تحضير الهلاميات المائية الببتيدات ذاتية التجميع المستقرة ميكانيكيا

Summary

يقدم هذا البروتوكول ثلاث طرق تحضير سريعة وبسيطة تستخدم الظروف البيئية لتحفيز التجميع الذاتي للببتيدات في الهلاميات المائية. بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف توصيف الهلاميات المائية الببتيد ، مما يدل على أنه يمكن تشكيل الهلاميات المائية الببتيد المستقرة ميكانيكيا في ظل هذه الظروف المباشرة.

Abstract

الهلاميات المائية الببتيد عبارة عن مواد هلامية شبكية ثلاثية الأبعاد محبة للماء للغاية تتكون من التجميع الذاتي للألياف النانوية أو البوليمرات ، مما يخلق شبكات قفل الماء. يشبه مورفولوجيتها إلى حد كبير مصفوفة خارج الخلية ، مما يسمح لها بإظهار كل من الوظائف البيولوجية للببتيدات وخصائص الهلام المستجيبة. أدت هذه الخصائص الفريدة إلى تطبيقها على نطاق واسع في هندسة الأنسجة ، وزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ، وعلاج السرطان ، والطب التجديدي ، وغيرها من المجالات الطبية الحيوية. توضح هذه المقالة ثلاث طرق لإعداد الهلاميات المائية ECF-5 الببتيد باستخدام الببتيدات ذاتية التجميع مع عمليات التبلور المستجيبة بيئيا: (1) التبلور المستجيب للأس الهيدروجيني: تؤدي مستويات الأس الهيدروجيني المتفاوتة إلى البروتون أو إزالة البروتون من بقايا الأحماض الأمينية ، وتغيير التفاعلات الكهروستاتيكية بين جزيئات الببتيد وتعزيز تجميعها الذاتي في الهلاميات المائية. (2) إضافة أيون المعدن: يتم خلب أيونات المعادن متعددة التكافؤ مع بقايا الأحماض الأمينية سالبة الشحنة ، وتعمل كجسور بين الببتيدات لتشكيل هيدروجيل شبكي ؛ (3) تبادل المذيبات: يتم إذابة الببتيدات الكارهة للماء في البداية في مذيبات عضوية غير قطبية وبالتالي تحفز التجميع الذاتي في الهلاميات المائية عند الانتقال إلى بيئة مائية قطبية. تستخدم هذه الطرق الإجراءات التجريبية التقليدية لتسهيل التجميع الذاتي للببتيد في الهلاميات المائية. من خلال تصميم تسلسلات الببتيد لتتماشى مع ظروف محددة تحفز الهلام ، من الممكن تحقيق هياكل دقيقة / نانوية ووظائف بيولوجية مضبوطة بدقة ، مما يسلط الضوء على الإمكانات الكبيرة للهلاميات المائية الببتيد في المجال الطبي الحيوي.

Introduction

من خلال تصميم تسلسلات الببتيد ، تؤدي التفاعلات غير التساهمية بين الببتيدات إلى التجميع الذاتي ، مما يؤدي إلى تكوين هياكل دقيقة ونانومترية مرتبة ، بما في ذلك الأنابيب النانوية ، والأشرطة النانوية ، والألياف النانوية ، والهياكل الكروية¹. عند تجميعها ذاتيا في ألياف / شرائط ميكرو ونانومتر ، تظهر هذه الهياكل خصائص هيدروجيل مجهرية. تختلف الهلاميات المائية ذاتية التجميع للببتيد عن الهلاميات المائية البوليمرية من حيث أنها تتجمع ذاتيا من خلال التفاعلات غير التساهمية ، وشكلها الهلامي قابل للعكس ، وتستجيب بسهولة لظروف محددة للانتقال بين مرحلتي المحلول والهلام². على سبيل المثال ، يمكن حث ببتيدات الأحماض الأمينية العطرية على الجيلاتين بناء على تبديل المذيبات^3،4،5 ، وتشكل ببتيدات RADA16 المواد الهلامية من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية الموجبة^{والأنيونية 6} ، ويتم تحفيز الببتيد E1Y9 لتكوين هيدروجيل عبر أيونات Ca^{2+ 7}. يمكن استقلاب الأحماض الأمينية الطبيعية بواسطة جسم الإنسان وتوفر توافقا حيويا ممتازا ، وهي ميزة لا يمكن للهلاميات المائية البوليمرية^{تحقيقها 8}. البروتينات هي الجزيئات التي تنفذ وظائف بيولوجية ، والاختلافات في تسلسل الببتيد تخلق وظائفها البيولوجية المحددة. لذلك ، فإن تضمين تسلسلات الببتيد الوظيفية الحيوية المحددة ومنحها خصائص التجميع الذاتي يمكن أن يصمم الهلاميات المائية ذاتية التجميع للببتيد بوظائف بيولوجية وأشكال^{فريدة 9،10،11}. تقدم هذه المقالة ثلاث طرق لتحضير الهلاميات المائية الببتيدية ، حيث يتم تشغيل عملية التبلور عن طريق الاستجابة البيئية. كما يناقش بإيجاز طرق توصيف الخواص الميكانيكية ومورفولوجيا الهلاميات المائية الببتيدية.

