기계적으로 안정적인 자체 조립 펩타이드 하이드로겔의 제조

요약

이 프로토콜은 환경 조건을 사용하여 펩타이드가 하이드로겔로 자가 조립되도록 하는 세 가지 빠르고 간단한 준비 방법을 제시합니다. 또한 펩타이드 하이드로겔의 특성 분석이 설명되어 이러한 간단한 조건에서 기계적으로 안정적인 펩타이드 하이드로겔을 형성할 수 있음을 보여줍니다.

초록

펩타이드 하이드로겔은 나노섬유 또는 폴리머의 자체 조립에 의해 형성된 친수성이 높은 3차원 네트워크 겔로, 물 잠금 네트워크를 생성합니다. 그들의 형태는 세포외 기질의 형태와 매우 유사하여 펩타이드의 생물학적 기능과 반응성 겔화 특성을 모두 나타낼 수 있습니다. 이러한 고유한 특성으로 인해 조직 공학, 3차원 세포 배양, 암 치료, 재생 의학 및 기타 생물 의학 분야에서 광범위하게 적용되고 있습니다. 이 기사에서는 환경적으로 반응하는 겔화 공정과 함께 자가 조립 펩타이드를 사용하여 ECF-5 펩타이드 하이드로겔을 제조하는 세 가지 방법을 설명합니다: (1) pH 반응성 겔화: 다양한 pH 수준은 아미노산 잔기의 양성자화 또는 탈양성자화를 유도하여 펩타이드 분자 간의 정전기 상호 작용을 변경하고 하이드로겔로의 자체 조립을 촉진합니다. (2) 금속 이온 첨가: 음전하를 띤 아미노산 잔기가 있는 다가 금속 이온 킬레이트, 펩타이드 사이의 다리 역할을 하여 네트워크 하이드로겔을 형성합니다. (3) 용매 교환: 소수성 펩타이드는 처음에 비극성 유기 용매에 용해된 후 극성 수성 환경으로 전환될 때 하이드로겔로 자체 조립을 유도합니다. 이러한 방법은 기존의 실험 절차를 활용하여 펩타이드가 하이드로겔로 자체 조립되는 것을 용이하게 합니다. 특정 겔화 유도 조건에 맞게 펩타이드 염기서열을 설계함으로써 미세하게 조정된 미세/나노 구조 및 생물학적 기능을 달성할 수 있으며, 이는 생물의학 영역에서 펩타이드 하이드로겔의 상당한 잠재력을 강조합니다.

서문

펩타이드 염기서열의 설계를 통해 펩타이드 간의 비공유 상호작용은 자기 조립을 유도하여 나노튜브, 나노리본, 나노섬유 및 구형 구조를 포함한 정렬된 마이크로미터 및 나노미터 구조의 형성으로 이어집니다¹. 마이크로 및 나노미터 섬유/리본으로 자체 조립될 때 이러한 구조는 거시적으로 하이드로겔 특성을 나타냅니다. 펩타이드 자가 조립 하이드로겔은 비공유 상호작용을 통해 자체 조립되고, 겔 형태가 가역적이며, 용액과 겔 상 사이를 전환하기 위해 특정 조건에 즉시 반응한다는 점에서 폴리머 하이드로겔과 다릅니다². 예를 들어, 방향족 아미노산 펩타이드는 용매 전환 ^3,4,5를 기반으로 젤라틴화되도록 유도할 수 있고, RADA16 펩타이드는 양이온 및 음이온 정전기 상호 작용⁶을 통해 겔을 형성하며, E1Y9 펩타이드는 Ca²⁺ 이온 7을 통해 하이드로겔을 형성하도록 유도될 수^있습니다. 천연 아미노산은 인체에서 대사될 수 있으며 폴리머 하이드로겔이 달성할 수 없는 우수한 생체 적합성을 제공합니다⁸. 단백질은 생물학적 기능을 수행하는 분자이며, 펩타이드 서열의 차이는 특정 생물학적 기능을 생성합니다. 따라서 특정 생체 기능 펩타이드 서열을 내장하고 자체 조립 특성을 부여하면 고유한 생물학적 기능 및 형태를 가진 펩타이드 자체 조립 하이드로겔을 설계할 수 있습니다 ^9,10,11. 이 기사에서는 펩타이드 하이드로겔을 제조하는 세 가지 방법을 소개하며, 겔화 과정은 환경 반응에 의해 촉발됩니다. 또한 펩타이드 하이드로겔의 기계적 특성과 형태를 특성화하는 방법에 대해서도 간략하게 설명합니다.

