تلقيح الأوراق في الجسم الحي: طريقة بديلة لتقييم مقاومة الأمراض للمستنسخات الهجينة في تربية الحور لمرض تقرح الساق

Summary

نحن نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لتقييم مقاومة الحور لمسببات الأمراض الجذعية باستخدام طريقة تلقيح الأوراق في الجسم الحي . هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص للتقييم واسع النطاق لمقاومة مرض التقرح الخلوي و Botryosphaeria dothidea في ذرية تربية الحور في الصين.

Abstract

أمراض التقرح الجذعية التي يسببها العامل الممرض Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) و Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not. هما مرضان رئيسيان للغابات في مزارع الحور في الصين ، وأحيانا يمكن أن يدمروا جميع شتلات الحور أو يلحقون أضرارا بالغة بغابات الحور الناضجة. التربية الهجينة هي الطريقة الأكثر مباشرة وفعالية للسيطرة على أمراض الأشجار وإدارتها. ومع ذلك ، فإن تقييم مقاومة الأمراض أو اختيار المستنسخة المقاومة للأمراض بناء على تلقيح الساق في المختبر غير فعال ويستغرق وقتا طويلا ومكلفا ، مما يحد من تطور التكاثر الهجين لمرض تقرح جذع الحور. في هذه الدراسة ، اقترحنا طريقة بديلة لتقييم مقاومة الأمراض لمسببات الأمراض الجذعية من خلال تلقيح الأوراق في الجسم الحي. يمكن أن تكون مواد الاختبار المستخدمة في هذه الطريقة على شتلات الحور البالغة من العمر 1 عاما أو الفروع السنوية لأشجار الحور المعمرة في الدفيئة أو الحقل. الخطوة الحاسمة لهذه الطريقة البديلة هي اختيار أوراق التلقيح: قد تكون الأوراق الناضجة حديثا 5-7 هي الأنسب. الخطوة الثانية الحاسمة لطريقة تلقيح الأوراق هي إحداث جروح على أوراق النبات من خلال ثقوب الإبر ، مما يوفر آفات كافية لقياس شدة المرض. بالنسبة للعدد الكافي من الأوراق المنتجة في المرحلة المبكرة من تربية الحور ، يساهم تلقيح الأوراق في الجسم الحي في الفحص السريع والدقيق والواسع النطاق لاستنساخ الحور المقاوم للأمراض لوقف مسببات الأمراض في التقرح. علاوة على ذلك ، ستعمل طريقة تلقيح الأوراق هذه أيضا كطريقة فعالة لفحص الأنماط المرضية لمسببات مرض تقرح الساق C. chrysosperma أو B.dothidea أو غيرها من مسببات أمراض آفة جذع الحور.

Introduction

أمراض تقرح جذع الحور ، التي تسببها بشكل رئيسي اثنين من مسببات الأمراض الميتة ، Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. و Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not. ، تهدد بشدة تطوير وبقاء مزارع الحور في الشمال الشرقي والشمال والشمال الغربي (ثلاثة شمال) من الصين. التربية المهجنة هي الطريقة الأكثر مباشرة وفعالية للسيطرة على أمراض الأشجار وإدارتها. ومع ذلك ، بالمقارنة مع التقدم المحرز في تربية المستنسخة عالية الغلة أو سريعة النمو أو غيرها من المستنسخة الهجينة من الحور ، فإن الأبحاث حول تربية المقاومة لمرض آفة الحور نادرة. تم الإبلاغ عن دراسات محدودة فقط للتكاثر الهجين المقاوم للأمراض^1،2،3 ، ولم يتم زراعة أي استنساخ هجين مقاوم للقرحة في تشجير الحور.

