Preparación de hidrogeles de péptidos autoensamblados mecánicamente estables

Resumen

Este protocolo presenta tres métodos de preparación rápidos y sencillos que utilizan las condiciones ambientales para desencadenar el autoensamblaje de péptidos en hidrogeles. Además, se describe la caracterización de los hidrogeles peptídicos, demostrando que se pueden formar hidrogeles peptídicos mecánicamente estables en estas sencillas condiciones.

Resumen

Los hidrogeles peptídicos son geles de red tridimensionales altamente hidrófilos formados por el autoensamblaje de nanofibras o polímeros, creando redes de bloqueo de agua. Su morfología se asemeja mucho a la de la matriz extracelular, lo que les permite exhibir tanto las funciones biológicas de los péptidos como las propiedades de gelificación sensibles. Estas características únicas han llevado a su amplia aplicación en ingeniería de tejidos, cultivo celular tridimensional, terapia contra el cáncer, medicina regenerativa y otros campos biomédicos. Este artículo describe tres métodos para preparar hidrogeles peptídicos ECF-5 utilizando péptidos autoensamblables con procesos de gelificación sensibles al medio ambiente: (1) gelificación sensible al pH: los niveles variables de pH inducen la protonación o desprotonación de residuos de aminoácidos, alterando las interacciones electrostáticas entre las moléculas peptídicas y promoviendo su autoensamblaje en hidrogeles; (2) Adición de iones metálicos: los iones metálicos polivalentes quelan con residuos de aminoácidos cargados negativamente, que actúan como puentes entre péptidos para formar un hidrogel de red; (3) Intercambio de solventes: los péptidos hidrofóbicos se disuelven inicialmente en solventes orgánicos no polares y posteriormente inducen el autoensamblaje en hidrogeles al pasar a un entorno acuoso polar. Estos métodos utilizan procedimientos experimentales convencionales para facilitar el autoensamblaje de péptidos en hidrogeles. Mediante el diseño de secuencias peptídicas para alinearlas con condiciones específicas inductoras de gelificación, es posible lograr micro/nanoestructuras y funciones biológicas finamente ajustadas, lo que destaca el importante potencial de los hidrogeles peptídicos en el dominio biomédico.

Introducción

A través del diseño de secuencias peptídicas, las interacciones no covalentes entre péptidos inducen el autoensamblaje, lo que conduce a la formación de estructuras micro y nanométricas ordenadas, incluidos nanotubos, nanocintas, nanofibras y estructuras esféricas¹. Cuando se autoensamblan en fibras/cintas micro y nanométricas, estas estructuras exhiben macroscópicamente propiedades de hidrogel. Los hidrogeles autoensamblables de péptidos difieren de los hidrogeles poliméricos en que se autoensamblan a través de interacciones no covalentes, su forma de gel es reversible y responden fácilmente a condiciones específicas para la transición entre las fases de solución y gel². Por ejemplo, los péptidos de aminoácidos aromáticos se pueden inducir a gelatinizar en función del cambio de solventes ^3,4,5, los péptidos RADA16 forman geles a través de interacciones electrostáticas catiónicas y aniónicas⁶, y el péptido E1Y9 se induce a formar un hidrogel a través de los iones Ca^{2+ 7}. Los aminoácidos naturales pueden ser metabolizados por el cuerpo humano y ofrecen una excelente biocompatibilidad, una característica que los hidrogeles poliméricos no pueden lograr⁸. Las proteínas son las moléculas que ejecutan funciones biológicas, y las diferencias en las secuencias de péptidos crean sus funciones biológicas específicas. Por lo tanto, la incorporación de secuencias peptídicas biofuncionales específicas y su dotación de propiedades de autoensamblaje puede diseñar hidrogeles autoensamblables de péptidos con funciones biológicas y morfologías únicas ^9,10,11. Este artículo presenta tres métodos para preparar hidrogeles peptídicos, donde el proceso de gelificación se desencadena por la capacidad de respuesta ambiental. También se discuten brevemente los métodos para caracterizar las propiedades mecánicas y la morfología de los hidrogeles peptídicos.

El pH regula la carga de aminoácidos, desencadenando la gelificación de algunos péptidos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados positivamente (por ejemplo, arginina, lisina, histidina) son regulados por el pH para alcanzar estados positivos o neutros. Los aminoácidos cargados negativamente son regulados por el pH para alcanzar estados negativos o neutros, alejándose de su punto isoeléctrico y alterando así su hidrofilicidad en soluciones acuosas. Por lo tanto, el control de las interacciones electrostáticas e hidrofóbicas entre los péptidos facilita su autoensamblaje ordenado. Zhang et al. diseñaron un péptido autoensamblable anfifílico sensible al pH, KKFKFEFEF acoplado a metotrexato, que responde a entornos ligeramente ácidos tanto in vitro como in vivo, lo que permite una transición de fase de sol a gel. Esto conduce a una absorción celular eficiente y endocitosis, lo que proporciona medicamentos contra el cáncer y mejora la efectividad de la quimioterapia¹². Shen et ^al.13 diseñaron el péptido FF8 (KRRFFRRK), que se autoensambla fácilmente en fibras a un pH superior a 9,4. En condiciones neutras, los microorganismos neutralizan sus cargas positivas debido a las interacciones electrostáticas con sus membranas de fosfolípidos cargadas negativamente, coordinándose con las moléculas de fosfolípidos para autoensamblarse, causando la ruptura de la membrana y potenciando los efectos bactericidas¹³.

