Mekanik Olarak Kararlı Kendinden Montajlı Peptitler Hidrojellerin Hazırlanması

Özet

Bu protokol, peptitlerin hidrojellere kendi kendine montajını tetiklemek için çevresel koşulları kullanan üç hızlı ve basit hazırlama yöntemi sunar. Ek olarak, peptit hidrojellerinin karakterizasyonu açıklanmış olup, bu basit koşullar altında mekanik olarak kararlı peptit hidrojellerin oluşturulabileceğini göstermektedir.

Özet

Peptit hidrojeller, nanoliflerin veya polimerlerin kendi kendine bir araya gelmesiyle oluşan ve su kilitleme ağları oluşturan oldukça hidrofilik, üç boyutlu ağ jelleridir. Morfolojileri, hücre dışı matrisinkine çok benzer ve hem peptitlerin biyolojik işlevlerini hem de duyarlı jelleşme özelliklerini sergilemelerine izin verir. Bu benzersiz özellikler, doku mühendisliği, üç boyutlu hücre kültürü, kanser tedavisi, rejeneratif tıp ve diğer biyomedikal alanlarda kapsamlı uygulamalarına yol açmıştır. Bu makale, çevreye duyarlı jelleşme işlemlerine sahip kendi kendine birleşen peptitler kullanılarak ECF-5 peptit hidrojellerinin hazırlanması için üç yöntemi açıklamaktadır: (1) pH'a duyarlı jelleşme: değişen pH seviyeleri, amino asit kalıntılarının protonasyonunu veya protondan arındırılmasını indükler, peptit molekülleri arasındaki elektrostatik etkileşimleri değiştirir ve bunların hidrojellere kendi kendine montajını teşvik eder; (2) Metal iyonu ilavesi: çok değerlikli metal iyonları, bir ağ hidrojeli oluşturmak için peptitler arasında köprü görevi gören negatif yüklü amino asit kalıntıları ile şelat; (3) Çözücü değişimi: hidrofobik peptitler başlangıçta polar olmayan organik çözücüler içinde çözülür ve daha sonra polar sulu bir ortama geçtikten sonra hidrojellere kendi kendine birleşmeyi indükler. Bu yöntemler, peptitin hidrojellere kendi kendine montajını kolaylaştırmak için geleneksel deneysel prosedürleri kullanır. Spesifik jelleşmeyi indükleyen koşullarla uyumlu peptit dizileri tasarlayarak, biyomedikal alanda peptit hidrojellerinin önemli potansiyelini vurgulayarak, ince ayarlanmış mikro/nanoyapılar ve biyolojik işlevler elde etmek mümkündür.

Giriş

Peptit dizilerinin tasarımı sayesinde, peptitler arasındaki kovalent olmayan etkileşimler, nanotüpler, nanoşeritler, nanofiberler ve küresel yapılar dahil olmak üzere sıralı mikro ve nanometre yapılarının oluşumuna yol açarak kendi kendine birleşmeyi indükler¹. Mikro ve nanometre fiberlere/şeritlere kendi kendine monte edildiğinde, bu yapılar makroskopik olarak hidrojel özellikleri sergiler. Peptit kendi kendine birleşen hidrojeller, kovalent olmayan etkileşimler yoluyla kendi kendine bir araya gelmeleri, jel formlarının tersine çevrilebilir olması ve çözelti ile jel fazları² arasında geçiş yapmak için belirli koşullara kolayca yanıt vermeleri bakımından polimer hidrojellerden farklıdır. Örneğin, aromatik amino asit peptitleri, çözücü anahtarlamasına dayalı olarak jelatinleşmeye^{indüklenebilir 3,4,5}, RADA16 peptitleri, katyonik ve anyonik elektrostatik etkileşimler⁶ yoluyla jeller oluşturur ve E1Y9 peptit,^Ca2+ iyonları 7 yoluyla bir hidrojel oluşturmak üzere indüklenir. Doğal amino asitler insan vücudu tarafından metabolize edilebilir ve polimer hidrojellerin elde edemediği bir özellik olan mükemmel biyouyumluluk sunar⁸. Proteinler biyolojik işlevleri yerine getiren moleküllerdir ve peptit dizilerindeki farklılıklar kendi spesifik biyolojik işlevlerini oluşturur. Bu nedenle, spesifik biyofonksiyonel peptit dizilerinin gömülmesi ve bunlara kendi kendine birleşme özelliklerinin kazandırılması, benzersiz biyolojik işlevlere ve morfolojilere sahip peptit kendi kendine birleşen hidrojeller tasarlayabilir ^9,10,11. Bu makale, jelleşme işleminin çevresel duyarlılık ile tetiklendiği peptit hidrojellerin hazırlanması için üç yöntem sunmaktadır. Ayrıca, peptit hidrojellerin mekanik özelliklerini ve morfolojisini karakterize etmek için yöntemleri kısaca tartışır.

