In vivo Blattinokulation: Eine alternative Methode zur Beurteilung der Krankheitsresistenz von Hybridklonen in der Pappelzucht der Stammkrebskrankheit

Zusammenfassung

Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Bewertung der Pappelresistenz gegen Stammkrebserreger unter Verwendung einer In-vivo-Blattinokulationsmethode zur Verfügung. Diese Methode eignet sich besonders für die großflächige Beurteilung der Resistenz von Cytospora chrysosperma und Botryosphaeria dothidea bei Nachkommen aus der Pappelzucht in China.

Zusammenfassung

Stammkrebserkrankungen, die durch den Erreger Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) und Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) verursacht werden, Ces. sind die beiden größten Waldkrankheiten auf den Pappelplantagen in China, die mitunter alle Pappelsetzlinge vernichten oder ausgewachsene Pappelwälder schwer schädigen können. Die Hybridzüchtung ist die direkteste und effizienteste Methode zur Bekämpfung und zum Management von Baumkrankheiten. Die Bewertung der Krankheitsresistenz oder die Auswahl von Klonen mit Krankheitsresistenz auf der Grundlage der In-vitro-Stamminokulation ist jedoch ineffizient, zeitaufwändig und teuer, was die Entwicklung der Hybridzüchtung der Pappelstammkrebskrankheit einschränkt. In dieser Studie haben wir eine alternative Methode vorgeschlagen, um die Krankheitsresistenz gegen Stammkrebserreger durch in vivo Blattinokulation zu bewerten. Die bei dieser Methode verwendeten Testmaterialien können an 1-jährigen Pappelsetzlingen oder den einjährigen Zweigen mehrjähriger Pappeln im Gewächshaus oder auf dem Feld verwendet werden. Der entscheidende Schritt dieser alternativen Methode ist die Auswahl der inokulierenden Blätter: Die 5-7^frisch gereiften Blätter könnten am besten geeignet sein. Der zweite kritische Schritt der Blattinokulationsmethode besteht darin, Wunden an den Pflanzenblättern durch Nadelstiche zu machen, um genügend Läsionen zu erzeugen, um die Schwere der Erkrankung zu messen. Für die ausreichende Anzahl von Blättern, die in der frühen Phase der Pappelzucht produziert werden, trägt diese In-vivo-Blattinokulation zu einem schnellen, genauen und groß angelegten Screening der krankheitsresistenten Pappelklone auf Krebspathogene bei. Darüber hinaus wird diese Blattinokulationsmethode auch als effiziente Methode zum Screening von Pathotypen von Erregern der Stammkrebskrankheit C. chrysosperma, B. dothidea oder anderen Erregern der Pappelstammkrebse dienen.

Einleitung

Erkrankungen des Pappelstammkrebses, die hauptsächlich durch zwei nekrotrophe Erreger, Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. und Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not., bedrohen ernsthaft die Entwicklung und das Überleben von Pappelplantagen im Nordosten, Norden und Nordwesten (Drei-Norden) Chinas. Die Hybridzüchtung ist die direkteste und effizienteste Methode zur Bekämpfung und Bekämpfung von Baumkrankheiten. Verglichen mit den Fortschritten in der Züchtung von ertragreichen, schnellwüchsigen oder anderen Pappelhybridklone ist die Forschung zur Resistenzzüchtung bei Pappelkrebs jedoch spärlich. Es wurden nur begrenzte Studien zur Züchtung von krankheitsresistenten Hybriden berichtet ^1,2,3, und es wurde kein krebsresistenter Hybridklon in Pappelaufforstungen kultiviert.

Der entscheidende Schritt der regulären Hybridzüchtung ist die Klonselektion auf Basis des Phänotyperwerbs der Hybridnachkommen. Der Erwerb pathologischer Phänotypen (Pathotypen) ist jedoch ein zeitaufwändiger, mühsamer, ermüdender, teurer und expertenabhängiger Prozess. Für Gehölze ist es aufgrund des zeit-, arbeits- und wirtschaftlichen Aufwands, der durch ihren langen Lebenszyklus, ihr langsames Wachstum und ihren massiven Körper verursacht wird, eine größere Herausforderung. Zum Beispiel wurde bei Pappeln das Krebsresistenz-Screening von Hybridnachkommen 5-7 Jahre nach der Hybridisierung durch konventionelle in vitro Stamminokulationsmethoden durchgeführt ^1,2,3. Darüber hinaus selektierten die Forscher, eingeschränkt durch diese wenig effiziente und aufwändige krankheitsresistente Screening-Methode, die krebsresistenten Klone aus einer kleinen Untergruppe (z. B. den ausgewählten ertragreichen oder schnell wachsenden Pappelklonen), nicht aus allen Hybridnachkommen. Daher ist es bei Verwendung der regulären Stamminokulationsmethoden nicht sicher, die authentischen resistenten Klone zu identifizieren, und kann die krankheitsresistente Vielfalt der Zuchtnachkommen nicht aufdecken, was die Erforschung von krankheitsresistenzrelevanten Genen oder Genmodulen einschränkt. Verglichen mit der rasanten Entwicklung der Pappel-Schnellwuchs-/Ertragszüchtung können diese Züchtungsprogramme in den ersten zwei Jahren der Züchtung Hybriden durch phänotypische Selektion oder sogar genomische Selektion erhalten⁴, die Pappelkrebs-Resistenz-Züchtung entwickelte sich langsam. Das krankheitsresistente Screening (oder der Nachweis) von Hybridnachkommen oder die Methode der Erregerinokulation ist zum entscheidenden geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt in der Züchtung von Pappelkrebs geworden.

