

1. 将滤液在 4 °C 下以 500 x g 离心 10 分钟。 离心后可以看到含有残留细胞、细胞碎片和细胞核的沉淀，如图 3C 所示。
2. 将上清液转移到新管中，并在 4 °C 下以 3000 x g 离心 20 分钟。 离心后可以看到含有凋亡小体和微粒体的沉淀，如图 3D 所示。
3. 将上清液转移到新管中，并在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 30 分钟。 离心后可以看到含有微泡和质膜的沉淀，如图 3E 所示。
4. 在 4 °C 下以 120,000 x g 超速离心所得上清液 2 小时。 离心后，可以在管底部看到沉淀，如图 3F 所示。
5. 弃去上清液，用PBS洗涤沉淀，并在4°C下再次以120,000 x g 超速离心2小时以获得外泌体。离心后，可以在试管底部看到沉淀，如图 3G 所示。
6. 用无菌 PBS（每个脾脏 200 μL）溶解分离的外泌体，并将分离的外泌体储存在 -80 °C 的新 2 mL 离心管中。

4. 通过透射电子显微镜 （TEM） 进行外泌体表征

注:TEM 用于确定提取的 Exo 是否显示囊泡特性。通过电子显微镜鉴定的 Exo 样品必须是新鲜样品或在 4 °C 下短暂储存短时间。

1. 在 RT 下用 2% 电子显微镜 （EM） 级多聚甲醛固定外泌体 （2-6 μg/μL） 2 小时。
2. 将 10 μL 外泌体溶液放在铜网上，在 RT 下孵育 10 分钟，用无菌蒸馏水冲洗，并用吸水纸吸干多余的液体。
3. 用 2% 乙酸铀酰染色铜网 1 分钟，用滤纸吸干多余的液体，然后在白炽灯下干燥 2 分钟。
4. 在 80 kV 的透射电子显微镜下观察制备的样品。

5. 外泌体的粒度分布和颗粒浓度测量

1. 将标准聚苯乙烯纳米颗粒 （250 nm） 加载到纳米流式细胞仪中。
2. 使用 BCA 蛋白检测试剂盒测量 Exo 样品的蛋白浓度。根据 BCA 蛋白测定结果（将外泌体稀释至 1-10 ng/μL），用 PBS 稀释 Exo 样品，然后将 Exo 样品加载到纳流中以测量侧向散射强度 （SSI）。
3. 根据标准聚苯乙烯纳米颗粒中 SSI 与颗粒浓度的比率计算 Exo 浓度。
   注:对于尺寸测量，通过将具有梯度尺寸（68 nm、91 nm、113 nm、155 nm）的标准二氧化硅纳米颗粒加载到纳米流式细胞仪中来生成标准曲线。Exo 样品的加载遵循此步骤。根据标准固化计算 Exo 的大小分布。

6. 外泌体蛋白的裂解和免疫印迹确认

1. 向外泌体沉淀中加入 100 μL 放射免疫沉淀测定 （RIPA） 裂解缓冲液进行蛋白质分析。
2. 剧烈涡旋，用封口膜覆盖，在 RT 下摇动 20 分钟，然后再次涡旋。
3. 以 1000 x g 的离心力短暂离心 30-60 秒以收集样品，转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，并在 -20 °C 至 -80 °C 下储存直至分析。
4. 对于免疫印迹，将样品与 5x 上样缓冲液混合以达到 1x 浓度，并准备进行凝胶电泳。
5. 如果需要全组织匀浆对照，请使用含有蛋白酶抑制剂的强裂解缓冲液来裂解组织，如上所述。然后，将样品以 10,000 x g 离心 10 分钟，并丢弃剩余的细胞外基质、全细胞或完整的细胞碎片。
6. 将含有外泌体或组织匀浆的样品缓冲液在 95 °C 下煮沸 5-10 分钟。将每个泳道的相同蛋白质上样到 10% SDS-PAGE 凝胶中。加载相等的组织匀浆蛋白质作为对照。
7. 使用常规电泳缓冲液在 80 V 电压下进行凝胶电泳约 2 小时。进行蛋白质印迹分析以确认纯化裂解物中的 Exo 蛋白表达，并比较组分中的 Exo 相对丰度。

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结果

分离和纯化脾源性外泌体
为了从小鼠脾组织中分离外泌体，我们采用了胶原酶消化和差异超速离心的组合（图 2）。初始步骤包括预处理脾脏组织以去除表面血液，然后用 I 型胶原酶消化。这种酶处理促进了细胞外基质成分的分解，从而释放了外泌体，同时保持了它们的完整性。消化后，采用一系列离心步骤依次去除细胞碎片、凋亡?...

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讨论

最近的研究报告称，脾源性外泌体 （Spleen-Exo） 在胃癌的治疗中起着关键作用¹²。为了进一步阐明 Spleen-Exo 的功能，有必要建立一种可重复和最佳的方法来从脾组织中提取它们。虽然存在从脑癌和肝癌中分离外泌体的方案 ^13,14，^但其他组织的方法仍然不成熟，需要进一步验证。在这项研究中，我们概述了一种?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 µm Cell Strainer	Biologix Group Co., Ltd.USA	15-1070
Anti CD9 antibody	Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA	983275
Anti GM130 antibody	Proteintech Group, Inc.China	66662-1-lg
Anti TSG101 antibody	Abcam Plc, UK	125011
Cell Culture Dish	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	704001
Centrifuge tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	788211
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich Corp., USA	C2674
Desktop Thermostatic Shaker	Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., China	THZ-100
Electrophoresis buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2081-1L
Enhanced BCA Protein Assay Kit	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0010S
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc., China	N30E
Fluorescence/Chemiluminescence imaging system	Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China	GelView 6000Plus
HRP Goat anti-Mouse IgG	Proteintech Group, Inc.China	15014
HRP Goat anti-Rabbit IgG	Proteintech Group, Inc.China	15015
microplate reader	Molecular Devices, USA	CMax Plus
Microscissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA1010
Microscopic tweezers	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA3010
Multifuge X1R Pro centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	75009750
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	Y00030
Ophthalmic tweezers	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd., China	JD1060
Optima XPN-100 Ultrafiltration centrifuge	Beckman Coulter, USA	A94469
phosphate buffered saline (PBS)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., China	P1003
RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors)	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0013K
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0015
Transfer Pipet	Biologix Group Co., Ltd.USA	30-0238A1
Transmission Electron Microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Ultracentrifugation tube	Beckman Coulter, USA	355618
Western Transfer Buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2028-1L