Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Özet

Burada, kollajenaz tip I ile sindirim ve ultrasantrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullanarak fare dalağından türetilmiş eksozomları izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Eksozomlar (Exo), hayvanlar, bitkiler ve prokaryotlar da dahil olmak üzere çeşitli hücreler tarafından salgılanan lipid-çift katmanlı yapılardır. Önceki çalışmalar, humoral veya hücre süpernatanından türetilen Exo'nun yeni tanısal veya prognostik biyobelirteçler için umut verici hedefler olduğunu ve hastalık patogenezindeki önemli rollerinin altını çizdiğini ortaya koymuştur. Doku kaynaklı Exo (Ti-Exo), doku özgüllüğünü ve mikro çevreyi doğru bir şekilde yansıtma yeteneği nedeniyle artan ilgi görmüştür. İnterstisyel uzayda bulunan Ti-Exo, hücreler arası iletişimde ve organlar arası sinyalleşmede çok önemli roller oynar. Hastalık mekanizmalarının aydınlatılmasında bilinen değerlerine rağmen, doku matrislerinin karmaşıklığı ve ekstraksiyon yöntemlerindeki değişkenlik nedeniyle Ti-Exo'nun izole edilmesi zor olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada, farelerin dalak dokusundan eksozomları izole etmek için pratik bir protokol geliştirdik ve daha sonraki tanımlama analizi ve fonksiyonel çalışmalar için tekrarlanabilir bir teknik sağladık. Dalak kaynaklı Exo'yu izole etmek için diferansiyel ultrasantrifüjleme ile birlikte Tip I kollajenaz sindirimi kullandık. İzole edilmiş Exo'nun özellikleri elektron mikroskobu, nano akış sitometresi ve western blot ile belirlendi. İzole edilmiş dalak türevli Exo, 30 nm ila 150 nm arasında değişen partikül boyutları ile lipid çift katmanlı veziküllerin tipik morfolojisini sergiledi. Ek olarak, eksozom belirteçlerinin ekspresyon profili, eksozomların varlığını ve saflığını doğruladı. Birlikte ele alındığında, farelerde dalak kaynaklı Exo'yu izole etmek için pratik bir protokolü başarıyla oluşturduk.

Giriş

Eksozomlar (Exo), proteinler, nükleik asitler ve lipitler dahil olmak üzere çok çeşitli biyomolekülleri kapsayan, boyutları 30 ila 150 nm arasında değişen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) bir alt grubudur¹. Bu biyomoleküller ebeveyn hücrelerinden türetilir ve hücre dışı boşluğa salınır. Exo, hem prokaryotik hem de ökaryotik sistemlerde rol oynayarak hücreler ve çevrelerindeki mikro ortamlar arasında biyomoleküler bilgi alışverişini kolaylaştırır². Eksozomların içerik, boyut, zar bileşenleri ve hücresel köken gibi özellikleri oldukça değişkendir ve kaynak hücre tipi, hücresel durum ve çevresel koşullardan etkilenir.

Eksozomlar genellikle kaynaklarına göre üç kategoriye ayrılır: hücre kültüründen türetilmiş, vücut sıvısından türetilmiş ve dokudan türetilmiş (Ti-Exo). Hücre kültüründen türetilmiş eksozomlar, erişilebilirlikleri ve tutarlı verimleri nedeniyle kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, kullanımları, biyolojik işlevlerini yanlış temsil edebilecek uzun süreli kültürden sonra hücre özelliklerindeki potansiyel değişikliklerle sınırlıdır ^3,4,5. Ayrıca, çoğu hücre kültürü, kompleks in vivo hücreler arası etkileşimleri taklit etmeyen iki boyutlu ortamlarda tutulur ve bu da potansiyel olarak veri yorumlamasını^{etkiler 6}. Tersine, biyolojik sıvılardan izole edilen eksozomlar, hastalığın ilerlemesini gerçek zamanlı olarak izlemek için minimal invaziv bir seçenek sunar⁷. Bununla birlikte, bu numuneler genellikle çeşitli kökenlerden gelen eksozomların bir karışımını içerir ve bu da birincil kaynaklarının doğru bir şekilde tanımlanmasını zorlaştırır⁸. Bu zorluklar göz önüne alındığında, hücre dışı interstisyumda bulunan ve hücreler arası sinyalleşmenin anahtar aracıları olan Ti-Exo'ya artan bir ilgi vardır.