In diesem Protokoll stellen wir eine neuartige Inokulationsmethode für Erreger von Pappelstängelkrebs vor, die In-vivo-Blattinokulationsmethode. Mit dieser Methode können wir schnell und effizient die Resistenz von Dutzenden von Pappelarten (Kultivare oder Klone) innerhalb von 5-7 Tagen testen. Der Validierungsassay zeigte, dass die in vivo Blattinokulation mit der traditionellen in vitro Stamminokulation bei der Resistenzdetektion der Stammkrebskrankheit konsistent ist, was darauf hindeutet, dass die Blattinokulationsmethode für ein groß angelegtes Resistenzscreening von Pappelkrebskrankheiten geeignet ist, wie z. B. die Selektion des gesamten Genotyps von Resistenznachkommen bei der Züchtung der Stammkrebskrankheit. Diese Methode löst das pathologische Problem der Selektion resistenter Nachkommen in der Hybridzüchtung von Pappelkrebsen.

Protokoll

1. Pilzkultur für Krebserreger

1. Bereiten Sie das Nährmedium aus Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA; Kartoffelextraktion 6,0 g, Dextrose 20,0 g, Agar 20,0 g) für Pilzstämme vor; lösen Sie die oben genannten Materialien in Wasser bis zu 1000 mL auf, lösen Sie das Medium bei 100 °C für 10 min vollständig auf.
2. Gießen Sie PDA-Medium in 25-ml-Röhrchen (jedes enthält 15,0 ml); Alle Röhrchen bei 121,1 °C für 30 min sterilisieren. Gießen Sie das Medium in Kulturplatten (9,0 cm Durchmesser) und kühlen Sie die Platten bei Raumtemperatur (RT) ab.
3. Schneiden Sie das Myzel des Pilzerregers, das 7 Tage lang in PDA-Medium bei 28 °C kultiviert wird, in ~0,5 cm große quadratische Würfel; impfen Sie die Pilzwürfel in der Mitte der PDA-Platten (die Myzelseiten zeigen zum Medium).
4. Kultivieren Sie die Pilzerreger in einem thermostatischen Inkubator (28 °C, dunkel) für 7-10 Tage.
5. Den PDA medium mit Pilzmyzel in quadratische Würfel schneiden (Seitenlänge 1,0-1,2 cm).

2. Vorbereitung von Pappelmaterialien

1. Bei 1 Jahr alten Pappelklone (kultiviert > 3 Monaten) wählen Sie die frisch gereiften, voll ausgestreckten Blätter (immer 5-7^Blätter , von der Spitze des Setzlings/der Äste) der Hauptzweige als geimpftes Material aus und stellen Sie sicher, dass sie frei von Schädlingen, Krankheiten und mechanischen Beschädigungen sind.
2. Bei 1-jährigen Zweigen von mehrjährigen Pappel-Hybridklone (kultiviert > 2 Monaten) wählen Sie die oberen 5-7^Blätter der ausgewählten Zweige als inokuliertes Material aus. Stellen Sie sicher, dass die Blätter gesund sind und die gleichen Lichtverhältnisse (Schatten oder Licht) wie alle getesteten Pappelklone haben.

3. Vorbehandlung der Impfblätter

1. Besprühen Sie die Pappelblätter mit sauberem Wasser und wischen Sie die ausgewählten Blätter nach dem Trocknen 1 h oder 1 Tag vor den Impfmanipulationen mit 75% Alkohol ab.

