Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues(생쥐 비장 조직에서 유래한 엑소좀의 분리 및 특성 분석)

요약

여기에서는 콜라겐분해효소 I형과 초원심분리를 통한 소화를 조합하여 생쥐 비장 유래 엑소좀을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

엑소좀(Exosome, Exo)은 동물, 식물, 원핵생물 등 다양한 세포에서 분비되는 지질이중층 구조입니다. 이전 연구에 따르면 체액성 또는 세포 상층액에서 유래한 Exo는 새로운 진단 또는 예후 바이오마커에 대한 유망한 표적이며 질병 발병기전에서 중요한 역할을 강조합니다. 조직 유래 Exo(Ti-Exo)는 조직 특이성과 미세환경을 정확하게 반영하는 능력으로 인해 점점 더 주목을 받고 있습니다. 틈새 공간에 존재하는 Ti-Exo는 세포 간 통신 및 장기 간 신호 전달에 중요한 역할을 합니다. 질병 기전을 규명하는 데 있어 인정받은 가치에도 불구하고 Ti-Exo를 분리하는 것은 조직 매트릭스의 복잡성과 추출 방법의 가변성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이 연구에서는 생쥐 비장 조직에서 엑소좀을 분리하기 위한 실용적인 프로토콜을 개발하여 후속 식별 분석 및 기능 연구를 위한 재현 가능한 기술을 제공했습니다. 우리는 비장 유래 Exo를 분리하기 위해 차등 초원심분리와 결합된 Type I 콜라겐분해효소 분해를 사용했습니다. 분리된 Exo의 특성은 전자 현미경, nano-flow cytometer, western blot을 통해 확인되었습니다. 분리된 비장 유래 Exo는 입자 크기가 30nm에서 150nm에 이르는 지질 이중층 소포의 전형적인 형태를 보여주었습니다. 또한, 엑소좀 마커의 발현 프로파일을 통해 엑소좀의 존재와 순도를 확인할 수 있었습니다. 종합하면, 우리는 생쥐에서 비장 유래 Exo를 분리하기 위한 실용적인 프로토콜을 성공적으로 확립했습니다.

서문

엑소좀(Exosome, Exo)은 크기가 30nm에서 150nm에 이르는 세포외 소포체(EV)의 하위 그룹으로, 단백질, 핵산 및 지질을 포함한 다양한 생체 분자 어레이를 캡슐화합니다¹. 이 생체 분자는 부모 세포에서 파생되어 세포 외 공간으로 방출됩니다. Exo는 세포와 주변 미세환경 간의 생체 분자 정보 교환을 촉진하여 원핵 및 진핵 시스템 모두에서 역할을 합니다². 내용물, 크기, 막 구성 요소, 세포 기원과 같은 엑소좀의 특성은 매우 다양하며 원래 세포 유형, 세포 상태 및 환경 조건의 영향을 받습니다.

엑소좀은 일반적으로 원료에 따라 세포 배양 유래, 체액 유래, 조직 유래(Ti-Exo)의 세 가지 범주로 분류됩니다. 세포 배양 유래 엑소좀은 접근성과 일관된 수율로 인해 광범위하게 연구되어 왔지만, 장기간 배양 후 세포 특성의 잠재적인 변화로 인해 생물학적 기능을 잘못 나타낼 수 있으므로 사용이 제한됩니다 ^3,4,5. 더욱이, 대부분의 세포 배양은 복잡한 in vivo 세포 간 상호 작용을 모방하지 않는 2차원 환경에서 유지되며, 이는 잠재적으로 데이터 해석에 영향을 미칠 수 있다⁶. 반대로, 생물학적 유체에서 분리한 엑소좀은 질병 진행을 실시간으로 모니터링할 수 있는 최소 침습 옵션을 제공합니다⁷. 그러나 이러한 샘플에는 다양한 기원의 엑소좀이 혼합되어 있는 경우가 많아 주요 출처인 엑소좀을 정확하게 식별하기가 복잡하다⁸. 이러한 문제를 감안할 때 세포외 간질에 상주하며 세포간 신호전달의 핵심 매개체인 Ti-Exo에 대한 관심이 높아지고 있습니다.

