Inoculation foliaire in vivo : une méthode alternative pour évaluer la résistance aux maladies des clones hybrides dans la sélection du peuplier de la maladie du chancre de la tige

Résumé

Nous fournissons un protocole étape par étape pour évaluer la résistance du peuplier aux agents pathogènes du chancre de la tige à l’aide d’une méthode d’inoculation in vivo des feuilles. Cette méthode est particulièrement adaptée à l’évaluation à grande échelle de la résistance à la maladie du chancre de Cytospora chrysosperma et de Botryosphaeria dothidea chez la descendance de la sélection de peupliers en Chine.

Résumé

Chancres de la tige causés par les agents pathogènes Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) et Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. sont les deux principales maladies forestières dans les plantations de peupliers en Chine, qui peuvent parfois détruire tous les plants de peupliers ou gravement endommager les forêts de peupliers matures. La sélection hybride est la méthode la plus directe et la plus efficace de contrôle et de gestion des maladies des arbres. Cependant, l’évaluation de la résistance aux maladies ou la sélection de clones résistants aux maladies sur la base de l’inoculation in vitro des tiges est inefficace, longue et coûteuse, ce qui limite le développement de la sélection d’hybrides de la maladie du chancre de la tige du peuplier. Dans cette étude, nous avons proposé une méthode alternative pour évaluer la résistance aux agents pathogènes du chancre de la tige par inoculation in vivo des feuilles. Le matériel d’essai utilisé dans cette méthode peut se trouver sur des jeunes peupliers âgés de 1 an ou sur les branches annuelles de peupliers vivaces en serre ou au champ. L’étape critique de cette méthode alternative est la sélection des feuilles inoculées : les 5 à 7^e feuilles nouvellement matures pourraient être les plus appropriées. La deuxième étape critique de la méthode d’inoculation des feuilles consiste à faire des blessures sur les feuilles des plantes par des perforations d’aiguilles, fournissant des lésions suffisantes pour mesurer la gravité de la maladie. Pour le nombre adéquat de feuilles produites au stade précoce de la sélection du peuplier, cette inoculation in vivo des feuilles contribue au dépistage rapide, précis et à grande échelle des clones de peuplier résistants aux maladies contre les agents pathogènes du chancre de la tige. De plus, cette méthode d’inoculation des feuilles servira également de méthode efficace pour le dépistage des pathotypes de la maladie du chancre de la tige C. chrysosperma, B. dothidea ou d’autres agents pathogènes du chancre de la tige du peuplier.

Introduction

Les maladies du chancre de la tige du peuplier, principalement causées par deux agents pathogènes nécrotrophes, Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. et Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. menacent gravement le développement et la survie des plantations de peupliers dans le nord-est, le nord et le nord-ouest (trois-nord) de la Chine. La sélection hybride est la méthode la plus directe et la plus efficace pour contrôler et gérer les maladies des arbres ; Cependant, par rapport aux progrès de la sélection pour les clones hybrides de peuplier à haut rendement, à croissance rapide ou autres, la recherche sur la sélection de résistance pour la maladie du chancre du peuplier est rare. Seules des études limitées sur la reproduction d’hybrides résistants aux maladies ont été signalées ^1,2,3, et aucun clone hybride résistant au chancre n’a été cultivé dans le boisement de peupliers.

L’étape cruciale de la sélection régulière d’hybrides est la sélection des clones basée sur l’acquisition du phénotype de la descendance hybride. Cependant, l’acquisition de phénotypes pathologiques (pathotypes) est un processus long, laborieux, fatigant, coûteux et dépendant des experts. Pour les plantes ligneuses, c’est plus difficile en raison de la nature consommatrice de temps, de main-d’œuvre et d’économie causée par leur long cycle de vie, leur croissance lente et leur corps massif. Par exemple, chez le peuplier, le dépistage de la résistance au chancre de la descendance hybride a été effectué 5 à 7 ans après l’hybridation par des méthodes conventionnelles d’inoculation de tiges in vitro ^1,2,3. De plus, limités par cette méthode de dépistage résistante aux maladies peu efficace et très consommatrile, les chercheurs ont sélectionné à nouveau les clones résistants au chancre dans un petit sous-groupe (par exemple, les clones de peuplier à haut rendement ou à croissance rapide sélectionnés), et non dans toute la descendance hybride. Par conséquent, en utilisant les méthodes habituelles d’inoculation des tiges, il n’est pas certain d’identifier les clones résistants authentiques et ne peut pas révéler la diversité résistante aux maladies de la descendance reproductrice, limitant ainsi l’exploration des gènes ou des modules de gènes liés à la résistance aux maladies. Par rapport au développement rapide de la sélection à croissance rapide et à haut rendement du peuplier, ces programmes de sélection peuvent obtenir des hybrides par sélection phénotypique ou même sélection génomique au cours des deux premières années de sélection⁴, la sélection résistante au chancre du peuplier s’est développée lentement. Le dépistage (ou la détection) de la descendance hybride résistant aux maladies, ou la méthode d’inoculation des agents pathogènes, est devenu l’étape cruciale de limitation de la vitesse dans la sélection de la résistance à la maladie du chancre du peuplier.

