הכנת פפטידים הידרוג'לים יציבים מכנית בהרכבה עצמית

Summary

פרוטוקול זה מציג שלוש שיטות הכנה מהירות ופשוטות המשתמשות בתנאי הסביבה כדי להפעיל הרכבה עצמית של פפטידים להידרוג'לים. בנוסף, מתואר אפיון של הידרוג'לים פפטידיים, המדגים כי הידרוג'לים פפטידים יציבים מכנית יכולים להיווצר בתנאים פשוטים אלה.

Abstract

פפטיד הידרוג'ל הם ג'ל רשת תלת מימדי הידרופילי מאוד שנוצר על ידי הרכבה עצמית של ננו-סיבים או פולימרים, ויוצר רשתות נעילת מים. המורפולוגיה שלהם דומה מאוד לזו של המטריצה החוץ תאית, ומאפשרת להם להציג הן את הפונקציות הביולוגיות של הפפטידים והן את תכונות הג'לציה המגיבה. מאפיינים ייחודיים אלה הובילו ליישומם הנרחב בהנדסת רקמות, תרביות תאים תלת מימדיות, טיפול בסרטן, רפואה רגנרטיבית ותחומים ביו-רפואיים אחרים. מאמר זה מתאר שלוש שיטות להכנת הידרוג'ל פפטידי ECF-5 באמצעות פפטידים בהרכבה עצמית עם תהליכי ג'לציה המגיבים לסביבה: (1) ג'לציה המגיבה ל- pH: רמות pH משתנות גורמות לפרוטונציה או דה-פרוטונציה של שאריות חומצות אמינו, משנות אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין מולקולות פפטידים ומעודדות את הרכבתן העצמית להידרוג'לים; (2) תוספת יוני מתכת: כלאט יוני מתכת רב-ערכי עם שאריות חומצות אמינו טעונות שלילית, הפועלים כגשרים בין פפטידים ליצירת הידרוג'ל רשת; (3) חילופי ממסים: פפטידים הידרופוביים מומסים בתחילה בממסים אורגניים שאינם קוטביים ולאחר מכן גורמים להרכבה עצמית להידרוג'לים עם המעבר לסביבה מימית קוטבית. שיטות אלה משתמשות בהליכים ניסיוניים קונבנציונליים כדי להקל על הרכבה עצמית של פפטידים להידרוג'לים. על ידי תכנון רצפי פפטידים כך שיתאימו לתנאים ספציפיים הגורמים לג'לציה, ניתן להשיג מיקרו/ננו-מבנים מכווננים היטב ופונקציות ביולוגיות, תוך הדגשת הפוטנציאל המשמעותי של הידרוג'לים פפטידים בתחום הביו-רפואי.

Introduction

באמצעות תכנון רצפי פפטידים, אינטראקציות לא קוולנטיות, בין פפטידים, גורמות להרכבה עצמית, מה שמוביל להיווצרות מבנים מסודרים של מיקרו וננומטר, כולל ננו-צינורות, ננו-סרטים, ננו-סיבים ומבנים כדוריים¹. כאשר מבנים אלה מורכבים באופן עצמאי לסיבים/סרטים מיקרו-וננומטריים, הם מפגינים תכונות הידרוג'ל באופן מקרוסקופי. הידרוג'לים פפטידיים להרכבה עצמית שונים מהידרוג'לים פולימריים בכך שהם מרכיבים את עצמם באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות, צורת הג'ל שלהם הפיכה, והם מגיבים בקלות לתנאים ספציפיים למעבר בין תמיסה לשלב^{ג'ל 2}. לדוגמה, פפטידים של חומצות אמינו ארומטיות יכולים להיות מושרים לג'לטין על בסיס מיתוג ממס ^3,4,5, פפטידים RADA16 יוצרים ג'לים באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות קטיוניות ואניוניות⁶, ופפטיד E1Y9 מושרה ליצירת הידרוג'ל^{באמצעות יוני Ca 2+} 7. גוף האדם יכול לעכל חומצות אמינו טבעיות ולהציע תאימות ביולוגית מצוינת, תכונה שהידרוג'ל פולימרי אינו יכול להשיג⁸. חלבונים הם המולקולות המבצעות פונקציות ביולוגיות, והבדלים ברצפי הפפטידים יוצרים את הפונקציות הביולוגיות הספציפיות שלהם. לכן, הטבעה של רצפי פפטידים ביו-פונקציונליים ספציפיים והענקתם עם תכונות הרכבה עצמית יכולה לתכנן הידרוג'לים פפטידים להרכבה עצמית עם פונקציות ביולוגיות ייחודיות ומורפולוגיה ^9,10,11. מאמר זה מציג שלוש שיטות להכנת הידרוג'לים פפטידיים, כאשר תהליך הג'לציה מופעל על ידי היענות סביבתית. הוא גם דן בקצרה בשיטות לאפיון התכונות המכניות והמורפולוגיה של הידרוג'לים פפטידיים.