Desencadenar el autoensamblaje supramolecular de péptidos en hidrogeles utilizando metales de coordinación es un método relativamente raro¹⁴. Cuando los iones metálicos interactúan electrostáticamente con los péptidos, forman puentes salinos que conectan las moléculas de péptidos, lo que da lugar a interacciones no covalentes y autoensamblaje, lo que da lugar a propiedades de gelificación. Por ejemplo, Abul-Haija et ^al.15 diseñaron el tripéptido FFD, que pasa de líquido a hidrogel tras la adición de iones de cobre. Tao et ^al.16 desarrollaron el péptido E3F3, rico en ácido glutámico y fenilalanina, que se autoensambla en hidrogeles fibrosos en presencia de iones de zinc y se utiliza para la administración de fármacos prostáticos.

La formación de hidrogeles peptídicos por intercambio de disolventes es la condición desencadenante de autoensamblaje supramolecular más común. Después de que los péptidos hidrofóbicos se disuelven en solventes orgánicos, sus grupos hidrofóbicos están completamente expuestos. Cuando se transfieren a una fase acuosa, los grupos hidrofóbicos se acercan entre sí y las moléculas de agua facilitan la formación de enlaces de hidrógeno peptídicos, lo que conduce a un rápido autoensamblaje y una fácil formación de hidrogeles. Por ejemplo, Zhang et ^al.17 diseñaron un péptido que podía disolverse de manera estable a altas concentraciones en solventes orgánicos polares y, al diluirse con agua, autoensamblarse en estructuras de β láminas para formar hidrogeles de fibra peptídica. Shen et ^al.13 diseñaron un péptido reductor ECF-5 (ECAFF), predisuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) y luego inyectado en una fase acuosa para formar un hidrogel reductor, utilizado para la eliminación selectiva de especies reactivas de oxígeno producidas por isquemia-reperfusión, que posteriormente se degradaron en una solución después de la eliminación.

Este estudio seleccionó tres estrategias de preparación de hidrogel de péptidos simples, rápidas y altamente generalizables basadas en experiencias previas: (1) Método de respuesta al pH: los péptidos se disuelven en una solución con un pH lejos de su punto isoeléctrico, y luego el pH se ajusta cerca del punto isoeléctrico. Este cambio permite que ciertos péptidos autoensamblables formen fibras y creen hidrogeles peptídicos; (2) Método de adición de iones metálicos: los cationes de coordinación se agregan a péptidos autoensamblables solubles en agua, cargados negativamente. La quelación de coordinación de metales entre péptidos conduce a su autoensamblaje en hidrogeles; (3) Método de intercambio de solventes: los péptidos de alta concentración se disuelven en solventes orgánicos y luego se diluyen en una fase acuosa, induciendo un comportamiento de gelificación.

Protocolo

Los detalles de los plásmidos, reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Método de respuesta al pH

1. Añadir 5 mg de péptidos ECF-5 a 400 μL de agua desionizada. Sonicar a 40 kHz durante 30 min y mezclar bien.
2. Añadir 40 μL de hidróxido de sodio (1 M, filtrado a través de un filtro de 0,22 μm) a la solución peptídica. Vórtice y mezcle bien. Continúe la sonicación durante 15 minutos hasta que la solución esté completamente clarificada.
3. Añadir 60 μL de ácido clorhídrico. Vórtice rápidamente y asegure una mezcla completa. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante más de 30 minutos para facilitar la formación de hidrogel.
   NOTA: Reemplace el agua desionizada con la solución tampón deseada si es necesario. Si las partículas sólidas son grandes, pulverizarlas con anticipación. Sonicar para lograr una mezcla homogénea de partículas en el líquido. Si el péptido es intolerante a las condiciones alcalinas, agregue primero la solución de ácido clorhídrico 1 M y repita los pasos anteriores. Ajuste las cantidades de ácido y base según sea necesario para alcanzar cerca del punto isoeléctrico o el pH deseado, asegurando que se conserven las propiedades formadoras de gel.