Dalak, bağışıklık fonksiyonunda ve iç homeostazın korunmasında çok önemli bir rol oynar. Ti-Exo'yu beyin, karaciğer ve tümörler gibi organlardan izole etmek için mevcut protokollere rağmen, dalak kaynaklı eksozomlar için pratik yöntemler sınırlı olarak rapor edilmiştir ^9,10. Bu çalışma, önceki bir rapordan modifiye edilmiş farelerde dalak dokusundan eksozomları izole etmek için pratik bir protokol oluşturmayı amaçladı¹¹. Kollajenaz sindirimini ve ardından hücre zarının bozulmasını en aza indiren ve dalak türevi Exo'nun yüksek saflığını ve verimini sağlayan ultrasantrifüjlemeyi içeren bir yöntemi detaylandırıyoruz. Bu yerleşik protokol kullanılarak izole edilen Exo'nun özellikleri, elektron mikroskobu (TEM), nano-akış sitometresi (Nano-FCM) ve western blot ile doğrulandı ve protokolün daha ileri deneysel araştırmalar için etkinliğini doğruladı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Örnekler, Guangdong Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından verilen etik onay ile farelerden elde edildi. Bu protokolde kullanılan malzeme, ekipman ve yazılımların ayrıntılı açıklamaları Malzeme Tablosunda verilmiştir. Ekstraksiyon öncesi preparatın detayları Şekil 1'de gösterilirken, Spleen-Exo ekstraksiyonu ve zenginleştirme işlemi Şekil 2'de açıklanmaktadır.

1. Hazırlık

1. Yüksek hızlı ve ultra yüksek hızlı santrifüjleri 4 °C'ye önceden soğutun ve masaüstü çalkalayıcının sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
2. Şekil 1A, B'de gösterildiği gibi hücre kültürü kapları (100 mm), 50 mL steril santrifüj tüpleri, buz ve steril hücre süzgeci (70 μm) hazırlayın.
3. Makas ve forsepsleri %75 alkol spreyi kullanarak sterilize edin, ardından yüksek sıcaklıkta sterilizasyon yapın. Bu araçlar Şekil 1C'de gösterilmiştir.
4. Dalak dokusunu buz üzerinde 100 mm'lik steril bir Petri kabına yerleştirin ve yüzey kanını 1x buzlu steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Dalak dokularını steril gazlı bezle kurulayın ve kuruduktan sonra tartın.
   NOT: Doku donmuşsa, devam etmeden önce bir tabakta buz üzerinde 15 dakika çözdürün.
5. Steril bir transfer pipeti kullanarak süzgecin içine 1 mL steril PBS bırakarak hücre süzgecini (70 μm) nemlendirin.
6. Sindirim tamponunu (% 0.1 tip I kollajenaz) bir girdap karıştırıcı ile 1x PBS kullanarak hazırlayın.
   NOT: Her 100 mg dalak dokusu için 10 mL sindirim tamponu kullanın. Bu çalışmada kollajenaz konsantrasyonu, ürün talimatlarına göre seçilmiştir. Diğer doku türleri için, araştırmacıların bu parametreleri doku yoğunluğuna ve bileşimine göre ayarlamaları gerekebilir. Her doku tipi için en uygun koşulları belirlemek için değişen konsantrasyonlarda ve sindirim sürelerinde ön deneyler yapılması önerilir.

