Herstellung von mechanisch stabilen selbstorganisierten Peptiden, Hydrogelen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt drei schnelle und einfache Präparationsmethoden vor, die Umweltbedingungen nutzen, um die Selbstorganisation von Peptiden zu Hydrogelen auszulösen. Zusätzlich wird die Charakterisierung von Peptidhydrogelen beschrieben, die zeigt, dass unter diesen einfachen Bedingungen mechanisch stabile Peptidhydrogele gebildet werden können.

Zusammenfassung

Peptid-Hydrogele sind hochgradig hydrophile, dreidimensionale Netzwerkgele, die durch die Selbstorganisation von Nanofasern oder Polymeren gebildet werden, wodurch wasserschließende Netzwerke entstehen. Ihre Morphologie ähnelt stark der der extrazellulären Matrix, so dass sie sowohl die biologischen Funktionen von Peptiden als auch reaktionsfähige Gelierungseigenschaften aufweisen können. Diese einzigartigen Eigenschaften haben zu ihrer umfangreichen Anwendung im Tissue Engineering, in der dreidimensionalen Zellkultur, in der Krebstherapie, in der regenerativen Medizin und in anderen biomedizinischen Bereichen geführt. In diesem Artikel werden drei Methoden zur Herstellung von ECF-5-Peptid-Hydrogelen unter Verwendung von selbstorganisierenden Peptiden mit umweltverträglichen Gelierungsprozessen beschrieben: (1) pH-responsive Gelierung: Unterschiedliche pH-Werte induzieren die Protonierung oder Deprotonierung von Aminosäureresten, verändern die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen Peptidmolekülen und fördern deren Selbstorganisation zu Hydrogelen; (2) Metallionenaddition: polyvalente Metallionen chelatisieren mit negativ geladenen Aminosäureresten, die als Brücken zwischen Peptiden wirken, um ein Netzwerkhydrogel zu bilden; (3) Lösungsmittelaustausch: Hydrophobe Peptide werden zunächst in unpolaren organischen Lösungsmitteln gelöst und induzieren anschließend beim Übergang in eine polare wässrige Umgebung eine Selbstorganisation zu Hydrogelen. Diese Methoden nutzen konventionelle experimentelle Verfahren, um die Selbstorganisation von Peptiden in Hydrogelen zu erleichtern. Durch das Design von Peptidsequenzen, die sich an spezifischen Gelierungs-induzierenden Bedingungen ausrichten, ist es möglich, fein abgestimmte Mikro-/Nanostrukturen und biologische Funktionen zu erzielen, was das bedeutende Potenzial von Peptid-Hydrogelen im biomedizinischen Bereich unterstreicht.

Einleitung

Durch das Design von Peptidsequenzen induzieren nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen Peptiden eine Selbstorganisation, die zur Bildung geordneter Mikro- und Nanometerstrukturen führt, einschließlich Nanoröhren, Nanobändern, Nanofasern und kugelförmigen Strukturen¹. Wenn sie selbst zu Mikro- und Nanometerfasern/-bändern zusammengefügt werden, weisen diese Strukturen makroskopisch Hydrogel-Eigenschaften auf. Peptid-selbstorganisierende Hydrogele unterscheiden sich von Polymer-Hydrogelen dadurch, dass sie sich durch nicht-kovalente Wechselwirkungen selbst organisieren, ihre Gelform reversibel ist und sie leicht auf bestimmte Bedingungen reagieren, um zwischen Lösungs- und Gelphase^{zu wechseln 2}. Zum Beispiel können aromatische Aminosäurepeptide dazu gebracht werden, auf der Grundlage von Lösungsmittelschaltung ^3,4,5 zu verkleisteren, RADA16-Peptide bilden Gele durch kationische und anionische elektrostatische Wechselwirkungen⁶ und E1Y9-Peptid wird über^Ca-2+-Ionen⁷ zur Bildung eines Hydrogels induziert. Natürliche Aminosäuren können vom menschlichen Körper verstoffwechselt werden und bieten eine hervorragende Biokompatibilität, eine Eigenschaft, die Polymer-Hydrogele nicht erreichen können⁸. Proteine sind die Moleküle, die biologische Funktionen ausführen, und Unterschiede in den Peptidsequenzen erzeugen ihre spezifischen biologischen Funktionen. Daher können durch die Einbettung spezifischer biofunktioneller Peptidsequenzen und deren Ausstattung mit selbstorganisierenden Eigenschaften peptidselbstorganisierende Hydrogele mit einzigartigen biologischen Funktionen und Morphologien entworfen werden ^9,10,11. In diesem Artikel werden drei Methoden zur Herstellung von Peptid-Hydrogelen vorgestellt, bei denen der Gelierungsprozess durch die Reaktionsfähigkeit der Umwelt ausgelöst wird. Es werden auch kurz Methoden zur Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften und der Morphologie von Peptidhydrogelen diskutiert.

