Préparation d’hydrogels de peptides auto-assemblés mécaniquement stables

Résumé

Ce protocole présente trois méthodes de préparation simples et rapides qui utilisent les conditions environnementales pour déclencher l’auto-assemblage des peptides en hydrogels. De plus, la caractérisation des hydrogels peptidiques est décrite, démontrant que des hydrogels peptidiques mécaniquement stables peuvent être formés dans ces conditions simples.

Résumé

Les hydrogels peptidiques sont des gels de réseau tridimensionnels hautement hydrophiles formés par l’auto-assemblage de nanofibres ou de polymères, créant des réseaux de verrouillage de l’eau. Leur morphologie ressemble beaucoup à celle de la matrice extracellulaire, ce qui leur permet de présenter à la fois les fonctions biologiques des peptides et les propriétés de gélification réactive. Ces caractéristiques uniques ont conduit à leur vaste application dans l’ingénierie tissulaire, la culture cellulaire tridimensionnelle, la thérapie du cancer, la médecine régénérative et d’autres domaines biomédicaux. Cet article décrit trois méthodes de préparation d’hydrogels peptidiques ECF-5 à l’aide de peptides auto-assemblés avec des processus de gélification sensibles à l’environnement : (1) gélification sensible au pH : des niveaux de pH variables induisent la protonation ou la déprotonation des résidus d’acides aminés, modifiant les interactions électrostatiques entre les molécules peptidiques et favorisant leur auto-assemblage en hydrogels ; (2) Ajout d’ions métalliques : ions métalliques polyvalents chélatés avec des résidus d’acides aminés chargés négativement, agissant comme des ponts entre les peptides pour former un hydrogel en réseau ; (3) Échange de solvants : les peptides hydrophobes sont initialement dissous dans des solvants organiques non polaires et induisent ensuite un auto-assemblage en hydrogels lors de la transition vers un environnement aqueux polaire. Ces méthodes utilisent des procédures expérimentales conventionnelles pour faciliter l’auto-assemblage des peptides en hydrogels. En concevant des séquences peptidiques qui s’alignent sur des conditions spécifiques d’induction de gélification, il est possible d’obtenir des micro/nanostructures et des fonctions biologiques finement ajustées, mettant en évidence le potentiel significatif des hydrogels peptidiques dans le domaine biomédical.

Introduction

Grâce à la conception de séquences peptidiques, les interactions non covalentes entre les peptides induisent l’auto-assemblage, conduisant à la formation de structures micro- et nanométriques ordonnées, y compris des nanotubes, des nanorubans, des nanofibres et des structures sphériques¹. Lorsqu’elles sont auto-assemblées en fibres/rubans micro et nanométriques, ces structures présentent macroscopiquement des propriétés hydrogel. Les hydrogels auto-assemblés peptidiques diffèrent des hydrogels polymères en ce qu’ils s’auto-assemblent par des interactions non covalentes, que leur forme de gel est réversible et qu’ils répondent facilement à des conditions spécifiques pour passer de la phase de solution à la phase^{de gel 2}. Par exemple, les peptides d’acides aminés aromatiques peuvent être induits à se gélatiniser en fonction de la commutation de solvant ^3,4,5, les peptides RADA16 forment des gels par des interactions électrostatiques cationiques et anioniques⁶, et le peptide E1Y9 est induit à former un hydrogel via des ions Ca^{2+ 7}. Les acides aminés naturels peuvent être métabolisés par le corps humain et offrent une excellente biocompatibilité, une caractéristique que les hydrogels polymères ne peuvent pas atteindre⁸. Les protéines sont les molécules qui exécutent des fonctions biologiques, et les différences dans les séquences peptidiques créent leurs fonctions biologiques spécifiques. Par conséquent, l’intégration de séquences peptidiques biofonctionnelles spécifiques et leur dotation de propriétés d’auto-assemblage peuvent concevoir des hydrogels peptidiques auto-assemblés avec des fonctions biologiques et des morphologies uniques ^9,10,11. Cet article présente trois méthodes de préparation des hydrogels peptidiques, où le processus de gélification est déclenché par la réactivité environnementale. Il aborde également brièvement les méthodes de caractérisation des propriétés mécaniques et de la morphologie des hydrogels peptidiques.