الخطوة الحاسمة للتربية الهجينة المنتظمة هي اختيار الاستنساخ بناء على اكتساب النمط الظاهري للذرية الهجينة. ومع ذلك ، فإن اكتساب الأنماط الظاهرية المرضية (الأنماط المرضية) يستغرق وقتا طويلا وشاقا ومتعبا ومكلفا ويعتمد على الخبراء. بالنسبة للنباتات الخشبية ، يكون الأمر أكثر صعوبة بسبب الطبيعة المستهلكة للوقت والعمالة والاقتصاد بسبب دورة حياتها الطويلة ونموها البطيء وجسمها الضخم. على سبيل المثال ، في الحور ، تم إجراء فحص مقاومة القرحة للذرية الهجينة بعد 5-7 سنوات من التهجين من خلال طرق التلقيح التقليدية في الساق في المختبر ^1،2،3. علاوة على ذلك ، نظرا لمحدودية طريقة الفحص منخفضة الكفاءة وعالية الاستهلاك المقاومة للأمراض ، أعاد الباحثون اختيار المستنسخة المقاومة للآفة من مجموعة فرعية صغيرة (على سبيل المثال ، استنساخ الحور المختار عالي الغلة أو سريع النمو) ، وليس من جميع النسل الهجين. لذلك ، باستخدام طرق التلقيح الجذعية العادية ، ليس من المؤكد تحديد المستنسخة المقاومة الأصلية ولا يمكن الكشف عن التنوع المقاوم للأمراض لذرية التكاثر ، مما يحد من استكشاف الجينات أو وحدات الجينات المرتبطة بمقاومة الأمراض. بالمقارنة مع التطور السريع لتربية الحور سريعة النمو / عالية الغلة ، يمكن لبرامج التربية هذه الحصول على الهجينة من خلال الانتقاء الظاهري أو حتى الانتقاء الجينومي في العامين الأولين من التكاثر⁴ ، تطورت تربية مقاومة تقرح الحور ببطء. أصبح الفحص المقاوم للأمراض (أو الكشف) للذرية الهجينة ، أو طريقة تلقيح مسببات الأمراض ، الخطوة الحاسمة للحد من السرعة في تربية مقاومة مرض تقرح الحور.

في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة تلقيح جديدة لمسببات الأمراض آفة جذع الحور ، في طريقة تلقيح الأوراق في الجسم الحي . باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا اختبار مقاومة مرض القرحة بسرعة وكفاءة لعشرات الأنواع من الحور (الأصناف أو المستنسخة) في غضون 5-7 أيام. أوضح اختبار التحقق أن تلقيح الأوراق في الجسم الحي يتوافق مع التلقيح التقليدي في الساق في المختبر بشأن الكشف عن مقاومة مرض تقرح الساق ، مما يشير إلى أن طريقة تلقيح الأوراق مناسبة لفحص المقاومة على نطاق واسع لأمراض تقرح الحور ، مثل اختيار النمط الوراثي الكامل لذرية المقاومة في تربية مرض تقرح الساق. هذه الطريقة تحل المشكلة المرضية لاختيار ذرية مقاومة في تربية الهجين من أمراض آفة الحور.

Protocol

1. ثقافة فطرية لمسببات الأمراض آفة

1. تحضير أجار سكر العنب للبطاطس (PDA ؛ استخراج البطاطس 6.0 جم ، سكر العنب 20.0 جم ، أجار 20.0 جم) وسط استزراع للسلالات الفطرية ؛ قم بإذابة المواد المذكورة أعلاه في ماء يصل إلى 1000 مل ، وقم بإذابة الوسط تماما عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
2. صب وسط المساعد الرقمي الشخصي في أنابيب 25 مل (يحتوي كل منها على 15.0 مل) ؛ تعقيم جميع الأنابيب عند 121.1 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. صب الوسط في ألواح الاستزراع (قطرها 9.0 سم) وقم بتبريد الألواح في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. قطع أفطورة العامل الممرض الفطري ، الذي يتم استزراعه في وسط PDA عند 28 درجة مئوية لمدة 7 أيام ، إلى ~ 0.5 سم مكعبات مربعة ؛ تلقيح المكعبات الفطرية في وسط لوحات المساعد الشخصي الرقمي (تواجه جوانب الفطريات الوسط).
4. استزرع مسببات الأمراض الفطرية في حاضنة ثرموستاتية (28 درجة مئوية ، في الظلام) لمدة 7-10 أيام.
5. قطع وسط المساعد الشخصي الرقمي مع الفطريات الفطرية إلى مكعبات مربعة (طول الجانب 1.0-1.2 سم).

2. تحضير مواد الحور

1. بالنسبة لاستنساخ الحور البالغ من العمر 1 عاما (المزروع > 3 أشهر) ، حدد الأوراق الناضجة حديثا والممتدة بالكامل (دائما 5-7^{أوراق ،} من أعلى الشتلات / الفروع) للفروع الرئيسية كمواد ملقحة ، وتأكد من خلوها من الآفات والأمراض والأضرار الميكانيكية.
2. بالنسبة للفروع البالغة من العمر 1 سنة من استنساخ الحور الهجين الدائم (المزروعة > 2 أشهر) ، حدد^{أعلى 5-7} أوراق من الفروع المختارة كمواد ملقحة. تأكد من أن الأوراق صحية ولها نفس حالة الإضاءة (الظل أو الضوء) بين جميع مستنسخات الحور التي تم اختبارها.

3. المعالجة المسبقة لأوراق التلقيح

1. رش أوراق الحور بالماء النظيف ، وبعد التجفيف ، امسح الأوراق المحددة بنسبة 75٪ كحول 1 ساعة أو يوم واحد قبل التلاعب بالتلقيح.