Der pH-Wert reguliert die Ladung von Aminosäuren und löst die Gelierung einiger Peptide aus. Zum Beispiel werden positiv geladene Aminosäuren (z. B. Arginin, Lysin, Histidin) durch den pH-Wert reguliert, um positive oder neutrale Zustände zu erreichen. Negativ geladene Aminosäuren werden durch den pH-Wert reguliert, um negative oder neutrale Zustände zu erreichen, sich von ihrem isoelektrischen Punkt zu entfernen und dadurch ihre Hydrophilie in wässrigen Lösungen zu verändern. Daher erleichtert die Kontrolle elektrostatischer und hydrophober Wechselwirkungen zwischen Peptiden deren geordnete Selbstorganisation. Zhang et al. entwarfen ein amphiphiles, pH-responsives, selbstorganisierendes Peptid, das Methotrexat-gekoppelte KKFKFEFEF, das sowohl in vitro als auch in vivo auf leicht saure Umgebungen reagiert und einen Phasenübergang von Sol zu Gel ermöglicht. Dies führt zu einer effizienten zellulären Aufnahme und Endozytose, wodurch Krebsmedikamente verabreicht und die Wirksamkeit der Chemotherapie verbessert^{werden 12}. Shen et ^al.13 entwarfen das FF8 (KRRFFRRK)-Peptid, das sich bei einem pH-Wert von mehr als 9,4 leicht selbst zu Fasern zusammensetzt. Unter neutralen Bedingungen neutralisieren Mikroorganismen ihre positiven Ladungen aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen mit ihren negativ geladenen Phospholipidmembranen und koordinieren sich mit den Phospholipidmolekülen, um sich selbst zu organisieren, was zu einem Membranbruch führt und die bakterizide Wirkung verstärkt¹³.

Das Auslösen der supramolekularen Selbstorganisation von Peptiden zu Hydrogelen unter Verwendung von Koordinationsmetallen ist eine relativ seltene Methode¹⁴. Wenn Metallionen elektrostatisch mit Peptiden wechselwirken, bilden sie Salzbrücken, die Peptidmoleküle verbinden, was zu nicht-kovalenten Wechselwirkungen und Selbstorganisation führt, was zu Gelierungseigenschaften führt. Zum Beispiel entwarfen Abul-Haija et ^al.15 das Tripeptid FFD, das durch Zugabe von Kupferionen von einer Flüssigkeit in ein Hydrogel übergeht. Tao et ^al.16 entwickelten das Glutaminsäure- und Phenylalanin-reiche Peptid E3F3, das sich in Gegenwart von Zinkionen selbst zu faserigen Hydrogelen zusammensetzt und für die Verabreichung von Prostatamedikamenten verwendet wird.

Die Bildung von Lösungsmittelaustauschern in Peptidhydrogelen ist die häufigste supramolekulare Selbstorganisationsauslösung. Nachdem sich hydrophobe Peptide in organischen Lösungsmitteln aufgelöst haben, sind ihre hydrophoben Gruppen vollständig freigelegt. Wenn sie in eine wässrige Phase überführt werden, nähern sich die hydrophoben Gruppen einander an, und Wassermoleküle erleichtern die Bildung von Peptid-Wasserstoffbrückenbindungen, was zu einer schnellen Selbstorganisation und einer einfachen Bildung von Hydrogelen führt. Zum Beispiel entwarfen Zhang et ^al.17 ein Peptid, das sich bei hohen Konzentrationen in polaren organischen Lösungsmitteln stabil auflösen und sich nach Verdünnung mit Wasser selbst zu β-Faltblatt-Strukturen zusammenfügt, um Peptidfaser-Hydrogele zu bilden. Shen et ^{al.13 entwarfen} ein reduktives Peptid ECF-5 (ECAFF), das in Dimethylsulfoxid (DMSO) vorgelöst und dann in eine wässrige Phase injiziert wurde, um ein reduktives Hydrogel zu bilden, das zur gezielten Entfernung von reaktiven Sauerstoffspezies verwendet wird, die durch Ischämie-Reperfusion produziert werden und anschließend nach dem Abfangen zu einer Lösung abgebaut werden.