ينظم الرقم الهيدروجيني شحنة الأحماض الأمينية ، مما يؤدي إلى هلام بعض الببتيدات. على سبيل المثال ، يتم تنظيم الأحماض الأمينية موجبة الشحنة (على سبيل المثال ، الأرجينين والليسين والهيستيدين) بواسطة الرقم الهيدروجيني للوصول إلى حالات موجبة أو محايدة. يتم تنظيم الأحماض الأمينية سالبة الشحنة بواسطة الأس الهيدروجيني لتحقيق حالات سالبة أو محايدة ، والابتعاد عن نقطتها متساوية الكهرباء وبالتالي تغيير محبة الماء في المحاليل المائية. لذلك ، فإن التحكم في التفاعلات الكهروستاتيكية والكارهة للماء بين الببتيدات يسهل تجميعها الذاتي المطلوب. صمم Zhang et al. ببتيد ذاتي التجميع مستجيب لدرجة الحموضة البرمائية ، KKFKFEFEF مقترن بالميثوتريكسات ، والذي يستجيب للبيئات الحمضية قليلا في المختبر وفي الجسم الحي ، مما يتيح انتقال مرحلة sol إلى Gel. هذا يؤدي إلى امتصاص خلوي فعال وخلية داخلية ، وبالتالي تقديم الأدوية المضادة للسرطان وتحسين فعالية العلاج الكيميائي¹². صمم Shen et ^al.13 الببتيد FF8 (KRRFFRRK) ، والذي يتجمع بسهولة في ألياف عند درجة حموضة أكبر من 9.4. في ظل الظروف المحايدة ، تعمل الكائنات الحية الدقيقة على تحييد شحناتها الموجبة بسبب التفاعلات الكهروستاتيكية مع أغشية الفوسفوليبيد سالبة الشحنة ، والتنسيق مع جزيئات الفوسفوليبيد للتجميع الذاتي ، مما يتسبب في تمزق الغشاء وتعزيز تأثيرات مبيد للجراثيم¹³.

يعد تحفيز التجميع الذاتي فوق الجزيئي للببتيد في الهلاميات المائية باستخدام معادن التنسيق طريقة نادرة نسبيا¹⁴. عندما تتفاعل أيونات المعادن إلكتروستاتيكيا مع الببتيدات ، فإنها تشكل جسورا ملحية تربط جزيئات الببتيد ، مما يؤدي إلى تفاعلات غير تساهمية وتجميع ذاتي ، مما ينتج عنه خصائص الهلام. على سبيل المثال ، صمم أبو الهيجة ^{وآخرون 15} ثلاثي الببتيد FFD ، والذي ينتقل من سائل إلى هيدروجيل عند إضافة أيونات النحاس. طور Tao et ^al.16 حمض الجلوتاميك والببتيد الغني بالفينيل ألانين E3F3 ، والذي يتجمع ذاتيا في هيدروجيلات ليفية في وجود أيونات الزنك ، ويستخدم لتوصيل أدوية البروستاتا.

يعد تكوين تبادل المذيبات للهلاميات المائية الببتيد هو أكثر حالات تحفيز التجميع الذاتي فوق الجزيئي شيوعا. بعد أن تذوب الببتيدات الكارهة للماء في المذيبات العضوية ، تتعرض مجموعاتها الكارهة للماء بالكامل. عند نقلها إلى مرحلة مائية ، تقترب المجموعات الكارهة للماء من بعضها البعض ، وتسهل جزيئات الماء تكوين روابط هيدروجينية الببتيد ، مما يؤدي إلى التجميع الذاتي السريع وتكوين الهلاميات المائية بسهولة. على سبيل المثال ، صمم Zhang et ^al.17 ببتيد يمكن أن يذوب بثبات بتركيزات عالية في المذيبات العضوية القطبية ، وعند تخفيفه بالماء ، يتم تجميعه ذاتيا في هياكل من β صفائح لتشكيل الهلاميات المائية من ألياف الببتيد. صمم Shen et ^al.13 ببتيد مختزل ECF-5 (ECAFF) ، مذاب مسبقا في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ثم يتم حقنه في مرحلة مائية لتشكيل هيدروجيل مختزل ، يستخدم للإزالة المستهدفة لأنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن نقص التروية - إعادة التروية ، والتي تحللت لاحقا إلى محلول بعد الكسح.