pH는 아미노산의 전하를 조절하여 일부 펩타이드의 겔화를 유발합니다. 예를 들어, 양전하를 띤 아미노산(예: 아르기닌, 라이신, 히스티딘)은 pH에 의해 조절되어 양성 또는 중성 상태에 도달합니다. 음전하를 띤 아미노산은 pH에 의해 조절되어 음수 또는 중성 상태를 달성하고 등전점에서 멀어짐으로써 수용액에서 친수성을 변경합니다. 따라서 펩타이드 사이의 정전기 및 소수성 상호 작용을 제어하면 질서 있는 자체 조립을 용이하게 할 수 있습니다. Zhang et al.은 in vitro 및 in vivo 모두에서 약산성 환경에 반응하여 졸에서 겔로의 상전이를 가능하게 하는 양친매성 pH 반응성 자가 조립 펩타이드인 메토트렉세이트 결합 KKFKFEFEF를 설계했습니다. 이는 효율적인 세포 흡수 및 세포내이입(endocytosis)으로 이어져 항암제를 전달하고 화학요법 효과를 향상시킵니다¹². Shen et ^al.13 은 pH 9.4 이상에서 섬유로 쉽게 자체 조립되는 FF8(KRRFFRRK) 펩타이드를 설계했습니다. 중성 조건에서 미생물은 음전하를 띤 인지질막과의 정전기 상호 작용으로 인해 양전하를 중화하고 인지질 분자와 협력하여 자가 조립하여 막 파열을 일으키고 살균 효과를 향상시킵니다¹³.

배위 금속을 사용하여 펩타이드 초분자 자가 조립을 하이드로겔로 트리거하는 것은 비교적 드문 방법이다¹⁴. 금속 이온이 펩타이드와 정전기로 상호 작용할 때 펩타이드 분자를 연결하는 소금 다리를 형성하여 비공유 상호 작용 및 자체 조립을 일으켜 겔화 특성을 생성합니다. 예를 들어, Abul-Haija et ^al.15 은 구리 이온을 첨가하면 액체에서 하이드로겔로 전환되는 트리펩타이드 FFD를 설계했습니다. Tao et ^al.16 은 글루탐산과 페닐알라닌이 풍부한 펩타이드 E3F3를 개발했는데, 이 펩타이드는 아연 이온이 있는 상태에서 섬유질 하이드로겔로 자가 조립되어 전립선 약물 전달에 사용됩니다.

펩타이드 하이드로겔의 용매 교환 형성은 가장 일반적인 초분자 자기 조립 유발 조건입니다. 소수성 펩타이드가 유기 용매에 용해된 후, 소수성 펩타이드는 완전히 노출됩니다. 수성상으로 이동하면 소수성 그룹이 서로 접근하고 물 분자는 펩타이드 수소 결합의 형성을 촉진하여 빠른 자기 조립과 하이드로겔의 쉬운 형성을 가능하게 합니다. 예를 들어, Zhang et ^al.17 은 극성 유기 용매에 고농도로 안정적으로 용해될 수 있는 펩타이드를 설계했으며, 물로 희석하면 β장 구조로 자체 조립하여 펩타이드 섬유 하이드로겔을 형성할 수 있습니다. Shen et ^al.13 은 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 미리 용해된 후 수성상에 주입하여 환원성 하이드로겔을 형성하고, 허혈 재관류에 의해 생성된 활성 산소 종의 표적 제거에 사용되며, 이는 이후 소거 후 용액으로 분해되었습니다.