4. تلقيح أوراق الجسم الحي

1. بالنسبة للأوراق الصغيرة (عرض الورقة < 8.0 سم) ، قم بتلقيح مكعبين فطريين مربعين ومكعبات PDA (أو أجار الماء ، WA) (1.0-1.2 سم في طول الجانب) على السطح العلوي لأعلى 5-7 أوراق من استنساخ الحور ؛ تواجه الفطريات الأوراق. تأكد من أن مواقع التلقيح تقع في وسط نصف الأوراق ، ~ 1-2 سم بعيدا عن الأوردة المركزية ، وتجنب حجب الأوردة الثانوية. يقوم كل استنساخ بتلقيح 12 موقعا على 6 أوراق (10 مواقع للفطريات وموقعين لتلقيح PDA).
2. للأوراق الكبيرة (عرض الورقة ≥ 8.0 سم) ، قم بتلقيح أربعة مكعبات فطرية مربعة ومكعبات PDA (أو WA) على أعلى 5-7 أوراق حور. يقوم كل استنساخ بتلقيح 12 موقعا في 3 أوراق (10 مواقع للفطريات و 2 مواقع لتلقيح PDA.
3. لف الأوراق الملقحة بشريط لاصق شفاف (بعرض 6.0 سم) واضغط عليها برفق لجعلها لاصقة بالأوراق ، مما يمنع تحريك مكعبات الميسيليوم (أو PDA) وفقدانها للماء أثناء التجربة.
4. اثقب الأوراق ومكعبات الفطريات (أو PDA) في خمسة مواقع حتى تخترق الإبر المكعبات من السطح العلوي إلى السطح السفلي لأوراق الحور. يقع موقع واحد في المركز ، والأربعة الأخرى تقع 1-2 مم بالقرب من الرؤوس الأربعة للمكعبات.
   ملاحظة: يوصى بالتعاون مع فريق مكون من 3 أشخاص لمعالجة التلقيح الفطري. يمكن إجراء معالجة التلقيح لمجموعة هجينة من الحور (>100 نمط وراثي) في 4 ساعات من خلال العمل الجماعي. تم إجراء عمليات التلاعب بالثقب بعد تلقيح جميع الأوراق المختبرة ولفها للتخفيف من تأثير أوقات الثقب المختلفة على شدة المرض.
5. افحص تحول الموقع وفقدان الماء للقاحات الفطريات ، ولاحظ ظهور الآفات الميتة حول مواقع جرح الثقب من السطح السفلي للأوراق حتى يوم 3^من التلقيح.
   1. في غضون 3 أيام من التلقيح ، لاحظ تحول الموقع وفقدان الماء لمكعبات الفطريات. حدد وميز مكعبات الميسيليوم المنقولة والمجففة على أنها تلقيحات غير فعالة وتجاهلها من التحديد النهائي للأنماط المرضية مع تعريف المكعبات الأخرى على أنها تلقيحات فعالة.
      ملاحظة: يعرف هذا البروتوكول استنساخ الحور المختبر مع أكثر من خمسة مكعبات تلقيح فعالة على أنها مستنسخات ملقحة غير صالحة ؛ لذلك ، قدم كل استنساخ حور ما لا يقل عن 30 موقعا فعالا للتلقيح ، والتي ستتطور إلى 30 بقعة نخرية مستقلة.
6. التقط جميع الأوراق الملقحة في نهاية التجربة (~ 5-7 أيام بعد التلقيح) ، وأعدها إلى المختبر في أكياس عينات بلاستيكية ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

5. اكتساب النمط المرضي للأوراق وتقييم مقاومة الحور لأمراض التقرح الجذعية في المختبر

1. قم بإزالة الأشرطة اللاصقة الشفافة ولقاحات الفطريات (أو PDA) بعناية من الأوراق.
2. راقب وحدد الأنماط المرضية للأوراق لكل استنساخ حور ، بما في ذلك شكل ولون البقع الميتة ، وقد تشمل البنية الشبيهة بالخيوط الفطرية ، والبيكنيديا ، والكونيديا التي تشكلت على سطح الأوراق حول مواقع الثقب.
3. قم بتصوير الأوراق (باستخدام مسطرة إضافية) باستخدام كاميرا، أو امسح الأوراق ضوئيا (باستخدام مسطرة إضافية) باستخدام ماسح ضوئي للحصول على صور بدقة تزيد عن 300 نقطة في البوصة، ثم احفظ الصور بتنسيق JPEG أو TIFF أو PNG.