비장은 면역 기능과 내부 항상성 유지에 중요한 역할을 합니다. 뇌, 간, 종양과 같은 장기에서 Ti-Exo를 분리하기 위한 기존 프로토콜에도 불구하고 비장 유래 엑소좀에 대한 실용적인 방법은 제한적으로 보고되고 있습니다 ^9,10. 이 연구는 이전 보고서에서 수정된 마우스의 비장 조직에서 엑소좀을 분리하기 위한 실용적인 프로토콜을 확립하는 것을 목표로 했습니다¹¹. 콜라겐분해효소 분해 후 초원심분리를 수반하는 방법에 대해 자세히 설명하는데, 이는 세포막의 파괴를 최소화하고 비장 유래 Exo의 높은 순도와 수율을 보장합니다. 이 확립된 프로토콜을 사용하는 분리된 Exo의 특성은 전자 현미경(TEM), 나노 유세포 분석기(Nano-FCM) 및 웨스턴 블롯을 통해 검증되었으며, 이를 통해 추가 실험 연구를 위한 프로토콜의 효능을 확인했습니다.

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프로토콜

샘플은 광동 의과대학 윤리위원회(Ethics Committee of Guangdong Medical University)의 윤리적 승인을 받은 쥐에서 채취한 것입니다. 이 프로토콜에 사용된 재료, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 설명은 재료 표에 나와 있습니다. 추출 전 준비의 세부 사항은 그림 1에 나와 있으며, Spleen-Exo 추출 및 농축 과정은 그림 2에 설명되어 있습니다.

1. 준비

1. 고속 및 초고속 원심분리기를 4°C로 사전 냉각하고 데스크탑 쉐이커의 온도를 37°C로 설정합니다.
2. 그림 1A, B와 같이 세포 배양 접시(100mm), 50mL 멸균 원심분리 튜브, 얼음 및 멸균 세포 여과기(70μm)를 준비합니다.
3. 75% 알코올 스프레이를 사용하여 가위와 집게를 살균한 후 고온 살균합니다. 이러한 도구는 그림 1C에 나와 있습니다.
4. 얼음 위의 멸균 된 100mm 페트리 접시에 비장 조직을 놓고 1x 얼음 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 표면 혈액을 씻어냅니다. 멸균 거즈로 비장 조직을 건조시키고 건조 후 무게를 잰다.
   알림: 티슈가 얼린 경우 계속하기 전에 얼음에 15분 동안 접시에 담아 해동하십시오.
5. 멸균 이송 피펫을 사용하여 70mL의 멸균 PBS를 스트레이너에 떨어뜨려 세포 여과기(70μm)에 수분을 공급합니다.
6. 와류 믹서와 함께 0.1x PBS를 사용하여 소화 완충액(0.1% I형 콜라겐분해효소)을 준비합니다.
   참고: 비장 조직 100mg당 10mL의 소화 완충액을 사용하십시오. 콜라겐분해효소 농도는 제품 지침에 따라 이 연구에서 선택되었습니다. 다른 조직 유형의 경우 연구자는 조직 밀도 및 구성에 따라 이러한 매개변수를 조정해야 할 수 있습니다. 각 조직 유형에 대한 최적의 조건을 결정하기 위해 다양한 농도와 소화 시간을 가진 예비 실험이 권장됩니다.

2. 조직 소화

1. 얼음 위에 담긴 배양 접시에 가위를 사용하여 조직을 균일한 작은 조각으로 자르고(그림 3A) 멸균 전사 피펫이 있는 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
2. 위와 같이 비장 조직 무게에 따라 튜브에 분해 완충액을 추가한 다음(그림 3B) 37°C의 수평 셰이커에서 45° 각도로 튜브를 흔듭니다. 소화 진행 상황을 모니터링하고 조직 덩어리가 분산되어 대부분이 모양을 잃었을 때 소화를 중지합니다. 소화 시간은 조직마다 달라야 합니다. 본 연구의 실험 조건에서 소화 시간은 약 30분입니다.
3. 분해된 혼합물을 실온(RT)에서 세포 여과기(Ф70μm)로 옮겨 섬유질 및 더 큰 조직 파편을 제거합니다.
   알림: 분해 직후 여과를 완료하십시오.
4. 새로운 50mL 원심분리기 튜브에 여과액을 수집합니다.