2. Método de adición de iones metálicos

1. Preparación del material
   1. Prepare 0,15 M de Tris y 0,1 M de tampón de NaCl a pH 7,4. Filtrar a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C durante un máximo de una semana.
   2. Prepare una solución peptídica autoensamblable ECF-5 a una concentración de 10 mg/ml utilizando el tampón preparado en el paso 1.1.1. Disolver por sonicación y almacenar a 4 °C.
   3. Prepare una solución de cloruro de calcio de 50 mg/mL con agua desionizada. Conservar a 4 °C.
2. La adición de iones metálicos indujo la formación de hidrogel peptídico
   1. Añadir 40 μL de solución de cloruro de calcio a 460 μL de la solución peptídica ECF-5. Vórtice y mezcle bien. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante más de 2 h.
      NOTA: Evite el uso de tampón de fosfato, ya que puede provocar la precipitación de iones de calcio.

3. Método de intercambio de disolventes

1. Preparación de materiales
   1. Pesar 10 mg de polvo liofilizado con péptido ECF-5. Añádelo a 100 μL de DMSO. Mezclar bien mediante ultrasonidos y almacenar a 4 °C.
   2. Prepare 10 mM de solución tampón de PBS. Filtrar y esterilizar. Conservar a 4 °C y utilizar durante 1 semana.
2. Formación de hidrogel peptídico inducida por disolventes
   1. Introducir rápidamente 1 mL de PBS en el péptido solubilizado con DMSO. Vórtice y mezcle bien. Déjalo reposar a temperatura ambiente durante 5 min.
   2. Añadir 500 μL de PBS, dejar reposar durante 15 min, desechar el sobrenadante y conservar el gel de fondo. Repita este proceso tres veces para eliminar el DMSO.
      NOTA: Si el DMSO afecta a los experimentos posteriores, considere disolver el péptido en una concentración más alta de DMSO para minimizar su impacto.

4. Caracterización reomecánica del hidrogel

1. Análisis reológico
   1. Vierta el hidrogel en una placa paralela de aluminio de 25 mm. Realizar análisis reológicos de barrido de tiempo dinámico de los hidrogeles peptídicos utilizando un reómetro¹⁸.
2. Análisis de frecuencia y barrido de deformación
   1. Realice análisis de frecuencia y barrido de deformación¹⁸ de forma sistemática utilizando una deformación controlada del 0,3% y una frecuencia de 10 rad/s. Asegúrese de que el control de temperatura esté ajustado a 25 °C.

5. Caracterización de la morfología de las fibras por microscopía de fuerza atómica (AFM)

1. Preparación de materiales
   1. Prepare una solución de etanol al 95% y agregue 5% de APTES. Conservar a -20 °C y utilizar durante 1 mes.
   2. Aplique adhesivo de doble cara para eliminar una capa de mica. Adhiera las superficies de mica con la solución APTES y déjela reposar durante 5 min. Enjuague bien con agua pura antes de usar.
   3. Diluir y mezclar bien el hidrogel. Déjalo caer sobre la superficie de mica modificada y deja la adsorción estática durante 5 min. Enjuague la superficie con agua pura y séquela antes de usar.
2. Método de detección
   1. Utilice un AFM multimodo equipado con un escáner para examinar las morfologías de las fibras peptídicas o los hidrogeles. Utilice voladizos de silicio con una constante de resorte nominal de 48 N/m.
   2. Inicialice el instrumento para colocar la aguja. Seleccione el modo de toque para escanear la muestra y adquirir imágenes.

Resultados

Los tres métodos descritos en este artículo para preparar hidrogeles peptídicos permiten una producción rápida, asequible y sencilla. La función del hidrogel está relacionada con su secuencia peptídica. Aquí, el péptido ECF-5 se utiliza como ejemplo representativo para demostrar sus características físicas, incluida la morfología microscópica y las propiedades mecánicas.

Como se muestra en la Figura 1A y en la

Discusión

En las últimas décadas, tras el descubrimiento de secuencias peptídicas autoensamblables derivadas de proteínas amiloides, se han diseñado numerosos péptidos autoensamblables basados en sus propiedades, demostrando un potencial significativo para aplicaciones en biomedicina y ciencia de materiales¹⁹. Los hidrogeles peptídicos han demostrado capacidades únicas de biofuncionalización en el cultivo de tejidos, la administración de fármacos y el tratamiento...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyl)triethoxysilane	Aladdin	A107147	/
Atomic Force Microscopy	Bruker	Multimode Nanoscope VIII	/
CaCl2	Aladdin	C290953	/
Diphenylalanine (FF)	Chinesepeptide	customizable	Purity > 95%
DMSO	Sigma-aldrich	34869	/
ECF-5 Peptides	Chinesepeptide	sequence: ECAFF	Purity > 95%
Hydrochloric Acid	Aladdin	H399657	/
Mica	Sigma-aldrich	AFM-71856-02	/
Phosphate Buffered Saline	Aladdin	P492453	/
Rheometer	Anton Paar GmbH	MCR302	/
Silicon Cantilevers	MikroMasch	XSC11	/
Sodium Chloride	Aladdin	C111549	/
Sodium Hydroxide	Aladdin	S140903	/
TRIS Hydrochloride	Aladdin	T431531	/