Le pH régule la charge des acides aminés, déclenchant la gélification de certains peptides. Par exemple, les acides aminés chargés positivement (par exemple, l’arginine, la lysine, l’histidine) sont régulés par le pH pour atteindre des états positifs ou neutres. Les acides aminés chargés négativement sont régulés par le pH pour atteindre des états négatifs ou neutres, s’éloignant de leur point isoélectrique et modifiant ainsi leur hydrophilie dans les solutions aqueuses. Par conséquent, le contrôle des interactions électrostatiques et hydrophobes entre les peptides facilite leur auto-assemblage ordonné. Zhang et al. ont conçu un peptide auto-assemblé amphiphile sensible au pH, couplé au méthotrexate, qui répond à des environnements légèrement acides à la fois in vitro et in vivo, permettant une transition de phase sol-gel. Cela conduit à une absorption cellulaire et une endocytose efficaces, ce qui permet d’administrer des médicaments anticancéreux et d’améliorer l’efficacité de la chimiothérapie¹². Shen et ^al.13 ont conçu le peptide FF8 (KRRFFRRK), qui s’auto-assemble facilement en fibres à un pH supérieur à 9,4. Dans des conditions neutres, les micro-organismes neutralisent leurs charges positives en raison des interactions électrostatiques avec leurs membranes phospholipidiques chargées négativement, se coordonnant avec les molécules de phospholipides pour s’auto-assembler, provoquant la rupture de la membrane et renforçant les effets bactéricides¹³.

Le déclenchement de l’auto-assemblage supramoléculaire de peptides en hydrogels à l’aide de métaux de coordination est une méthode relativement rare¹⁴. Lorsque les ions métalliques interagissent électrostatiquement avec les peptides, ils forment des ponts salins qui relient les molécules peptidiques, entraînant des interactions non covalentes et un auto-assemblage, ce qui se traduit par des propriétés de gélification. Par exemple, Abul-Haija et ^al.15 ont conçu le tripeptide FFD, qui passe d’un état liquide à un hydrogel lors de l’ajout d’ions cuivre. Tao et ^al.16 ont développé l’acide glutamique et le peptide riche en phénylalanine E3F3, qui s’auto-assemble en hydrogels fibreux en présence d’ions zinc, et est utilisé pour l’administration de médicaments pour la prostate.

La formation d’hydrogels peptidiques par échange de solvants est la condition de déclenchement de l’auto-assemblage supramoléculaire la plus courante. Une fois que les peptides hydrophobes se sont dissous dans des solvants organiques, leurs groupes hydrophobes sont entièrement exposés. Lorsqu’ils sont transférés dans une phase aqueuse, les groupes hydrophobes se rapprochent les uns des autres et les molécules d’eau facilitent la formation de liaisons hydrogène peptidiques, conduisant à un auto-assemblage rapide et à une formation facile d’hydrogels. Par exemple, Zhang et ^al.17 ont conçu un peptide capable de se dissoudre de manière stable à des concentrations élevées dans des solvants organiques polaires et, après dilution avec de l’eau, de s’auto-assembler en structures en feuilles de β pour former des hydrogels de fibres peptidiques. Shen et ^al.13 ont conçu un peptide réducteur ECF-5 (ECAFF), pré-dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), puis injecté dans une phase aqueuse pour former un hydrogel réducteur, utilisé pour l’élimination ciblée des espèces réactives de l’oxygène produites par ischémie-reperfusion, qui se dégradent ensuite en une solution après le piégeage.