PH, amino asitlerin yükünü düzenleyerek bazı peptitlerin jelleşmesini tetikler. Örneğin, pozitif yüklü amino asitler (örneğin, arginin, lizin, histidin), pozitif veya nötr durumlara ulaşmak için pH tarafından düzenlenir. Negatif yüklü amino asitler, negatif veya nötr durumlar elde etmek, izoelektrik noktalarından uzaklaşmak ve böylece sulu çözeltilerde hidrofilikliklerini değiştirmek için pH ile düzenlenir. Bu nedenle, peptitler arasındaki elektrostatik ve hidrofobik etkileşimleri kontrol etmek, sıralı kendi kendine montajlarını kolaylaştırır. Zhang ve ark. hem in vitro hem de in vivo olarak hafif asidik ortamlara yanıt veren ve soldan jele faz geçişi sağlayan amfifilik pH'a duyarlı kendi kendine birleşen bir peptit, metotreksat bağlantılı KKFKFEFEF tasarladı. Bu, verimli hücresel alıma ve endositoza yol açar, böylece anti-kanser ilaçları verir ve kemoterapi etkinliğini artırır¹². Shen ve ^ark.13 , 9.4'ten daha yüksek bir pH'ta liflere kolayca kendi kendine bir araya gelen FF8 (KRRFFRRK) peptidini tasarladı. Nötr koşullar altında, mikroorganizmalar, negatif yüklü fosfolipid zarları ile elektrostatik etkileşimler nedeniyle pozitif yüklerini nötralize eder, fosfolipid molekülleri ile kendi kendine birleşmek için koordine eder, zar yırtılmasına neden olur ve bakterisidal etkileri arttırır¹³.

Koordinasyon metalleri kullanılarak peptit supramoleküler kendi kendine montajın hidrojellere tetiklenmesi nispeten nadir bir yöntemdir¹⁴. Metal iyonları peptitlerle elektrostatik olarak etkileşime girdiğinde, peptit moleküllerini birbirine bağlayan tuz köprüleri oluştururlar, bu da kovalent olmayan etkileşimlere ve kendi kendine birleşmeye yol açar, bu da jelleşme özelliklerine neden olur. Örneğin, Abul-Haija ve ^ark.15 , bakır iyonlarının eklenmesiyle bir sıvıdan bir hidrojele geçiş yapan tripeptit FFD'yi tasarladı. Tao ve ^ark.16 , çinko iyonlarının varlığında fibröz hidrojeller halinde kendi kendine birleşen ve prostat ilaç dağıtımı için kullanılan glutamik asit ve fenilalanin açısından zengin peptit E3F3'ü geliştirdi.

Peptit hidrojellerin çözücü değişimi oluşumu, en yaygın supramoleküler kendi kendine toplanma tetikleme koşuludur. Hidrofobik peptitler organik çözücüler içinde çözündükten sonra, hidrofobik grupları tamamen açığa çıkar. Sulu bir faza aktarıldığında, hidrofobik gruplar birbirine yaklaşır ve su molekülleri, peptit hidrojen bağlarının oluşumunu kolaylaştırır, bu da hızlı kendi kendine toplanmaya ve hidrojellerin kolay oluşumuna yol açar. Örneğin, Zhang ve ^ark.17 , polar organik çözücülerde yüksek konsantrasyonlarda stabil bir şekilde çözünebilen ve su ile seyreltildikten sonra, peptit lifi hidrojelleri oluşturmak için β tabakalı yapılara kendi kendine monte edilebilen bir peptit tasarladı. Shen ve ^ark.13 , dimetil sülfoksit (DMSO) içinde önceden çözündürülmüş ve daha sonra indirgeyici bir hidrojel oluşturmak üzere sulu bir faza enjekte edilmiş, iskemi-reperfüzyon tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinin hedefli olarak uzaklaştırılması için kullanılan ve daha sonra süpürme işleminden sonra bir çözeltiye indirgenen indirgeyici bir peptit ECF-5 (ECAFF) tasarladı.