In dieser Studie wurden drei einfache, schnelle und hochgradig verallgemeinerbare Peptid-Hydrogel-Zubereitungsstrategien ausgewählt, die auf früheren Erfahrungen basieren: (1) pH-Reaktionsmethode: Peptide werden in einer Lösung mit einem pH-Wert gelöst, der weit von ihrem isoelektrischen Punkt entfernt ist, und dann wird der pH-Wert auf nahe dem isoelektrischen Punkt eingestellt. Diese Veränderung ermöglicht es bestimmten selbstorganisierenden Peptiden, Fasern zu bilden und Peptid-Hydrogele zu bilden; (2) Methode der Metallionenaddition: Koordinationskationen werden an wasserlösliche, negativ geladene selbstorganisierende Peptide gegeben. Die Metallkoordinationschelatbildung zwischen Peptiden führt zu deren Selbstorganisation zu Hydrogelen; (3) Lösungsmittelaustauschmethode: Hochkonzentrierte Peptide werden in organischen Lösungsmitteln gelöst und dann in eine wässrige Phase verdünnt, wodurch ein Gelierungsverhalten induziert wird.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Plasmiden, Reagenzien und Geräten, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Methode der pH-Reaktion

1. Fügen Sie 5 mg ECF-5-Peptide zu 400 μl deionisiertem Wasser hinzu. 30 min lang bei 40 kHz beschallen und gründlich mischen.
2. Geben Sie 40 μl Natriumhydroxid (1 M, filtriert durch einen 0,22 μm-Filter) in die Peptidlösung. Vortexen und gründlich mischen. Setzen Sie die Beschallung 15 Minuten lang fort, bis die Lösung vollständig geklärt ist.
3. 60 μl Salzsäure zugeben. Schnell vortexen und gründlich mischen. Lassen Sie die Mischung über 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um die Hydrogelbildung zu erleichtern.
   HINWEIS: Ersetzen Sie bei Bedarf deionisiertes Wasser durch die gewünschte Pufferlösung. Wenn feste Partikel groß sind, pulverisieren Sie sie vorher. Beschallung, um eine homogene Partikelmischung in der Flüssigkeit zu erreichen. Wenn das Peptid alkalische Bedingungen nicht verträgt, fügen Sie zuerst 1 M Salzsäurelösung hinzu und wiederholen Sie die obigen Schritte. Passen Sie die Mengen an Säure und Base nach Bedarf an, um sie in die Nähe des isoelektrischen Punktes oder des gewünschten pH-Werts zu bringen, um sicherzustellen, dass die gelbildenden Eigenschaften erhalten bleiben.

2. Methode der Zugabe von Metallionen

1. Vorbereitung des Materials
   1. Bereiten Sie 0,15 M Tris und 0,1 M NaCl-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4 vor. Durch einen 0,22 μm Filter filtrieren und bis zu einer Woche bei 4 °C lagern.
   2. Eine selbstorganisierende ECF-5-Peptidlösung in einer Konzentration von 10 mg/ml wird unter Verwendung des in Schritt 1.1.1 hergestellten Puffers hergestellt. Durch Beschallung auflösen und bei 4 °C lagern.
   3. Bereiten Sie eine 50 mg/ml Calciumchloridlösung mit entionisiertem Wasser vor. Bei 4 °C lagern.
2. Durch Metallionenaddition induzierte Peptid-Hydrogel-Bildung
   1. Fügen Sie 40 μl Calciumchloridlösung zu 460 μl der ECF-5-Peptidlösung hinzu. Vortexen und gründlich mischen. Lassen Sie die Mischung über 2 h bei Raumtemperatur stehen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Phosphatpuffer, da dies zu einer Ausfällung von Kalziumionen führen kann.

3. Methode des Lösungsmittelaustauschs

1. Vorbereitung der Materialien
   1. Wiegen Sie 10 mg ECF-5 Peptid lyophilisiertes Pulver. Fügen Sie es zu 100 μl DMSO hinzu. Mit Ultraschall gründlich mischen und bei 4 °C lagern.
   2. Bereiten Sie eine 10 mM PBS-Pufferlösung vor. Filtern und sterilisieren. Bei 4 °C lagern und innerhalb von 1 Woche verbrauchen.
2. Lösungsmittelinduzierte Peptid-Hydrogel-Bildung
   1. Führen Sie schnell 1 ml PBS in das DMSO-solubilisierte Peptid ein. Vortexen und gründlich mischen. 5 min bei Raumtemperatur ziehen lassen.
   2. Fügen Sie 500 μl PBS hinzu, lassen Sie es 15 Minuten stehen, verwerfen Sie den Überstand und bewahren Sie das untere Gel auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um DMSO zu entfernen.
      HINWEIS: Wenn DMSO nachfolgende Experimente beeinflusst, sollten Sie erwägen, das Peptid in einer höheren Konzentration von DMSO aufzulösen, um seine Auswirkungen zu minimieren.