Cette étude a sélectionné trois stratégies simples, rapides et hautement généralisables de préparation d’hydrogel peptidique sur la base d’expériences antérieures : (1) Méthode de réponse au pH : les peptides sont dissous dans une solution dont le pH est éloigné de leur point isoélectrique, puis le pH est ajusté à un niveau proche du point isoélectrique. Ce changement permet à certains peptides auto-assemblés de former des fibres et de créer des hydrogels peptidiques ; (2) Méthode d’addition d’ions métalliques : des cations de coordination sont ajoutés à des peptides auto-assemblés solubles dans l’eau et chargés négativement. La chélation de coordination métallique entre les peptides conduit à leur auto-assemblage en hydrogels ; (3) Méthode d’échange de solvant : les peptides à haute concentration sont dissous dans des solvants organiques puis dilués dans une phase aqueuse, induisant un comportement de gélification.

Protocole

Les détails des plasmides, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Méthode de réponse au pH

1. Ajouter 5 mg de peptides ECF-5 à 400 μL d’eau désionisée. Sonicate à 40 kHz pendant 30 min et mixez soigneusement.
2. Ajouter 40 μL d’hydroxyde de sodium (1 M, filtré à travers un filtre de 0,22 μm) à la solution peptidique. Vortex et mélangez soigneusement. Continuez la sonication pendant 15 minutes jusqu’à ce que la solution soit complètement clarifiée.
3. Ajouter 60 μL d’acide chlorhydrique. Vortex rapidement et assurez-vous d’un mélange minutieux. Laissez le mélange reposer à température ambiante pendant plus de 30 minutes pour faciliter la formation d’hydrogel.
   REMARQUE : Remplacez l’eau déminéralisée par la solution tampon souhaitée si nécessaire. Si les particules solides sont grosses, pulvérisez-les à l’avance. Sonicate pour obtenir un mélange de particules homogène dans le liquide. Si le peptide est intolérant aux conditions alcalines, ajoutez d’abord une solution d’acide chlorhydrique 1 M et répétez les étapes ci-dessus. Ajustez les quantités d’acide et de base si nécessaire pour atteindre près du point isoélectrique ou du pH souhaité, en veillant à ce que les propriétés gélifiantes soient conservées.

2. Méthode d’ajout d’ions métalliques

1. Préparation du matériel
   1. Préparez 0,15 M de Tris et 0,1 M de tampon NaCl à pH 7,4. Filtrer à travers un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C jusqu’à une semaine.
   2. Préparer une solution peptidique auto-assemblante ECF-5 à une concentration de 10 mg/mL à l’aide du tampon préparé à l’étape 1.1.1. Dissoudre par sonication et conserver à 4 °C.
   3. Préparez une solution de chlorure de calcium à 50 mg/mL avec de l’eau désionisée. Conserver à 4 °C.
2. L’ajout d’ions métalliques a induit la formation d’hydrogel peptidique
   1. Ajouter 40 μL de solution de chlorure de calcium à 460 μL de solution de peptide ECF-5. Vortex et mélangez soigneusement. Laisser reposer le mélange à température ambiante pendant plus de 2 h.
      REMARQUE : Évitez d’utiliser un tampon de phosphate, car cela pourrait entraîner une précipitation d’ions calcium.

3. Méthode d’échange de solvant

1. Préparation des matériaux
   1. Peser 10 mg de poudre lyophilisée de peptide ECF-5. Ajoutez-le à 100 μL de DMSO. Mélangez soigneusement à l’aide d’ultrasons et conservez à 4 °C.
   2. Préparez une solution tampon de 10 mM de PBS. Filtrer et stériliser. Conserver à 4 °C et utiliser dans un délai de 1 semaine.
2. Formation d’hydrogel peptidique induite par le solvant
   1. Introduire rapidement 1 mL de PBS dans le peptide solubilisé au DMSO. Vortex et mélangez soigneusement. Laissez reposer à température ambiante pendant 5 min.
   2. Ajouter 500 μL de PBS, laisser reposer pendant 15 min, jeter le surnageant et conserver le gel inférieur. Répétez ce processus trois fois pour éliminer le DMSO.
      REMARQUE : Si le DMSO affecte les expériences ultérieures, envisagez de dissoudre le peptide dans une concentration plus élevée de DMSO afin de minimiser son impact.