اختارت هذه الدراسة ثلاث استراتيجيات بسيطة وسريعة وقابلة للتعميم لتحضير هيدروجيل الببتيد بناء على التجارب السابقة: (1) طريقة استجابة الأس الهيدروجيني: يتم إذابة الببتيدات في محلول بدرجة حموضة بعيدة عن نقطتها متساوية الكهرباء ، ثم يتم ضبط الأس الهيدروجيني بالقرب من النقطة متساوية الكهرباء. يسمح هذا التغيير لبعض الببتيدات ذاتية التجميع بتكوين ألياف وإنشاء هيدروجيل الببتيد. (2) طريقة إضافة أيونات المعادن: تضاف كاتيونات التنسيق إلى الببتيدات ذاتية التجميع القابلة للذوبان في الماء والسالبة الشحنة. يؤدي استخلاب التنسيق المعدني بين الببتيدات إلى تجميعها الذاتي في الهلاميات المائية. (3) طريقة تبادل المذيبات: يتم إذابة الببتيدات عالية التركيز في المذيبات العضوية ثم يتم تخفيفها إلى مرحلة مائية ، مما يؤدي إلى سلوك الهلام.

Protocol

تفاصيل البلازميدات والكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. طريقة استجابة الأس الهيدروجيني

1. أضف 5 ملغ من ببتيدات ECF-5 إلى 400 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. صوتنة عند 40 كيلو هرتز لمدة 30 دقيقة واخلطها جيدا.
2. أضف 40 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم (1 متر ، مفلتر من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر) إلى محلول الببتيد. دوامة وتخلط جيدا. استمر في الصوتنة لمدة 15 دقيقة حتى يتم توضيح المحلول تماما.
3. أضف 60 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك. دوامة بسرعة وضمان الخلط الشامل. اترك الخليط في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 30 دقيقة لتسهيل تكوين الهيدروجيل.
   ملاحظة: استبدل الماء منزوع الأيونات بالمحلول العازل المطلوب إذا لزم الأمر. إذا كانت الجسيمات الصلبة كبيرة ، فقم بسحقها مسبقا. Sonicate لتحقيق خليط جسيمات متجانس في السائل. إذا كان الببتيد لا يتحمل الظروف القلوية ، أضف محلول حمض الهيدروكلوريك 1 M أولا وكرر الخطوات المذكورة أعلاه. اضبط كميات الحمض والقاعدة حسب الضرورة للوصول إلى النقطة المتساوية أو الأس الهيدروجيني المطلوب ، مع ضمان الاحتفاظ بخصائص تكوين الهلام.

2. طريقة إضافة أيون المعادن

1. تحضير المواد
   1. قم بإعداد 0.15 متر من Tris و 0.1 M من المخزن المؤقت كلوريد الصوديوم عند درجة الحموضة 7.4. قم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
   2. قم بإعداد محلول الببتيد ذاتي التجميع ECF-5 بتركيز 10 مجم / مل باستخدام المخزن المؤقت المحضر في الخطوة 1.1.1. يذوب عن طريق الصوتنة ويخزن في 4 درجات مئوية.
   3. تحضير محلول كلوريد الكالسيوم 50 مجم / مل باستخدام الماء منزوع الأيونات. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. إضافة أيون معدنية الناجم عن تشكيل هيدروجيل الببتيد
   1. أضف 40 ميكرولتر من محلول كلوريد الكالسيوم إلى 460 ميكرولتر من محلول الببتيد ECF-5. دوامة وتخلط جيدا. اترك الخليط في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 2 ساعة.
      ملاحظة: تجنب استخدام عازلة الفوسفات ، لأنها قد تؤدي إلى ترسيب أيون الكالسيوم.