4. Rheomechanische Charakterisierung von Hydrogel

1. Rheologische Analyse
   1. Löffeln Sie das Hydrogel auf eine 25 mm parallele Aluminiumplatte. Durchführung einer dynamischen rheologischen Zeit-Sweep-Analyse der Peptid-Hydrogele unter Verwendung eines Rheometers¹⁸.
2. Frequenz- und Dehnungs-Sweep-Analysen
   1. Führen Sie Frequenz- und Dehnungs-Sweep-Analysen¹⁸ systematisch mit einer kontrollierten Dehnung von 0,3 % und einer Frequenz von 10 rad/s durch. Stellen Sie sicher, dass die Temperaturregelung auf 25 °C eingestellt ist.

5. Rasterkraftmikroskopie (AFM) Charakterisierung der Fasermorphologie

1. Vorbereitung der Materialien
   1. Bereiten Sie eine Lösung aus 95 % Ethanol vor und fügen Sie 5 % APTES hinzu. Bei -20 °C lagern und innerhalb von 1 Monat verbrauchen.
   2. Tragen Sie doppelseitigen Klebstoff auf, um eine Glimmerschicht zu entfernen. Die Glimmeroberflächen mit der APTES-Lösung aufkleben und 5 min ziehen lassen. Vor Gebrauch gründlich mit reinem Wasser abspülen.
   3. Verdünnen und mischen Sie das Hydrogel gründlich. Lassen Sie es auf die modifizierte Glimmeroberfläche fallen und lassen Sie es 5 Minuten lang statisch adsorbieren. Spülen Sie die Oberfläche mit reinem Wasser ab und trocknen Sie sie vor dem Gebrauch.
2. Nachweismethode
   1. Verwenden Sie ein Multimode-AFM, das mit einem Scanner ausgestattet ist, um die Morphologien von Peptidfasern oder Hydrogelen zu untersuchen. Verwenden Sie Silizium-Ausleger mit einer Nennfederkonstante von 48 N/m.
   2. Initialisieren Sie das Instrument, um die Nadel zu positionieren. Wählen Sie den Tapping-Modus , um das Sample zu scannen und Bilder aufzunehmen.

Ergebnisse

Die drei in diesem Artikel beschriebenen Methoden zur Herstellung von Peptid-Hydrogelen ermöglichen eine schnelle, kostengünstige und unkomplizierte Produktion. Die Funktion des Hydrogels hängt mit seiner Peptidsequenz zusammen. Hier wird das ECF-5-Peptid als repräsentatives Beispiel verwendet, um seine physikalischen Eigenschaften, einschließlich der mikroskopischen Morphologie und der mechanischen Eigenschaften, zu demonstrieren.

Wie in

Diskussion

In den letzten Jahrzehnten wurden nach der Entdeckung selbstorganisierender Peptidsequenzen, die von Amyloid-Proteinen abgeleitet sind, zahlreiche selbstorganisierende Peptide auf der Grundlage ihrer Eigenschaften entworfen, die ein erhebliches Potenzial für Anwendungen in der Biomedizin und den Materialwissenschaften aufzeigen¹⁹. Peptid-Hydrogele haben einzigartige Biofunktionalisierungsfähigkeiten in der Gewebekultur, bei der Verabreichung von Medikamenten und...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyl)triethoxysilane	Aladdin	A107147	/
Atomic Force Microscopy	Bruker	Multimode Nanoscope VIII	/
CaCl2	Aladdin	C290953	/
Diphenylalanine (FF)	Chinesepeptide	customizable	Purity > 95%
DMSO	Sigma-aldrich	34869	/
ECF-5 Peptides	Chinesepeptide	sequence: ECAFF	Purity > 95%
Hydrochloric Acid	Aladdin	H399657	/
Mica	Sigma-aldrich	AFM-71856-02	/
Phosphate Buffered Saline	Aladdin	P492453	/
Rheometer	Anton Paar GmbH	MCR302	/
Silicon Cantilevers	MikroMasch	XSC11	/
Sodium Chloride	Aladdin	C111549	/
Sodium Hydroxide	Aladdin	S140903	/
TRIS Hydrochloride	Aladdin	T431531	/