Bu çalışma, önceki deneyimlere dayalı olarak üç basit, hızlı ve oldukça genelleştirilebilir peptit hidrojel hazırlama stratejisi seçmiştir: (1) pH yanıt yöntemi: peptitler, izoelektrik noktalarından uzak bir pH'a sahip bir çözelti içinde çözülür ve daha sonra pH, izoelektrik noktaya yakın olacak şekilde ayarlanır. Bu değişiklik, kendi kendine birleşen belirli peptitlerin lifler oluşturmasına ve peptit hidrojelleri oluşturmasına izin verir; (2) Metal iyonu ekleme yöntemi: koordinasyon katyonları, suda çözünür, negatif yüklü kendi kendine birleşen peptitlere eklenir. Peptitler arasındaki metal koordinasyon şelasyonu, hidrojellere kendi kendine montajlarına yol açar; (3) Çözücü değiştirme yöntemi: yüksek konsantrasyonlu peptitler organik çözücüler içinde çözülür ve daha sonra jelleşme davranışına neden olarak sulu bir faza seyreltilir.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan plazmitlerin, reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. pH yanıt yöntemi

1. 400 μL deiyonize suya 5 mg ECF-5 peptit ekleyin. 30 dakika boyunca 40 kHz'de sonikat ve iyice karıştırın.
2. Peptit çözeltisine 40 μL sodyum hidroksit (1 M, 0.22 μm'lik bir filtreden süzülmüş) ekleyin. Girdap yapın ve iyice karıştırın. Çözelti tamamen netleşene kadar 15 dakika boyunca sonikasyona devam edin.
3. 60 μL hidroklorik asit ekleyin. Hızlıca girdap yapın ve iyice karıştırdığınızdan emin olun. Hidrojel oluşumunu kolaylaştırmak için karışımın oda sıcaklığında 30 dakikadan fazla beklemesine izin verin.
   NOT: Gerekirse deiyonize suyu istenen tampon çözeltisiyle değiştirin. Katı parçacıklar büyükse, bunları önceden toz haline getirin. Sıvıda homojen bir parçacık karışımı elde etmek için sonikat. Peptit alkali koşullara toleranssızsa, önce 1 M hidroklorik asit çözeltisi ekleyin ve yukarıdaki adımları tekrarlayın. Jel oluşturma özelliklerinin korunduğundan emin olarak, izoelektrik noktaya veya istenen pH'a ulaşmak için asit ve baz miktarlarını gerektiği gibi ayarlayın.

2. Metal iyon ekleme yöntemi

1. Malzemenin hazırlanması
   1. pH 7.4'te 0.15 M Tris ve 0.1 M NaCl tamponu hazırlayın. 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin ve 4 °C'de bir haftaya kadar saklayın.
   2. Adım 1.1.1'de hazırlanan tamponu kullanarak 10 mg / mL'lik bir konsantrasyonda bir ECF-5 kendiliğinden birleşen peptit çözeltisi hazırlayın. Sonikasyon ile çözün ve 4 ° C'de saklayın.
   3. Deiyonize su kullanarak 50 mg / mL'lik bir kalsiyum klorür çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
2. Metal iyonu ilavesine bağlı peptit hidrojel oluşumu
   1. 460 μL ECF-5 peptit çözeltisine 40 μL kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin. Girdap yapın ve iyice karıştırın. Karışımın oda sıcaklığında 2 saatten fazla bekletilmesine izin verin.
      NOT: Kalsiyum iyonu çökelmesine yol açabileceğinden fosfat tamponu kullanmaktan kaçının.

3. Solvent değişim yöntemi

1. Malzemelerin hazırlanması
   1. 10 mg ECF-5 peptit liyofilize toz tartın. 100 μL DMSO'ya ekleyin. Ultrasonication kullanarak iyice karıştırın ve 4 ° C'de saklayın.
   2. 10 mM'lik bir PBS tampon çözeltisi hazırlayın. Süzün ve sterilize edin. 4 °C'de saklayın ve 1 hafta içinde kullanın.
2. Solvent kaynaklı peptit hidrojel oluşumu
   1. DMSO ile çözünmüş peptide hızlı bir şekilde 1 mL PBS ekleyin. Girdap yapın ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
   2. 500 μL PBS ekleyin, 15 dakika bekletin, süpernatanı atın ve alt jeli tutun. DMSO'yu kaldırmak için bu işlemi üç kez tekrarlayın.
      NOT: DMSO sonraki deneyleri etkilerse, etkisini en aza indirmek için peptidi daha yüksek bir DMSO konsantrasyonunda çözmeyi düşünün.