ה- pH מווסת את המטען של חומצות אמינו, מפעיל את הג'לציה של כמה פפטידים. לדוגמה, חומצות אמינו בעלות מטען חיובי (למשל, ארגינין, ליזין, היסטידין) מווסתות על ידי pH כדי להשיג מצבים חיוביים או ניטרליים. חומצות אמינו טעונות שלילית מווסתות על ידי pH כדי להשיג מצבים שליליים או ניטרליים, מתרחקות מהנקודה האיזואלקטרית שלהן ובכך משנות את ההידרופיליות שלהן בתמיסות מימיות. לכן, שליטה באינטראקציות אלקטרוסטטיות והידרופוביות בין פפטידים מאפשרת הרכבה עצמית מסודרת שלהם. Zhang et al. תכננו פפטיד להרכבה עצמית של pH מגיב לאמפיפיליה, KKFKFEFF מצומד למטוטרקסט, המגיב לסביבות מעט חומציות הן במבחנה והן in vivo, ומאפשר מעבר פאזה מסול לג'ל. זה מוביל לספיגה תאית יעילה ולאנדוציטוזה, ובכך מספק תרופות אנטי סרטניות ומשפר את יעילות הכימותרפיה¹². Shen et ^al.13 תכננו את הפפטיד FF8 (KRRFFRRK), אשר מתפרק בקלות לסיבים ב-pH גבוה מ-9.4. בתנאים ניטרליים, מיקרואורגניזמים מנטרלים את המטענים החיוביים שלהם עקב אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם קרומי הפוספוליפידים הטעונים שלילית שלהם, בתיאום עם מולקולות פוספוליפידים להרכבה עצמית, מה שגורם לקרע בקרום ומשפר את ההשפעות החיידקיות¹³.

הפעלת הרכבה עצמית על-מולקולרית של פפטיד להידרוג'לים באמצעות מתכות קואורדינציה היא שיטה נדירה יחסית¹⁴. כאשר יוני מתכת מתקשרים אלקטרוסטטית עם פפטידים, הם יוצרים גשרי מלח המחברים מולקולות פפטידיות, מה שמוביל לאינטראקציות לא קוולנטיות, והרכבה עצמית, מה שמביא לתכונות ג'לציה. לדוגמה, Abul-Haija et ^al.15 תכננו את הטריפפטיד FFD, שהופך מנוזל להידרוג'ל בתוספת יוני נחושת. Tao et ^al.16 פיתחו את החומצה הגלוטמית ואת הפפטיד E3F3 העשיר בפנילאלנין, המתפרק בעצמו להידרוג'ל סיבי בנוכחות יוני אבץ, ומשמש להעברת תרופות לערמונית.

היווצרות חילופי ממסים של הידרוג'לים פפטידים היא תנאי ההפעלה הנפוץ ביותר של הרכבה עצמית על-מולקולרית. לאחר שפפטידים הידרופוביים מתמוססים בממסים אורגניים, הקבוצות ההידרופוביות שלהם נחשפות במלואן. כאשר הן מועברות לשלב מימי, הקבוצות ההידרופוביות מתקרבות זו לזו, ומולקולות מים מקלות על היווצרות קשרי מימן פפטידיים, מה שמוביל להרכבה עצמית מהירה והיווצרות קלה של הידרוג'לים. לדוגמה, Zhang et ^al.17 תכננו פפטיד שיכול להתמוסס ביציבות בריכוזים גבוהים בממיסים אורגניים קוטביים, ולאחר דילול עם מים, להרכיב את עצמו למבנים של β יריעות כדי ליצור הידרוג'לים מסיבי פפטידים. Shen et ^al.13 תכננו פפטיד רדוקטיבי ECF-5 (ECAFF), המומס מראש בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) ולאחר מכן מוזרק לשלב מימי כדי ליצור הידרוג'ל רדוקטיבי, המשמש לסילוק ממוקד של מיני חמצן תגובתי המיוצרים על ידי איסכמיה-רפרפוזיה, אשר לאחר מכן התפרקה לתמיסה לאחר נבלות.