4. Caractérisation rhéomécanique de l’hydrogel

1. Analyse rhéologique
   1. Versez l’hydrogel sur une plaque parallèle en aluminium de 25 mm. Effectuer une analyse rhéologique dynamique par balayage temporel des hydrogels peptidiques à l’aide d’un rhéomètre¹⁸.
2. Analyses de balayage de fréquence et de déformation
   1. Effectuer systématiquement des analyses de fréquence et de balayage de déformation¹⁸ en utilisant une déformation contrôlée de 0,3 % et une fréquence de 10 rad/s. Assurez-vous que le contrôle de la température est réglé sur 25 °C.

5. Caractérisation de la morphologie des fibres par microscopie à force atomique (AFM)

1. Préparation des matériaux
   1. Préparez une solution d’éthanol à 95 % et ajoutez 5 % d’APTES. Conserver à -20 °C et utiliser dans un délai de 1 mois.
   2. Appliquez un adhésif double face pour enlever une couche de mica. Collez les surfaces de mica à l’aide de la solution APTES et laissez reposer pendant 5 min. Rincez abondamment à l’eau pure avant utilisation.
   3. Diluez et mélangez soigneusement l’hydrogel. Déposez-le sur la surface du mica modifié et laissez l’adsorption statique pendant 5 min. Rincez la surface à l’eau pure et séchez-la avant utilisation.
2. Méthode de détection
   1. Utilisez un AFM multimode équipé d’un scanner pour examiner les morphologies de fibres peptidiques ou d’hydrogels. Utilisez des porte-à-faux en silicone avec une constante nominale de ressort de 48 N/m.
   2. Initialisez l’instrument pour positionner l’aiguille. Sélectionnez le mode de tapotement pour scanner l’échantillon afin d’acquérir des images.

Résultats

Les trois méthodes décrites dans cet article pour préparer des hydrogels peptidiques permettent une production rapide, abordable et simple. La fonction de l’hydrogel est liée à sa séquence peptidique. Ici, le peptide ECF-5 est utilisé comme exemple représentatif pour démontrer ses caractéristiques physiques, y compris la morphologie microscopique et les propriétés mécaniques.

Comme le montrent la figure 1A et la

Discussion

Au cours des dernières décennies, à la suite de la découverte de séquences peptidiques auto-assemblées dérivées de protéines amyloïdes, de nombreux peptides auto-assemblés ont été conçus en fonction de leurs propriétés, démontrant un potentiel significatif d’applications en biomédecine et en science des matériaux¹⁹. Les hydrogels peptidiques ont montré des capacités uniques de biofonctionnalisation dans la culture tissulaire, l’administrat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyl)triethoxysilane	Aladdin	A107147	/
Atomic Force Microscopy	Bruker	Multimode Nanoscope VIII	/
CaCl2	Aladdin	C290953	/
Diphenylalanine (FF)	Chinesepeptide	customizable	Purity > 95%
DMSO	Sigma-aldrich	34869	/
ECF-5 Peptides	Chinesepeptide	sequence: ECAFF	Purity > 95%
Hydrochloric Acid	Aladdin	H399657	/
Mica	Sigma-aldrich	AFM-71856-02	/
Phosphate Buffered Saline	Aladdin	P492453	/
Rheometer	Anton Paar GmbH	MCR302	/
Silicon Cantilevers	MikroMasch	XSC11	/
Sodium Chloride	Aladdin	C111549	/
Sodium Hydroxide	Aladdin	S140903	/
TRIS Hydrochloride	Aladdin	T431531	/