4. In-vivo-Impfung von Blättern

1. Bei kleinen Blättern (Blattbreite < 8,0 cm) inokulieren Sie zwei quadratische Pilzmyzelwürfel und PDA-Würfel (oder Wasser-Agar, WA) (1,0-1,2 cm Seitenlänge) auf die Oberseite der oberen 5-7 Blätter von Pappelklonen; Das Myzel ist den Blättern zugewandt. Stellen Sie sicher, dass sich die Impfstellen in der Mitte der halben Blätter befinden, ~1-2 cm von den zentralen Venen entfernt, um eine Verdeckung der sekundären Venen zu vermeiden. Jeder Klon impft 12 Stellen auf 6 Blättern (10 Stellen für Myzel und 2 Stellen für die PDA-Inokulation).
2. Bei großen Blättern (Blattbreite ≥ 8,0 cm) inokulieren Sie vier quadratische Pilzmyzelwürfel und PDA-Würfel (oder WA) auf die oberen 5-7 Pappelblätter. Jeder Klon impft 12 Stellen an 3 Blättern (10 Stellen für Myzel und 2 Stellen für die PDA-Inokulation).
3. Wickeln Sie die inokulierten Blätter mit transparentem Klebeband (6,0 cm breit) ein und drücken Sie sie vorsichtig an, damit sie an den Blättern haften, um ein Verschieben und einen Wasserverlust der Myzel- (oder PDA-) Würfel während des Experiments zu verhindern.
4. Durchstechen Sie die Blätter und die Myzelwürfel an fünf Stellen, bis die Nadeln die Würfel von der oberen zur unteren Oberfläche der Pappelblätter durchdringen. Eine Stelle liegt in der Mitte, die anderen vier liegen 1-2 mm in der Nähe der vier Eckpunkte der Würfel.
   HINWEIS: Für die Manipulation der Pilzimpfung wird eine Zusammenarbeit von 3 Personen empfohlen. Die Inokulationsmanipulation einer Pappelhybridpopulation (>100 Genotypen) kann in Teamarbeit in 4 h durchgeführt werden. Die Piercing-Manipulationen wurden durchgeführt, nachdem alle getesteten Blätter geimpft und eingewickelt worden waren, um die Auswirkungen der unterschiedlichen Piercing-Zeiten auf den Schweregrad der Erkrankung zu mildern.
5. Untersuchen Sie die Standortverschiebung und den Wasserverlust der Myzel-Impfmittel und beobachten Sie das Auftreten von nekrotischen Läsionen um die Stichwundenstellen von der Unterseite der Blätter bis zum 3^. Tag der Inokulation.
   1. Beobachten Sie innerhalb von 3 Tagen nach der Inokulation die Standortverschiebung und den Wasserverlust der Myzelwürfel. Definieren und markieren Sie die bewegten und getrockneten Myzelwürfel als unwirksame Inokulationen und verwerfen Sie sie aus der endgültigen Identifizierung der Pathotypen, während Sie die anderen Würfel als wirksame Inokulationen definieren.
      HINWEIS: Dieses Protokoll definiert die getesteten Pappelklone mit mehr als fünf wirksamen Impfwürfeln als ungültige inokulierte Klone; Daher bot jeder Pappelklon mindestens 30 effektive Impfstellen, die sich zu 30 unabhängigen nekrotischen Flecken entwickelten.
6. Pflücken Sie am Ende des Versuchs (~5-7 Tage nach der Inokulation) alle inokulierten Blätter ab, bringen Sie sie in Plastikprobenbeuteln zurück ins Labor und lagern Sie sie bei 4 °C.

5. Erwerb des Blattpathotyps und Beurteilung der Pappelresistenz gegen Stammkrebskrankheiten im Labor

1. Entfernen Sie vorsichtig die durchsichtigen Klebebänder und Myzel- (oder PDA-) Impfmittel von den Blättern.
2. Beobachten und identifizieren Sie die Blattpathotypen jedes Pappelklons, einschließlich der Form und Farbe der nekrotischen Flecken, und können die pilzliche hyphenähnliche Struktur, Pyknidien und Konidien umfassen, die sich auf der Oberfläche der Blätter um die Einstichstellen gebildet haben.
3. Fotografieren Sie die Blätter (mit einem zusätzlichen Lineal) mit einer Kamera oder scannen Sie die Blätter (mit einem zusätzlichen Lineal) mit einem Scanner, um Bilder mit einer Auflösung von mehr als 300 dpi zu erhalten, und speichern Sie die Bilder dann im JPEG-, TIFF- oder PNG-Format.

