Preparazione di idrogel peptidi autoassemblati meccanicamente stabili

Riepilogo

Questo protocollo presenta tre metodi di preparazione rapidi e semplici che utilizzano le condizioni ambientali per innescare l'autoassemblaggio di peptidi in idrogel. Inoltre, viene descritta la caratterizzazione degli idrogel peptidici, dimostrando che gli idrogel peptidici meccanicamente stabili possono essere formati in queste semplici condizioni.

Abstract

Gli idrogel peptidici sono gel di rete tridimensionali altamente idrofili formati dall'autoassemblaggio di nanofibre o polimeri, creando reti di bloccaggio dell'acqua. La loro morfologia ricorda da vicino quella della matrice extracellulare, consentendo loro di esibire sia le funzioni biologiche dei peptidi che le proprietà di gelificazione reattiva. Queste caratteristiche uniche hanno portato alla loro ampia applicazione nell'ingegneria tissutale, nella coltura cellulare tridimensionale, nella terapia del cancro, nella medicina rigenerativa e in altri campi biomedici. Questo articolo descrive tre metodi per la preparazione di idrogel peptidici ECF-5 utilizzando peptidi autoassemblanti con processi di gelificazione sensibili all'ambiente: (1) gelificazione sensibile al pH: livelli di pH variabili inducono la protonazione o la deprotonazione di residui di amminoacidi, alterando le interazioni elettrostatiche tra le molecole peptidiche e promuovendo il loro autoassemblaggio in idrogel; (2) Aggiunta di ioni metallici: gli ioni metallici polivalenti chelano con residui di amminoacidi caricati negativamente, fungendo da ponti tra i peptidi per formare un idrogel di rete; (3) Scambio di solventi: i peptidi idrofobici sono inizialmente disciolti in solventi organici non polari e successivamente inducono l'autoassemblaggio in idrogel dopo la transizione in un ambiente acquoso polare. Questi metodi utilizzano procedure sperimentali convenzionali per facilitare l'autoassemblaggio dei peptidi in idrogel. Progettando sequenze peptidiche in modo che si allineino con specifiche condizioni che inducono la gelificazione, è possibile ottenere micro/nanostrutture e funzioni biologiche finemente sintonizzate, evidenziando il potenziale significativo degli idrogel peptidici nel dominio biomedico.

Introduzione

Attraverso la progettazione di sequenze peptidiche, le interazioni non covalenti tra peptidi inducono l'autoassemblaggio, portando alla formazione di strutture micro e nanometriche ordinate, inclusi nanotubi, nanonastri, nanofibre e strutture sferiche¹. Quando sono autoassemblate in fibre/nastri micro e nanometrici, queste strutture mostrano macroscopicamente proprietà di idrogel. Gli idrogel autoassemblanti peptidici differiscono dagli idrogel polimerici in quanto si autoassemblano attraverso interazioni non covalenti, la loro forma gel è reversibile e rispondono prontamente a condizioni specifiche per la transizione tra la fase della soluzione e quella del gel². Ad esempio, i peptidi di amminoacidi aromatici possono essere indotti a gelatinizzare sulla base della commutazione del solvente ^3,4,5, i peptidi RADA16 formano gel attraverso interazioni elettrostatiche cationiche e anioniche⁶ e il peptide E1Y9 è indotto a formare un idrogel tramite ioni Ca^{2+ 7}. Gli amminoacidi naturali possono essere metabolizzati dal corpo umano e offrono un'eccellente biocompatibilità, una caratteristica che gli idrogel polimerici non possono raggiungere⁸. Le proteine sono le molecole che svolgono funzioni biologiche e le differenze nelle sequenze peptidiche creano le loro specifiche funzioni biologiche. Pertanto, l'inclusione di specifiche sequenze peptidiche biofunzionali e il loro conferimento di proprietà autoassemblanti può progettare idrogel autoassemblanti peptidici con funzioni biologiche e morfologie uniche ^9,10,11. Questo articolo introduce tre metodi per la preparazione di idrogel peptidici, in cui il processo di gelificazione è innescato dalla reattività ambientale. Discute inoltre brevemente i metodi per caratterizzare le proprietà meccaniche e la morfologia degli idrogel peptidici.