2. Doku sindirimi

1. Dokuyu buz üzerinde bir kültür kabında makasla düzgün küçük parçalar halinde kesin (Şekil 3A) ve steril bir transfer pipeti ile 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
2. Yukarıda belirtildiği gibi dalak dokusu ağırlığına göre tüpe sindirim tamponu ekleyin (Şekil 3B), ardından tüpü 37 °C'de yatay bir çalkalayıcı üzerinde 45°'lik bir açıyla çalkalayın. Sindirim ilerlemesini izleyin ve doku parçaları dağıldığında ve çoğu şeklini kaybettiğinde sindirimi durdurun. Sindirim süresi dokular arasında farklılık göstermelidir. Bu çalışmadaki deney koşullarında sindirim süresi yaklaşık 30 dakikadır.
3. Fibröz ve daha büyük doku kalıntılarını gidermek için sindirilmiş karışımı oda sıcaklığında (RT) bir hücre süzgecine (Ф70 μm) aktarın.
   NOT: Sindirimden hemen sonra filtrelemeyi tamamlayın.
4. Süzüntüyü 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüpünde toplayın.

3. Diferansiyel santrifüjleme ile eksozom izolasyonu

1. Santrifüj filtratları 500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca süzülür. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra artık hücreler, hücre kalıntıları ve çekirdekler içeren bir pelet görülebilir.
2. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleyin. Şekil 3D'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra apoptotik cisimler ve mikrozomlar içeren bir pelet görülebilir.
3. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Pelet içeren mikro-parçacıklar ve plazma zarı, Şekil 3E'de gösterildiği gibi santrifüjlemeden sonra görülebilir.
4. Elde edilen süpernatanı 4 ° C'de 2 saat boyunca 120.000 x g'da ultrasantrifüjleyin. Şekil 3F'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra tüpün dibinde bir pelet görülebilir.
5. Süpernatanı atın, peleti PBS ile yıkayın ve eksozomları elde etmek için 4 ° C'de 2 saat boyunca 120.000 x g'da tekrar ultrasantrifüj edin. Şekil 3G'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra tüpün dibinde bir pelet görülebilir.
6. İzole eksozomları steril PBS (dalak başına 200 μL) ile çözün ve izole edilen eksozomları -80 °C'de yeni bir 2 mL santrifüj tüpünde saklayın.

4. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile eksozom karakterizasyonu

NOT: Ekstrakte edilen Exo'nun vezikül özellikleri gösterip göstermediğini belirlemek için TEM kullanıldı. Elektron mikroskobu ile tanımlanan Exo numuneleri taze numuneler olmalı veya kısa bir süre için 4 °C'de kısa bir süre saklanmalıdır.

1. Eksozomları (2-6 μg/μL) %2 elektron mikroskobu (EM) dereceli paraformaldehit ile RT'de 2 saat sabitleyin.
2. Bakır bir ağ üzerine 10 μL eksozom solüsyonu yerleştirin, RT'de 10 dakika inkübe edin, steril damıtılmış su ile durulayın ve fazla sıvıyı emici kağıtla kurulayın.
3. Bakır ağı 1 dakika boyunca %2 uranil asetat ile boyayın, fazla sıvıyı filtre kağıdı ile kurulayın ve 2 dakika akkor lamba altında kurutun.
4. Hazırlanan numuneyi 80 kV'da bir transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemleyin.

5. Eksozomların boyut dağılımı ve partikül konsantrasyonu ölçümü

1. Standart polistiren nanopartikülleri (250 nm) nano akış sitometresine yükleyin.
2. Bir BCA protein test kiti kullanarak Exo numunelerinin protein konsantrasyonunu ölçün. BCA Protein Testi sonuçlarına göre Exo örneğini PBS ile seyreltin (eksozomları 1-10 ng/μL'ye seyreltin), ardından yan saçılma yoğunluğunu (SSI) ölçmek için Exo örneklerini nano akışa yükleyin.
3. Standart polistiren nanopartiküllerdeki SSI'nin partikül konsantrasyonuna oranına göre Exo konsantrasyonunu hesaplayın.
   NOT: Boyut ölçümü için, gradyan boyutlarına (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) sahip standart silika nanopartiküllerin nano akış sitometresine yüklenmesiyle standart bir eğri oluşturulur. Exo numunesinin yüklenmesi bunu takip eder. Exo'nun boyut dağılımı standart kürlemeye göre hesaplandı.