이 연구는 이전 경험을 바탕으로 간단하고 빠르며 일반화 가능한 세 가지 펩타이드 하이드로겔 제조 전략을 선택했습니다: (1) pH 반응 방법: 펩타이드를 등전점에서 멀리 떨어진 pH를 가진 용액에 용해시킨 다음 pH를 등전점 근처로 조정합니다. 이러한 변화를 통해 특정 자체 조립 펩타이드가 섬유를 형성하고 펩타이드 하이드로겔을 생성할 수 있습니다. (2) 금속 이온 첨가 방법: 배위 양이온을 수용성, 음전하를 띤 자체 조립 펩타이드에 첨가합니다. 펩티드 사이의 금속 배위 킬레이트화는 하이드로겔로의 자체 조립으로 이어집니다. (3) 용매 교환 방법 : 고농도 펩타이드를 유기 용매에 용해시킨 후 수성상으로 희석하여 겔화 거동을 유도합니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 플라스미드, 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 Table of Materials에 나열되어 있습니다.

1. pH 반응 방법

1. 5μL의 탈이온수에 ECF-5 펩타이드 400mg을 첨가합니다. 40kHz에서 30분 동안 초음파 처리하고 잘 섞습니다.
2. 40μL의 수산화나트륨(1M, 0.22μm 필터를 통해 여과)을 펩타이드 용액에 추가합니다. 소용돌이치고 철저히 섞는다. 용액이 완전히 명확해질 때까지 15 분 동안 초음파 처리를 계속하십시오.
3. 60μL의 염산을 추가합니다. 빠르게 소용돌이치고 철저한 혼합을 보장합니다. 하이드로겔 형성을 용이하게 하기 위해 혼합물을 실온에서 30분 이상 방치하십시오.
   알림: 필요한 경우 탈이온수를 원하는 완충 용액으로 교체하십시오. 고체 입자가 크면 미리 분쇄하십시오. 액체에서 균일 한 입자 혼합물을 얻기 위해 초음파 처리합니다. 펩타이드가 알칼리성 조건에 내성이 없는 경우 먼저 1M 염산 용액을 추가하고 위의 단계를 반복합니다. 등전점 또는 원하는 pH 근처에 도달하기 위해 필요에 따라 산과 염기의 양을 조정하여 겔 형성 특성이 유지되도록 합니다.

2. 금속 이온 첨가 방법

1. 재료의 준비
   1. pH 7.4에서 0.15M의 Tris와 0.1M의 NaCl 완충액을 준비합니다. 0.22μm 필터를 통과시켜 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
   2. 5단계에서 준비한 완충액을 사용하여 10mg/mL 농도의 ECF-1.1.1 자가 조립 펩타이드 용액을 준비합니다. 초음파 처리로 용해시키고 4 °C에서 보관하십시오.
   3. 탈이온수를 사용하여 50mg/mL 염화칼슘 용액을 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
2. 금속 이온 첨가로 인한 펩타이드 하이드로겔 형성
   1. 40μL의 ECF-5 펩타이드 용액에 460μL의 염화칼슘 용액을 추가합니다. 소용돌이치고 철저히 섞는다. 혼합물을 실온에서 2시간 이상 방치하십시오.
      알림: 인산염 완충액은 칼슘 이온 침전으로 이어질 수 있으므로 사용하지 마십시오.

3. 용매 교환 방법

1. 재료 준비
   1. ECF-5 펩타이드 동결건조 분말 10mg의 무게를 잰다. 100μL의 DMSO에 첨가합니다. 초음파를 사용하여 철저히 혼합하고 4 ° C에서 보관하십시오.
   2. 10mM의 PBS 완충 용액을 준비합니다. 여과하고 살균하십시오. 4 °C에서 보관하고 1주일 이내에 사용하십시오.
2. 용매 유도 펩타이드 하이드로겔 형성
   1. 1mL의 PBS를 DMSO 용해화 펩타이드에 빠르게 주입합니다. 소용돌이치고 철저히 섞는다. 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오.
   2. 500μL의 PBS를 추가하고 15분 동안 그대로 두었다가 상층액을 버리고 하단 젤을 유지합니다. 이 프로세스를 세 번 반복하여 DMSO를 제거합니다.
      참고: DMSO가 후속 실험에 영향을 미치는 경우, 영향을 최소화하기 위해 펩타이드를 더 높은 농도의 DMSO에 용해시키는 것을 고려하십시오.