3. 차등 원심분리에 의한 엑소좀 분리

1. 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 500 x g 으로 여과합니다. 잔류 세포, 세포 파편 및 핵을 포함하는 펠릿은 그림 3C와 같이 원심분리 후에 볼 수 있습니다.
2. 상층액을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 20분 동안 3000 x g 으로 원심분리합니다. apoptotic body와 microsomes를 포함하는 펠릿은 그림 3D와 같이 원심분리 후에 볼 수 있습니다.
3. 상층액을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 30분 동안 10,000 x g 으로 원심분리합니다. 미세소포와 원형질막을 포함하는 펠릿은 그림 3E와 같이 원심분리 후에 볼 수 있습니다.
4. 생성된 상층액을 120,000 x g 에서 4°C에서 2시간 동안 초원심분리합니다. 펠릿은 그림 3F와 같이 원심분리 후 튜브 바닥에서 볼 수 있습니다.
5. 상층액을 버리고 펠릿을 PBS로 세척한 후 다시 120,000 x g 에서 4°C에서 2시간 동안 초원심분리하여 엑소좀을 얻습니다. 펠릿은 그림 3G와 같이 원심분리 후 튜브 바닥에서 볼 수 있습니다.
6. 분리된 엑소좀을 멸균 PBS(비장당 200μL)로 용해시키고 분리된 엑소좀을 -80°C의 새로운 2mL 원심분리 튜브에 보관합니다.

4. 투과전자현미경(TEM)에 의한 엑소좀 특성 분석

참고: TEM은 추출된 Exo가 소포 특성을 나타내는지 여부를 확인하는 데 사용되었습니다. 전자 현미경으로 식별된 Exo 샘플은 신선한 샘플이거나 4°C에서 짧은 시간 동안 잠시 보관해야 합니다.

1. 엑소좀(2-6 μg/μL)을 2% 전자 현미경(EM) 등급 파라포름알데히드로 RT에서 2시간 동안 고정합니다.
2. 엑소좀 용액 10μL를 구리 메쉬에 놓고 실온에서 10분 동안 배양한 후 멸균 증류수로 헹구고 여분의 액체를 흡수지로 닦아냅니다.
3. 구리 메쉬를 2% 우라닐 아세테이트로 1분 동안 염색하고 여과지로 과도한 액체를 닦아내고 백열등 아래에서 2분 동안 건조시킵니다.
4. 80kV에서 투과 전자 현미경으로 준비된 샘플을 관찰합니다.

5. 엑소좀의 크기 분포 및 입자 농도 측정

1. 표준 폴리스티렌 나노입자(250nm)를 나노 유세포분석기에 로드합니다.
2. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 Exo 샘플의 단백질 농도를 측정합니다. BCA 단백질 분석 결과에 따라 엑소 샘플을 PBS로 희석(엑소좀을 1-10 ng/μL로 희석)한 다음 엑소 샘플을 나노 플로우에 로드하여 측면 산란 강도(SSI)를 측정합니다.
3. 표준 폴리스티렌 나노입자의 입자 농도에 대한 SSI의 비율에 따라 엑소 농도를 계산합니다.
   참고: 크기 측정을 위해 그래디언트 크기(68nm, 91nm, 113nm, 155nm)를 가진 표준 실리카 나노입자를 나노 유세포계에 로드하여 표준 곡선을 생성합니다. Exo 샘플의 로드는 다음과 같습니다. Exo의 크기 분포는 표준 치료법에 따라 계산되었습니다.