Il pH regola la carica degli amminoacidi, innescando la gelificazione di alcuni peptidi. Ad esempio, gli amminoacidi caricati positivamente (ad esempio, arginina, lisina, istidina) sono regolati dal pH per raggiungere stati positivi o neutri. Gli amminoacidi caricati negativamente sono regolati dal pH per raggiungere stati negativi o neutri, allontanandosi dal loro punto isoelettrico e alterando così la loro idrofilia in soluzioni acquose. Pertanto, il controllo delle interazioni elettrostatiche e idrofobiche tra i peptidi facilita il loro autoassemblaggio ordinato. Zhang et al. hanno progettato un peptide autoassemblante anfifilico che risponde al pH, KKFKFEFEF accoppiato a metotrexato, che risponde ad ambienti leggermente acidi sia in vitro che in vivo, consentendo una transizione di fase da sol a gel. Ciò porta a un efficiente assorbimento cellulare e all'endocitosi, fornendo così farmaci antitumorali e migliorando l'efficacia della chemioterapia¹². Shen et ^al.13 hanno progettato il peptide FF8 (KRRFFRRK), che si autoassembla facilmente in fibre a un pH superiore a 9,4. In condizioni neutre, i microrganismi neutralizzano le loro cariche positive a causa delle interazioni elettrostatiche con le loro membrane fosfolipidiche caricate negativamente, coordinandosi con le molecole di fosfolipidi per autoassemblarsi, causando la rottura della membrana e aumentando gli effetti battericidi¹³.

L'attivazione dell'autoassemblaggio supramolecolare di peptidi in idrogel utilizzando metalli di coordinazione è un metodo relativamente raro¹⁴. Quando gli ioni metallici interagiscono elettrostaticamente con i peptidi, formano ponti salini che collegano le molecole peptidiche, portando a interazioni non covalenti e all'autoassemblaggio, che si traduce in proprietà di gelificazione. Ad esempio, Abul-Haija et ^al.15 hanno progettato il tripeptide FFD, che passa da un liquido a un idrogel dopo l'aggiunta di ioni rame. Tao et ^al.16 hanno sviluppato l'acido glutammico e il peptide ricco di fenilalanina E3F3, che si autoassembla in idrogel fibrosi in presenza di ioni zinco e viene utilizzato per la somministrazione di farmaci alla prostata.

La formazione di idrogel peptidici a scambio di solventi è la condizione più comune che innesca l'autoassemblaggio supramolecolare. Dopo che i peptidi idrofobici si sono dissolti in solventi organici, i loro gruppi idrofobici sono completamente esposti. Quando vengono trasferiti in una fase acquosa, i gruppi idrofobici si avvicinano l'uno all'altro e le molecole d'acqua facilitano la formazione di legami idrogeno peptidici, portando a un rapido autoassemblaggio e a una facile formazione di idrogel. Ad esempio, Zhang et ^al.17 hanno progettato un peptide in grado di dissolversi stabilmente ad alte concentrazioni in solventi organici polari e, dopo diluizione con acqua, autoassemblato in strutture a β fogli per formare idrogel di fibre peptidiche. Shen et ^al.13 hanno progettato un peptide riduttivo ECF-5 (ECAFF), pre-disciolto in dimetilsolfossido (DMSO) e poi iniettato in una fase acquosa per formare un idrogel riduttivo, utilizzato per la rimozione mirata delle specie reattive dell'ossigeno prodotte dall'ischemia-riperfusione, che successivamente si degradano in una soluzione dopo lo scavenging.