6. تحديد والتحليل الإحصائي لحدوث المرض

1. افتح صور الأوراق المريضة في البرنامج ImageJ 1.54g (http://imagj.org).
2. اضبط المقياس وفقا للمسطرة في صور الورقة.
3. تحديد وقياس الآفات باستخدام أداة العصا (التتبع).
4. قم بتسجيل وتصدير قيم المنطقة كجدول بيانات بعد قياس مناطق جميع البقع الميتة.
5. ضع معايير تحديد المرض:
   1. إذا كانت مساحة الآفة حول مكعبات الفطريات المغطاة بمواقع الثقب أكبر بكثير من تلك التي تغطيها مكعبات PDA ، فقم بتحديد هذه المواقع كمواقع مرض.
   2. إذا تغيرت الخصائص المورفولوجية لمكعبات الفطريات المغطاة بمواقع الثقب بشكل كبير عند مقارنتها بالمواقع المغطاة بالمساعد الرقمي الشخصي ، بما في ذلك ألوان الآفة ، وإنتاج بنية تشبه الخيوط ، والبيكنيديا ، والكونيديا ، حدد الموقع أيضا كموقع مرض.
6. احسب متوسط مساحات كل بقع آفة PDA الفعالة لكل استنساخ هجين من الحور. وفقا لمتوسط المناطق ، قسم جميع البقع الملقحة بالفطريات لاستنساخ واحد من الحور إلى فئتين: بداية وغير بداية. بعد ذلك ، احسب معدل الإصابة بمرض استنساخ الحور الذي تم اختباره (الصيغة 1: معدل الإصابة بالمرض (٪) = عدد مواقع الوخز المريضة / إجمالي عدد مواقع الوخز الفعالة × 100).
7. احسب متوسط مساحة البقع المريضة في الأوراق (ن = 50). وفقا لقيم متوسط مناطق البقع المريضة من الأوراق في جميع استنساخ الحور التي تم اختبارها ، قم بتعيين معيار تصنيف المرض من 5 مستويات.
8. احسب مؤشر المرض لكل استنساخ حور (الصيغة 2) بناء على معيار تصنيف المرض أعلاه (الصيغة 2: مؤشر المرض = ∑ (عدد مواقع الوخز حسب المستوى × قيم الشدة على جميع المستويات) / (قيمة أعلى مستوى خطورة × إجمالي عدد مواقع الوخز الفعالة) × 100).
9. تحقق من التوزيع الطبيعي لأعداد استنساخ الحور عبر مستويات المقاومة المختلفة باستخدام اختبار Shapiro-Wilk باستخدام أي برنامج مناسب لتحليل البيانات.
10. وفقا لمؤشر المرض ، حدد جميع مستنسخات الحور التي تم اختبارها على أنها خمس (أو سبعة) مجموعات: مقاومة عالية جدا (VHR) ، مقاومة عالية (HR) ، مقاومة (R) ، لا مقاومة ولا حساسية (NRNS) ، حساسية (S) ، حساسية عالية (HS) ، وحساسية عالية جدا (VHS) المجموعة⁵.

النتائج

في هذا البروتوكول ، تم إجراء سير العمل التخطيطي في 48 نسخة هجينة من الحور مصابة بمسببات الأمراض الجذعية C. chrysosperma (الشكل 1). المستنسخة الهجينة من الحور هي جزء من ذرية التهجين من P. deltoides ، المزروعة في الحضانة في الأكاديمية الصينية للغابات (CAF) ، بكين.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقة تلقيح سريعة وفعالة لمسببات الأمراض المقاومة لآفة الحور ، وهي مناسبة لمجالات البحث التي تتطلب فحصا واسع النطاق لمقاومة الأمراض ، مثل التربية الهجينة لمقاومة آفة الحور وفحص الإمراضية لمسببات الأمراض في تقرح الساق.

النقطة الرئيس?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum foil	Biosharp	BS-QT-027B
C. chrysosperma isolate	China Forestry Culture Collection Center	CFCC86775	Separation and preservation by our laboratory
Cytospora chrysosperma	Plant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry	NCBI accession number: MK994101 for rRNA-ITS and MN025273 for EF1α gene   CGMCC number:40575	Separation and preservation by our laboratory
Epson Perfection V370 Photo	Epson	V370	Scanner; Scan the leaves into image
PDA (Potato Dextrose Agar)	Solarbio	P8931	Provide nutrition for fungal growth
PE plastic film			To fix fungi on the leaves
Populus alba var. Pyramidalis	Plant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry		Cultivated by our laboratory
SPSS	IBM		Data analysis software
Thermostatic incubator	Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd	KTD-6000	Provide an environment for fungal growth
Tough TG-6 camera	OLYMPUS		To take photos of diseased leaves