מחקר זה בחר שלוש אסטרטגיות פשוטות, מהירות וניתנות להכללה גבוהה להכנת פפטיד הידרוג'ל בהתבסס על ניסיון קודם: (1) שיטת תגובת pH: פפטידים מומסים בתמיסה עם pH רחוק מהנקודה האיזואלקטרית שלהם, ואז ה- pH מותאם קרוב לנקודה האיזואלקטרית. שינוי זה מאפשר לפפטידים מסוימים בהרכבה עצמית ליצור סיבים וליצור הידרוג'לים פפטידיים; (2) שיטת הוספת יוני מתכת: קטיונים קואורדינטיביים מתווספים לפפטידים מסיסים במים בעלי מטען שלילי להרכבה עצמית. קלציית תיאום המתכות בין הפפטידים מובילה להרכבתם העצמית להידרוג'לים; (3) שיטת החלפת ממסים: פפטידים בריכוז גבוה מומסים בממסים אורגניים ולאחר מכן מדוללים לשלב מימי, מה שגורם להתנהגות ג'לציה.

Protocol

פרטי הפלסמידים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. שיטת תגובת pH

1. הוסף 5 מ"ג של פפטידים ECF-5 ל 400 μL של מים deionized. סוניק ב-40 קילו-הרץ במשך 30 דקות וערבב היטב.
2. הוסף 40 μL של נתרן הידרוקסידי (1 M, מסונן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר) לתמיסת הפפטידים. מערבבים ומערבבים היטב. המשך בניקוי במשך 15 דקות עד להבהרת התמיסה במלואה.
3. מוסיפים 60 μL של חומצה הידרוכלורית. מערבלים במהירות ומבטיחים ערבוב יסודי. הניחו לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר במשך יותר מ-30 דקות כדי להקל על היווצרות הידרוג'ל.
   הערה: החלף מים שעברו דה-יוניזציה בתמיסת החיץ הרצויה במידת הצורך. אם חלקיקים מוצקים גדולים, כתשו אותם מראש. סוניק כדי להשיג תערובת חלקיקים הומוגנית בנוזל. אם הפפטיד אינו סובלני לתנאים בסיסיים, הוסף תחילה תמיסת חומצה הידרוכלורית 1M וחזור על השלבים לעיל. התאימו את כמויות החומצה והבסיס לפי הצורך כדי להגיע קרוב לנקודה האיזואלקטרית או ל- pH הרצוי, וודאו שתכונות יצירת הג'ל נשמרות.

2. שיטת הוספת יוני מתכת

1. הכנת החומר
   1. הכינו 0.15 מ' של טריס ו-0.1 מ' של חיץ NaCl ב-pH 7.4. יש לסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
   2. הכינו תמיסת פפטיד ECF-5 להרכבה עצמית בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל באמצעות החיץ שהוכן בשלב 1.1.1. יש להמיס באמצעות סוניקציה ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   3. הכינו תמיסת סידן כלורי במינון 50 מ"ג/מ"ל באמצעות מים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
2. חיבור יוני מתכת גרם להיווצרות פפטיד הידרוג'ל
   1. הוסף 40 μL של תמיסת סידן כלורי ל 460 μL של תמיסת פפטיד ECF-5. מערבבים ומערבבים היטב. הניחו לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר במשך יותר משעתיים.
      הערה: הימנע משימוש במאגר פוספט, מכיוון שהוא עלול להוביל למשקעים של יוני סידן.