Questo studio ha selezionato tre strategie di preparazione di idrogel peptidico semplici, rapide e altamente generalizzabili basate su esperienze precedenti: (1) Metodo di risposta al pH: i peptidi vengono disciolti in una soluzione con un pH lontano dal loro punto isoelettrico, quindi il pH viene regolato vicino al punto isoelettrico. Questo cambiamento consente ad alcuni peptidi autoassemblanti di formare fibre e creare idrogel peptidici; (2) Metodo di addizione di ioni metallici: i cationi di coordinazione vengono aggiunti a peptidi autoassemblanti solubili in acqua e caricati negativamente. La chelazione di coordinazione metallica tra i peptidi porta al loro autoassemblaggio in idrogel; (3) Metodo di scambio di solventi: i peptidi ad alta concentrazione vengono disciolti in solventi organici e quindi diluiti in una fase acquosa, inducendo un comportamento di gelificazione.

Protocollo

I dettagli dei plasmidi, dei reagenti e delle apparecchiature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Metodo di risposta al pH

1. Aggiungere 5 mg di peptidi ECF-5 a 400 μL di acqua deionizzata. Sonicare a 40 kHz per 30 minuti e mixare accuratamente.
2. Aggiungere 40 μl di idrossido di sodio (1 M, filtrato attraverso un filtro da 0,22 μm) alla soluzione peptidica. Agitare e mescolare accuratamente. Continuare la sonicazione per 15 minuti fino a quando la soluzione non è completamente chiarificata.
3. Aggiungere 60 μl di acido cloridrico. Vortice rapidamente e garantire una miscelazione accurata. Lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per oltre 30 minuti per facilitare la formazione dell'idrogel.
   NOTA: Se necessario, sostituire l'acqua deionizzata con la soluzione tampone desiderata. Se le particelle solide sono grandi, polverizzarle in anticipo. Sonicare per ottenere una miscela omogenea di particelle nel liquido. Se il peptide è intollerante alle condizioni alcaline, aggiungere prima la soluzione di acido cloridrico 1 M e ripetere i passaggi precedenti. Regolare le quantità di acido e base secondo necessità per raggiungere il punto isoelettrico o il pH desiderato, assicurandosi che le proprietà di gelificazione vengano mantenute.

2. Metodo di addizione di ioni metallici

1. Preparazione del materiale
   1. Preparare 0,15 m di Tris e 0,1 m di tampone NaCl a pH 7,4. Filtrare con un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C per un massimo di una settimana.
   2. Preparare una soluzione peptidica autoassemblante ECF-5 a una concentrazione di 10 mg/mL utilizzando il tampone preparato al punto 1.1.1. Sciogliere per sonicazione e conservare a 4 °C.
   3. Preparare una soluzione di cloruro di calcio da 50 mg/mL utilizzando acqua deionizzata. Conservare a 4 °C.
2. Formazione di idrogel peptidico indotta dall'aggiunta di ioni metallici
   1. Aggiungere 40 μl di soluzione di cloruro di calcio a 460 μl della soluzione peptidica ECF-5. Agitare e mescolare accuratamente. Lasciare riposare il composto a temperatura ambiente per oltre 2 ore.
      NOTA: Evitare l'uso di tampone fosfato, poiché potrebbe portare alla precipitazione di ioni calcio.

3. Metodo di scambio di solventi

1. Preparazione dei materiali
   1. Pesare 10 mg di polvere liofilizzata peptidica ECF-5. Aggiungerlo a 100 μL di DMSO. Mescolare accuratamente con gli ultrasuoni e conservare a 4 °C.
   2. Preparare 10 mM di soluzione tampone PBS. Filtrare e sterilizzare. Conservare a 4 °C e consumare entro 1 settimana.
2. Formazione di idrogel peptidici indotta da solvente
   1. Introdurre rapidamente 1 mL di PBS nel peptide solubilizzato con DMSO. Agitare e mescolare accuratamente. Lasciate riposare a temperatura ambiente per 5 min.
   2. Aggiungere 500 μl di PBS, lasciare riposare per 15 minuti, scartare il surnatante e conservare il gel inferiore. Ripetere questa procedura tre volte per rimuovere il DMSO.
      NOTA: Se il DMSO influisce sugli esperimenti successivi, prendere in considerazione la possibilità di sciogliere il peptide in una concentrazione più elevata di DMSO per ridurne al minimo l'impatto.