3. طريقة تبادل المذيبات

1. تحضير المواد
   1. يزن 10 مجم من مسحوق ECF-5 المجفف بالتجميد. أضفه إلى 100 ميكرولتر من DMSO. تخلط جيدا باستخدام الموجات فوق الصوتية وتخزينها في 4 درجات مئوية.
   2. قم بإعداد 10 ملي مولار من محلول المخزن المؤقت PBS. التصفية والتعقيم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ويستخدم في غضون أسبوع واحد.
2. تكوين هيدروجيل الببتيد الناجم عن المذيبات
   1. أدخل بسرعة 1 مل من PBS في الببتيد المذاب DMSO. دوامة وتخلط جيدا. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   2. أضف 500 ميكرولتر من PBS ، واتركه لمدة 15 دقيقة ، وتخلص من المادة الطافية ، واحتفظ بالجل السفلي. كرر هذه العملية ثلاث مرات لإزالة DMSO.
      ملاحظة: إذا كان DMSO يؤثر على التجارب اللاحقة ، ففكر في إذابة الببتيد بتركيز أعلى من DMSO لتقليل تأثيره.

4. التوصيف الميكانيكي للهيدروجيل

1. التحليل الريولوجي
   1. يسكب الهيدروجيل على لوح متوازي من الألومنيوم مقاس 25 مم. قم بإجراء تحليل ريولوجي ديناميكي للمسح الزمني للهلاميات المائية الببتيد باستخدام مقياس الريومتر¹⁸.
2. تحليلات اكتساح التردد والإجهاد
   1. إجراء تحليلات التردد واكتساح الإجهاد¹⁸ بشكل منهجي باستخدام سلالة خاضعة للرقابة بنسبة 0.3٪ وتردد 10 راد / ثانية. تأكد من ضبط التحكم في درجة الحرارة على 25 درجة مئوية.

5. توصيف مجهر القوة الذرية (AFM) لمورفولوجيا الألياف

1. تحضير المواد
   1. تحضير محلول من 95٪ إيثانول وإضافة 5٪ APTES. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية ويستخدم في غضون شهر واحد.
   2. ضع مادة لاصقة على الوجهين لإزالة طبقة من الميكا. قم بلصق أسطح الميكا باستخدام محلول APTES واتركها لمدة 5 دقائق. اشطفيه جيدا بالماء النقي قبل الاستخدام.
   3. خفف واخلط الهيدروجيل جيدا. قم بإسقاطه على سطح الميكا المعدل واترك الامتصاص الساكن لمدة 5 دقائق. اشطف السطح بالماء النقي وجففه قبل الاستخدام.
2. طريقة الكشف
   1. استخدم AFM متعدد الأوضاع مزود بماسح ضوئي لفحص ألياف الببتيد أو أشكال الهيدروجيل. استخدم ناتئ السيليكون بثابت زنبركي اسمي يبلغ 48 نيوتن / م.
   2. قم بتهيئة الأداة لوضع الإبرة. حدد وضع النقر لمسح العينة ضوئيا للحصول على الصور.

النتائج

تتيح الطرق الثلاث الموضحة في هذه المقالة لإعداد الهلاميات المائية الببتيد إنتاجا سريعا وبأسعار معقولة ومباشرا. ترتبط وظيفة الهيدروجيل بتسلسل الببتيد. هنا ، يتم استخدام ببتيد ECF-5 كمثال تمثيلي لإثبات خصائصه الفيزيائية ، بما في ذلك التشكل المجهري والخصائص الميكانيكية.

...

Discussion

في العقود القليلة الماضية ، بعد اكتشاف تسلسل الببتيد ذاتي التجميع المشتق من بروتينات الأميلويد ، تم تصميم العديد من الببتيدات ذاتية التجميع بناء على خصائصها ، مما يدل على إمكانات كبيرة للتطبيقات في الطب الحيوي وعلوم^{المواد 19}. أظهرت الهلاميات المائية الببتي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyl)triethoxysilane	Aladdin	A107147	/
Atomic Force Microscopy	Bruker	Multimode Nanoscope VIII	/
CaCl2	Aladdin	C290953	/
Diphenylalanine (FF)	Chinesepeptide	customizable	Purity > 95%
DMSO	Sigma-aldrich	34869	/
ECF-5 Peptides	Chinesepeptide	sequence: ECAFF	Purity > 95%
Hydrochloric Acid	Aladdin	H399657	/
Mica	Sigma-aldrich	AFM-71856-02	/
Phosphate Buffered Saline	Aladdin	P492453	/
Rheometer	Anton Paar GmbH	MCR302	/
Silicon Cantilevers	MikroMasch	XSC11	/
Sodium Chloride	Aladdin	C111549	/
Sodium Hydroxide	Aladdin	S140903	/
TRIS Hydrochloride	Aladdin	T431531	/