6. Identifizierung und statistische Analyse des Krankheitsauftretens

1. Öffnen Sie die Bilder von kranken Blättern in der Software ImageJ 1.54g (http://imagj.org).
2. Stellen Sie den Maßstab entsprechend dem Lineal in den Blattbildern ein.
3. Identifizieren und messen Sie die Läsionen mit dem Stab-Tool (Tracing).
4. Zeichnen Sie die Flächenwerte auf und exportieren Sie sie als Tabelle, nachdem die Flächen aller nekrotischen Flecken gemessen wurden.
5. Legen Sie die Kriterien für die Bestimmung der Krankheit fest:
   1. Wenn der Bereich der Läsion um die mit Myzelwürfeln bedeckten Lochstellen signifikant größer ist als der von PDA-Würfeln bedeckte, dann definieren Sie diese Stellen als Krankheitsstellen.
   2. Wenn sich die morphologischen Eigenschaften der mit Myzelwürfeln bedeckten Lochstellen im Vergleich zu den PDA-bedeckten Stellen signifikant änderten, einschließlich der Farben der Läsion, die eine hyphenartige Struktur, Pyknidien und Konidien erzeugen, definieren Sie die Stelle auch als Krankheitsstelle.
6. Berechnen Sie die durchschnittlichen Flächen der effektiven PDA-Läsionsflecken jedes Pappelhybrid-Klons. Entsprechend den durchschnittlichen Flächen teilen Sie alle mit Myzel beimpften Flecken eines Pappelklons in zwei Kategorien ein: Beginn und Nichtbeginn. Berechnen Sie dann die Inzidenzrate des getesteten Pappelklons (Formel 1: Inzidenzrate der Krankheit (%) = Anzahl der erkrankten Strickstellen/Gesamtzahl der effizienten Strickstellen × 100).
7. Berechnen Sie die durchschnittliche Fläche der kranken Flecken in den Blättern (n = 50). Entsprechend den Werten der durchschnittlichen Flächen mit erkrankten Blattflecken in allen getesteten Pappelklonen wird ein 5-stufiger Standard für die Einstufung der Krankheit festgelegt.
8. Berechnen Sie den Krankheitsindex jedes Pappelklons (Formel 2) auf der Grundlage des oben genannten Krankheitseinstufungsstandards (Formel 2: Krankheitsindex = ∑(Anzahl der Stichstellen nach Stufe × Schweregrad auf allen Ebenen)/(Wert des höchsten Schweregrads × Gesamtzahl der effizienten Stichstellen) × 100).
9. Überprüfen Sie die Normalverteilung der Anzahl der Pappelklone über die verschiedenen Resistenzstufen mit dem Shapiro-Wilk-Test unter Verwendung einer geeigneten Datenanalysesoftware.
10. Anhand des Krankheitsindex sind alle getesteten Pappelklone in fünf (oder sieben) Gruppen einzuteilen: sehr hohe Resistenz (VHR), hohe Resistenz (HR), Resistenz (R), keine Resistenz und keine Anfälligkeit (NRNS), Anfälligkeit (S), hohe Anfälligkeit (HS) und sehr hohe Anfälligkeit (VHS) Gruppe⁵.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurde der schematische Arbeitsablauf an 48 Pappelhybridklone durchgeführt, die mit dem Stammkrebserreger C. chrysosperma infiziert waren (Abbildung 1). Die Pappelhybrid-Klone sind Teil der Hybriden-Nachkommen von P. deltoides, die in der Baumschule der Chinesischen Akademie für Forstwirtschaft (CAF) in Peking gezüchtet werden.

Der Stammkrebserreger C. chrysosperma Isolat CZC ist ei...

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und effiziente Inokulationsmethode für Erreger der Pappelkrebsresistenz, die sich für Forschungsbereiche eignet, die ein groß angelegtes Screening auf Krankheitsresistenz erfordern, wie z. B. die Hybridzüchtung von Pappelkrebsresistenzen und das Pathogenitätsscreening von Stammkrebserregern.

Der erste wichtige Punkt der Methode ist die Bewertung der Krankheitsresistenz durch die Inokulation von neu gereiften Blätter...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum foil	Biosharp	BS-QT-027B
C. chrysosperma isolate	China Forestry Culture Collection Center	CFCC86775	Separation and preservation by our laboratory
Cytospora chrysosperma	Plant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry	NCBI accession number: MK994101 for rRNA-ITS and MN025273 for EF1α gene   CGMCC number:40575	Separation and preservation by our laboratory
Epson Perfection V370 Photo	Epson	V370	Scanner; Scan the leaves into image
PDA (Potato Dextrose Agar)	Solarbio	P8931	Provide nutrition for fungal growth
PE plastic film			To fix fungi on the leaves
Populus alba var. Pyramidalis	Plant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry		Cultivated by our laboratory
SPSS	IBM		Data analysis software
Thermostatic incubator	Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd	KTD-6000	Provide an environment for fungal growth
Tough TG-6 camera	OLYMPUS		To take photos of diseased leaves