3. שיטת החלפת ממסים

1. הכנת חומרים
   1. שקלו 10 מ"ג של אבקת פפטיד ליופילית ECF-5. הוסף אותו ל- 100 μL של DMSO. יש לערבב היטב באמצעות ultrasonication ולאחסן ב 4 ° C.
   2. הכן תמיסת חיץ PBS של 10 mM. מסננים ומעקרים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך שבוע.
2. היווצרות פפטיד הידרוג'ל המושרה על ידי ממס
   1. הכניסו במהירות 1 מ"ל של PBS לפפטיד המסיס ב-DMSO. מערבבים ומערבבים היטב. תן לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   2. מוסיפים 500 μL של PBS, נותנים לעמוד במשך 15 דקות, להשליך את supernatant, ולשמור על הג'ל התחתון. חזור על תהליך זה שלוש פעמים כדי להסיר DMSO.
      הערה: אם DMSO משפיע על ניסויים עוקבים, שקול להמיס את הפפטיד בריכוז גבוה יותר של DMSO כדי למזער את השפעתו.

4. אפיון ראומכני של הידרוג'ל

1. ניתוח ריאולוגי
   1. מעבירים את ההידרוג'ל לצלחת מקבילה מאלומיניום בקוטר 25 מ"מ. בצע ניתוח ריאולוגי דינמי של הידרוג'לים פפטידים באמצעות ראומטר¹⁸.
2. ניתוחי תדירות וטאטוא מתחים
   1. ביצוע ניתוחי תדירות וטאטוא מאמץ¹⁸ באופן שיטתי תוך שימוש בזן מבוקר של 0.3% ותדירות של 10 ראד/שנייה. ודא שבקרת הטמפרטורה מוגדרת ל- 25°C.

5. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) אפיון מורפולוגיית סיבים

1. הכנת חומרים
   1. הכינו תמיסה של 95% אתנול והוסיפו 5% APTES. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C ולהשתמש תוך חודש.
   2. יש למרוח דבק דו צדדי להסרת שכבת נציץ. הדביקו את משטחי הנציץ באמצעות תמיסת APTES והניחו לו לעמוד למשך 5 דקות. יש לשטוף היטב במים טהורים לפני השימוש.
   3. לדלל היטב לערבב את הידרוג'ל. זרקו אותו על משטח נציץ שונה ואפשרו ספיחה סטטית למשך 5 דקות. יש לשטוף את המשטח במים טהורים ולייבש אותו לפני השימוש.
2. שיטת זיהוי
   1. השתמש במיקוד אוטומטי רב-מצבי המצויד בסורק כדי לבחון מורפולוגיות של סיבי פפטיד או הידרוג'ל. השתמש cantilevers סיליקון עם קבוע קפיץ נומינלי של 48 N/m.
   2. אתחל את המכשיר כדי למקם את המחט. בחר במצב הקשה כדי לסרוק את הדגימה לקבלת תמונות.

תוצאות

שלוש השיטות המתוארות במאמר זה להכנת הידרוג'לים פפטידים מאפשרות ייצור מהיר, זול ופשוט. תפקידו של ההידרוג'ל קשור לרצף הפפטידי שלו. כאן, פפטיד ECF-5 משמש כדוגמה מייצגת כדי להדגים את המאפיינים הפיזיים שלו, כולל מורפולוגיה מיקרוסקופית ותכונות מכניות.

כפי שניתן לר...

Discussion

בעשורים האחרונים, בעקבות גילוי רצפי פפטידים בהרכבה עצמית שמקורם בחלבוני עמילואיד, תוכננו פפטידים רבים להרכבה עצמית בהתבסס על תכונותיהם, מה שמדגים פוטנציאל משמעותי ליישומים בביו-רפואה ובמדעי החומרים¹⁹. פפטיד הידרוג'ל הפגין יכולות ביו-פונקציונליזציה ייחודי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyl)triethoxysilane	Aladdin	A107147	/
Atomic Force Microscopy	Bruker	Multimode Nanoscope VIII	/
CaCl2	Aladdin	C290953	/
Diphenylalanine (FF)	Chinesepeptide	customizable	Purity > 95%
DMSO	Sigma-aldrich	34869	/
ECF-5 Peptides	Chinesepeptide	sequence: ECAFF	Purity > 95%
Hydrochloric Acid	Aladdin	H399657	/
Mica	Sigma-aldrich	AFM-71856-02	/
Phosphate Buffered Saline	Aladdin	P492453	/
Rheometer	Anton Paar GmbH	MCR302	/
Silicon Cantilevers	MikroMasch	XSC11	/
Sodium Chloride	Aladdin	C111549	/
Sodium Hydroxide	Aladdin	S140903	/
TRIS Hydrochloride	Aladdin	T431531	/