6. 엑소좀 단백질의 용해 및 면역블롯 확인

1. 단백질 분석을 위해 엑소좀 펠릿에 100μL의 RIPA(radio immunoprecipitation assay) 용해 완충액을 추가합니다.
2. 소용돌이를 세게 하고, 파라필름으로 덮고, RT에서 20분 동안 흔들고, 그런 다음 다시 소용돌이칩니다.
3. 1000 x g 에서 30-60초 동안 잠시 원심분리하여 샘플을 수집하고, 새로운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고, 분석할 때까지 -20°C에서 -80°C에 보관합니다.
4. 면역블롯의 경우 샘플을 5x 로딩 버퍼와 혼합하여 1x 농도를 달성하고 겔 전기영동을 준비합니다.
5. 전체 조직 균질화 제어가 필요한 경우, 위에서 설명한 대로 단백질 분해 효소 억제제와 함께 강력한 용해 완충액을 사용하여 조직을 용해합니다. 그런 다음 샘플을 10,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 나머지 세포외 기질, 전체 세포 또는 온전한 세포 파편을 버립니다.
6. 엑소좀 또는 조직 균질액이 포함된 시료 완충액을 95°C에서 5-10분 동안 끓입니다. 레인당 동일한 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에 로드합니다. 조직 균질화의 동등한 단백질을 통제로 적재하십시오.
7. 기존의 전기영동 버퍼를 사용하여 약 2시간 동안 80V의 전압에서 겔 전기영동을 진행합니다. 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 정제된 용해물에서 Exo 단백질 발현을 확인하고 분획에서의 상대적 Exo 함량을 비교합니다.

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결과

비장 유래 엑소좀(spleen-derived exosome)의 분리 및 정제
쥐의 비장 조직에서 엑소좀을 분리하기 위해 콜라겐분해효소 분해효소 분해와 차등 초원심분리를 조합했습니다(그림 2). 초기 단계에는 비장 조직을 전처리하여 표면 혈액을 제거한 다음 I형 콜라겐분해효소로 소화하는 것이 포함되었습니다. 이 효소 처리는 세포외 기질 구성 요소?...

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토론

최근 연구에 따르면 비장 유래 엑소좀(Spleen-Exosome, Spleen-Exo)은 위암 치료에 중요한 역할을 합니다¹². Spleen-Exo의 기능을 더욱 명확하게 규명하기 위해서는 비장 조직에서 이를 추출하기 위한 재현 가능하고 최적의 방법을 확립해야 합니다. 뇌암과 간암에서 엑소좀을 분리하기 위한 프로토콜이 존재하지만^{, 13,14} 다른 조직에 대한 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 µm Cell Strainer	Biologix Group Co., Ltd.USA	15-1070
Anti CD9 antibody	Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA	983275
Anti GM130 antibody	Proteintech Group, Inc.China	66662-1-lg
Anti TSG101 antibody	Abcam Plc, UK	125011
Cell Culture Dish	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	704001
Centrifuge tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	788211
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich Corp., USA	C2674
Desktop Thermostatic Shaker	Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., China	THZ-100
Electrophoresis buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2081-1L
Enhanced BCA Protein Assay Kit	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0010S
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc., China	N30E
Fluorescence/Chemiluminescence imaging system	Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China	GelView 6000Plus
HRP Goat anti-Mouse IgG	Proteintech Group, Inc.China	15014
HRP Goat anti-Rabbit IgG	Proteintech Group, Inc.China	15015
microplate reader	Molecular Devices, USA	CMax Plus
Microscissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA1010
Microscopic tweezers	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA3010
Multifuge X1R Pro centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	75009750
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	Y00030
Ophthalmic tweezers	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd., China	JD1060
Optima XPN-100 Ultrafiltration centrifuge	Beckman Coulter, USA	A94469
phosphate buffered saline (PBS)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., China	P1003
RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors)	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0013K
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0015
Transfer Pipet	Biologix Group Co., Ltd.USA	30-0238A1
Transmission Electron Microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Ultracentrifugation tube	Beckman Coulter, USA	355618
Western Transfer Buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2028-1L