4. Hidrojelin reomekanik karakterizasyonu

1. Reolojik analiz
   1. Hidrojeli 25 mm'lik bir alüminyum paralel plakaya dökün. Bir reometre¹⁸ kullanarak peptit hidrojellerinin dinamik zaman süpürme reolojik analizini gerçekleştirin.
2. Frekans ve gerinim süpürme analizleri
   1. Frekans ve gerinim tarama analizlerini¹⁸ %0,3'lük kontrollü bir gerinim ve 10 rad/s'lik bir frekans kullanarak sistematik olarak gerçekleştirin. Sıcaklık kontrolünün 25 °C'ye ayarlandığından emin olun.

5. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) lif morfolojisinin karakterizasyonu

1. Malzemelerin hazırlanması
   1. % 95 etanol çözeltisi hazırlayın ve% 5 APTES ekleyin. -20 °C'de saklayın ve 1 ay içinde kullanın.
   2. Bir mika tabakasını çıkarmak için çift taraflı yapıştırıcı uygulayın. Mika yüzeyleri APTES solüsyonu kullanarak yapıştırın ve 5 dakika bekletin. Kullanmadan önce saf su ile iyice durulayın.
   3. Hidrojeli seyreltin ve iyice karıştırın. Modifiye edilmiş mika yüzeyine bırakın ve 5 dakika boyunca statik adsorpsiyona izin verin. Yüzeyi saf suyla durulayın ve kullanmadan önce kurulayın.
2. Algılama yöntemi
   1. Peptit lifi veya hidrojel morfolojilerini incelemek için bir tarayıcı ile donatılmış çok modlu bir AFM kullanın. Nominal yay sabiti 48 N/m olan silikon konsollar kullanın.
   2. İğneyi konumlandırmak için cihazı başlatın. Görüntüleri elde etmek üzere örneği taramak için dokunma modunu seçin.

Sonuçlar

Peptit hidrojelleri hazırlamak için bu makalede açıklanan üç yöntem, hızlı, uygun fiyatlı ve basit üretim sağlar. Hidrojelin işlevi, peptit dizisi ile ilgilidir. Burada, ECF-5 peptidi, mikroskobik morfoloji ve mekanik özellikler dahil olmak üzere fiziksel özelliklerini göstermek için temsili bir örnek olarak kullanılır.

Şekil 1A ve Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, ECF-5 peptidi, glutatyonu...

Tartışmalar

Son birkaç on yılda, amiloid proteinlerinden türetilen kendi kendine birleşen peptit dizilerinin keşfini takiben, özelliklerine dayalı olarak çok sayıda kendi kendine birleşen peptit tasarlanmıştır ve bu da biyotıp ve malzeme bilimindeki uygulamalar için önemli bir potansiyel göstermiştir¹⁹. Peptit hidrojeller, doku kültüründe, ilaç dağıtımında ve tümör tedavisinde benzersiz biyo-işlevselleştirme yetenekleri sergilemiştir

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyl)triethoxysilane	Aladdin	A107147	/
Atomic Force Microscopy	Bruker	Multimode Nanoscope VIII	/
CaCl2	Aladdin	C290953	/
Diphenylalanine (FF)	Chinesepeptide	customizable	Purity > 95%
DMSO	Sigma-aldrich	34869	/
ECF-5 Peptides	Chinesepeptide	sequence: ECAFF	Purity > 95%
Hydrochloric Acid	Aladdin	H399657	/
Mica	Sigma-aldrich	AFM-71856-02	/
Phosphate Buffered Saline	Aladdin	P492453	/
Rheometer	Anton Paar GmbH	MCR302	/
Silicon Cantilevers	MikroMasch	XSC11	/
Sodium Chloride	Aladdin	C111549	/
Sodium Hydroxide	Aladdin	S140903	/
TRIS Hydrochloride	Aladdin	T431531	/