4. Caratterizzazione reomeccanica dell'idrogel

1. Analisi reologica
   1. Versare l'idrogel su una piastra parallela di alluminio da 25 mm. Eseguire l'analisi reologica a scansione dinamica del tempo degli idrogel peptidici utilizzando un reometro¹⁸.
2. Analisi di frequenza e deformazione
   1. Condurre sistematicamente analisi di frequenza e deformazione¹⁸ utilizzando una deformazione controllata dello 0,3% e una frequenza di 10 rad/s. Assicurarsi che il controllo della temperatura sia impostato su 25 °C.

5. Caratterizzazione al microscopio a forza atomica (AFM) della morfologia delle fibre

1. Preparazione dei materiali
   1. Preparare una soluzione di etanolo al 95% e aggiungere il 5% di APTES. Conservare a -20 °C e consumare entro 1 mese.
   2. Applicare il biadesivo per rimuovere uno strato di mica. Far aderire le superfici di mica utilizzando la soluzione APTES e lasciarla riposare per 5 min. Sciacquare abbondantemente con acqua pura prima dell'uso.
   3. Diluire e mescolare accuratamente l'idrogel. Lasciarlo cadere sulla superficie di mica modificata e lasciare che l'adsorbimento statico per 5 minuti. Sciacquare la superficie con acqua pura e asciugarla prima dell'uso.
2. Metodo di rilevamento
   1. Utilizza un AFM multimodale dotato di uno scanner per esaminare le morfologie delle fibre peptidiche o degli idrogel. Utilizzare cantilever in silicone con una costante nominale della molla di 48 N/m.
   2. Inizializzare lo strumento per posizionare l'ago. Selezionare la modalità di tocco per scansionare il campione per acquisire le immagini.

Risultati

I tre metodi descritti in questo articolo per la preparazione di idrogel peptidici consentono una produzione rapida, economica e semplice. La funzione dell'idrogel è correlata alla sua sequenza peptidica. Qui, il peptide ECF-5 viene utilizzato come esempio rappresentativo per dimostrare le sue caratteristiche fisiche, tra cui la morfologia microscopica e le proprietà meccaniche.

Come mostrato nella Figura 1A e nella Figu...

Discussione

Negli ultimi decenni, in seguito alla scoperta di sequenze peptidiche autoassemblanti derivate da proteine amiloidi, numerosi peptidi autoassemblanti sono stati progettati sulla base delle loro proprietà, dimostrando un potenziale significativo per applicazioni in biomedicina e scienza dei materiali¹⁹. Gli idrogel peptidici hanno mostrato capacità di biofunzionalizzazione uniche nella coltura dei tessuti, nella somministrazione di farmaci e nel trattamento dei t...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyl)triethoxysilane	Aladdin	A107147	/
Atomic Force Microscopy	Bruker	Multimode Nanoscope VIII	/
CaCl2	Aladdin	C290953	/
Diphenylalanine (FF)	Chinesepeptide	customizable	Purity > 95%
DMSO	Sigma-aldrich	34869	/
ECF-5 Peptides	Chinesepeptide	sequence: ECAFF	Purity > 95%
Hydrochloric Acid	Aladdin	H399657	/
Mica	Sigma-aldrich	AFM-71856-02	/
Phosphate Buffered Saline	Aladdin	P492453	/
Rheometer	Anton Paar GmbH	MCR302	/
Silicon Cantilevers	MikroMasch	XSC11	/
Sodium Chloride	Aladdin	C111549	/
Sodium Hydroxide	Aladdin	S140903	/
TRIS Hydrochloride	Aladdin	T431531	/