6. Eksozom proteinlerinin lizis ve immünoblot doğrulaması

1. Protein analizi için eksozom peletine 100 μL radyo immünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu ekleyin.
2. Kuvvetlice girdap yapın, parafilm ile örtün, RT'de 20 dakika sallayın, sonra tekrar girdap yapın.
3. Numuneyi toplamak için 30-60 saniye boyunca 1000 x g'da kısa bir süre santrifüjleyin, yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve analize kadar -20 °C ila -80 °C arasında saklayın.
4. İmmünoblot için, 1x konsantrasyon elde etmek için numuneleri 5x yükleme tamponu ile karıştırın ve jel elektroforezi için hazırlanın.
5. Tüm doku homojenat kontrolleri isteniyorsa, yukarıda detaylandırıldığı gibi dokuyu parçalamak için bir proteaz inhibitörü ile güçlü bir lizis tamponu kullanın. Ardından, numuneleri 10,000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve kalan hücre dışı matrisi, tüm hücreleri veya sağlam hücresel kalıntıları atın.
6. Eksozom veya doku homojenatı içeren numune tamponunu 95 °C'de 5-10 dakika kaynatın. %10'luk bir SDS-PAGE jele şerit başına eşit protein yükleyin. Kontrol olarak eşit doku homojenat proteini yükleyin.
7. Konvansiyonel elektroforez tamponunu kullanarak yaklaşık 2 saat boyunca 80 V'luk bir voltaj altında jel elektroforezine devam edin. Saflaştırılmış lizatlardaki Exo protein ekspresyonunu doğrulamak için western blot analizi yapın ve fraksiyonlardaki nispi Exo bolluğunu karşılaştırın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Dalak kaynaklı eksozomların izolasyonu ve saflaştırılması
Eksozomları fare dalak dokusundan izole etmek için, kollajenaz sindirimi ve diferansiyel ultrasantrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullandık (Şekil 2). İlk adımlar, yüzey kanını çıkarmak için dalak dokusunun ön işlemden geçirilmesini ve ardından Tip I kollajenaz ile sindirimi içeriyordu. Bu enzimatik işlem, hücre dışı matris bileşenlerinin parçalanmas?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Son zamanlarda yapılan araştırmalar, dalak kaynaklı eksozomların (Spleen-Exo) mide kanserinin tedavisinde kritik bir rol oynadığını bildirmiştir¹². Spleen-Exo'nun işlevlerini daha da aydınlatmak için, dalak dokusundan çıkarılması için tekrarlanabilir ve optimal bir yöntem oluşturmak gerekir. Beyin ve karaciğer kanserinden eksozomları izole etmek için protokoller mevcut olsa^{da 13,14}, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 µm Cell Strainer	Biologix Group Co., Ltd.USA	15-1070
Anti CD9 antibody	Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA	983275
Anti GM130 antibody	Proteintech Group, Inc.China	66662-1-lg
Anti TSG101 antibody	Abcam Plc, UK	125011
Cell Culture Dish	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	704001
Centrifuge tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd, China	788211
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich Corp., USA	C2674
Desktop Thermostatic Shaker	Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., China	THZ-100
Electrophoresis buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2081-1L
Enhanced BCA Protein Assay Kit	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0010S
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc., China	N30E
Fluorescence/Chemiluminescence imaging system	Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China	GelView 6000Plus
HRP Goat anti-Mouse IgG	Proteintech Group, Inc.China	15014
HRP Goat anti-Rabbit IgG	Proteintech Group, Inc.China	15015
microplate reader	Molecular Devices, USA	CMax Plus
Microscissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA1010
Microscopic tweezers	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	WA3010
Multifuge X1R Pro centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	75009750
Ophthalmic scissors	Shanghai Medical Instruments (group) Co., Ltd.,China	Y00030
Ophthalmic tweezers	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd., China	JD1060
Optima XPN-100 Ultrafiltration centrifuge	Beckman Coulter, USA	A94469
phosphate buffered saline (PBS)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., China	P1003
RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors)	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0013K
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0015
Transfer Pipet	Biologix Group Co., Ltd.USA	30-0238A1
Transmission Electron Microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Ultracentrifugation tube	Beckman Coulter, USA	355618
Western Transfer Buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2028-1L