4. 하이드로겔의 유변역학적 특성 분석

1. 유변학적 분석
   1. 하이드로겔을 25mm 알루미늄 평행판에 숟가락으로 떠서 올립니다. 레오미터¹⁸을 사용하여 펩타이드 하이드로겔의 동적 시간 스윕 유변학적 분석을 수행합니다.
2. 고유진동수 및 변형률 스윕 해석
   1. 0.3%의 제어된 변형률과 10rad/s의 주파수를 사용하여 주파수 및 변형률 스윕 분석(¹⁸ )을 체계적으로 수행합니다. 온도 제어가 25°C로 설정되어 있는지 확인하십시오.

5. 섬유 형태의 원자력 현미경(AFM) 특성화

1. 재료 준비
   1. 95 % 에탄올 용액을 준비하고 5 % APTES를 첨가하십시오. -20 °C에서 보관하고 1개월 이내에 사용하십시오.
   2. 운모 층을 제거하기 위해 양면 접착제를 도포합니다. APTES 용액을 사용하여 운모 표면을 부착하고 5분 동안 그대로 두십시오. 사용하기 전에 순수한 물로 철저히 헹굽니다.
   3. 하이드로겔을 희석하고 철저히 섞는다. 변형된 운모 표면에 떨어뜨리고 5분 동안 정적 흡착을 허용합니다. 사용하기 전에 순수한 물로 표면을 헹구고 건조시키십시오.
2. 검출 방법
   1. 스캐너가 장착된 다중 모드 AFM을 사용하여 펩타이드 섬유 또는 하이드로겔 형태를 검사할 수 있습니다. 공칭 스프링 상수가 48N/m인 실리콘 캔틸레버를 사용하십시오.
   2. 바늘의 위치를 지정하도록 기기를 초기화합니다. 태핑 모드를 선택하여 샘플을 스캔하여 이미지를 획득합니다.

결과

이 기사에서 설명하는 펩타이드 하이드로겔을 제조하는 세 가지 방법을 사용하면 빠르고 저렴하며 간단한 생산이 가능합니다. 하이드로겔의 기능은 펩타이드 서열과 관련이 있습니다. 여기서, ECF-5 펩타이드는 미세한 형태 및 기계적 특성을 포함한 물리적 특성을 입증하기 위한 대표적인 예로 사용됩니다.

그림 1A 및 보충...

토론

지난 수십 년 동안 아밀로이드 단백질에서 유래한 자가 조립 펩타이드 서열의 발견 이후, 수많은 자가 조립 펩타이드가 그 특성을 기반으로 설계되어 생물 의학 및 재료 과학 분야의 응용 분야에 대한 상당한 잠재력을 입증했습니다¹⁹. 펩타이드 하이드로겔은 조직 배양, 약물 전달 및 종양 치료에서 고유한 생체 기능화 능력을 보여주었습니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyl)triethoxysilane	Aladdin	A107147	/
Atomic Force Microscopy	Bruker	Multimode Nanoscope VIII	/
CaCl2	Aladdin	C290953	/
Diphenylalanine (FF)	Chinesepeptide	customizable	Purity > 95%
DMSO	Sigma-aldrich	34869	/
ECF-5 Peptides	Chinesepeptide	sequence: ECAFF	Purity > 95%
Hydrochloric Acid	Aladdin	H399657	/
Mica	Sigma-aldrich	AFM-71856-02	/
Phosphate Buffered Saline	Aladdin	P492453	/
Rheometer	Anton Paar GmbH	MCR302	/
Silicon Cantilevers	MikroMasch	XSC11	/
Sodium Chloride	Aladdin	C111549	/
Sodium Hydroxide	Aladdin	S140903	/
TRIS Hydrochloride	Aladdin	T431531	/