Dans ce protocole, nous introduisons une nouvelle méthode d’inoculation pour les agents pathogènes du chancre de la tige du peuplier, la méthode d’inoculation foliaire in vivo . En utilisant cette méthode, nous pouvons tester rapidement et efficacement la résistance aux chancres de dizaines d’espèces de peupliers (cultivars ou clones) en 5 à 7 jours. L’essai de validation a montré que l’inoculation foliaire in vivo est compatible avec l’inoculation traditionnelle in vitro de la tige sur la détection de la résistance du chancre de la tige, ce qui suggère que la méthode d’inoculation des feuilles convient au dépistage à grande échelle de la résistance des chancres du peuplier, comme la sélection du génotype complet de la descendance de la résistance dans la sélection de la maladie du chancre de la tige. Cette méthode résout le problème pathologique de la sélection d’une progéniture résistante dans la sélection hybride des maladies du chancre du peuplier.

Protocole

1. Culture fongique pour l’agent pathogène du chancre

1. Préparez le milieu de culture de la gélose au dextrose de pomme de terre (PDA ; extraction de la pomme de terre 6,0 g, dextrose 20,0 g, gélose 20,0 g) pour les souches fongiques ; dissoudre les matériaux ci-dessus dans l’eau jusqu’à 1000 ml, dissoudre complètement le milieu à 100 °C pendant 10 min.
2. Verser le milieu PDA dans des tubes de 25 mL (contenant chacun 15,0 mL) ; stériliser tous les tubes à 121,1 °C pendant 30 min. Verser le milieu dans des plaques de culture (9,0 cm de diamètre) et refroidir les plaques à température ambiante (RT).
3. Coupez le mycélium de l’agent pathogène fongique, qui est cultivé dans un milieu PDA à 28 °C pendant 7 jours, en cubes carrés de ~0,5 cm ; inoculer les cubes fongiques au centre des plaques PDA (les côtés du mycélium font face au milieu).
4. Cultivez les agents pathogènes fongiques dans un incubateur thermostatique (28 °C, dans l’obscurité) pendant 7 à 10 jours.
5. Coupez le milieu PDA avec du mycélium fongique en cubes carrés (longueur latérale 1,0-1,2 cm).

2. Préparation des matériaux en peuplier

1. Pour les clones de peuplier âgés de 1 an (cultivés > 3 mois), sélectionnez les feuilles nouvellement mûres et entièrement étendues (toujours 5-7^èmes feuilles, à partir du haut du jeune arbre/des branches) des branches principales comme matériaux inoculés, assurez-vous qu’elles sont exemptes de parasites, de maladies et de dommages mécaniques.
2. Pour les branches de 1 an de clones hybrides de peuplier vivace (cultivées > 2 mois), sélectionnez les 5 à 7^e feuilles supérieures des branches sélectionnées comme matériaux inoculés. Assurez-vous que les feuilles sont saines et ont les mêmes conditions de lumière (ombre ou lumière) parmi tous les clones de peuplier testés.

3. Prétraitement des feuilles d’inoculation

1. Vaporisez les feuilles de peuplier avec de l’eau propre et, après séchage, essuyez les feuilles sélectionnées avec de l’alcool à 75% 1 h ou 1 jour avant les manipulations d’inoculation.

4. Inoculation foliaire in vivo

1. Pour les petites feuilles (largeur des feuilles < 8,0 cm), inoculer deux cubes carrés de mycélium fongique et des cubes de PDA (ou gélose à l’eau, WA) (1,0 à 1,2 cm de longueur) sur la surface supérieure des 5 à 7 feuilles supérieures des clones de peuplier ; Le mycélium fait face aux feuilles. Assurez-vous que les sites d’inoculation sont situés au centre des demi-feuilles, à ~1-2 cm des nervures centrales, en évitant d’obscurcir les nervures secondaires. Chaque clone inocule 12 sites sur 6 feuilles (10 sites pour le mycélium et 2 sites pour l’inoculation de la PDA).
2. Pour les grandes feuilles (largeur des feuilles ≥ 8,0 cm), inoculez quatre cubes carrés de mycélium fongique et des cubes PDA (ou WA) sur les 5 à 7 feuilles supérieures de peuplier. Chaque clone inocule 12 sites à 3 feuilles (10 sites pour le mycélium et 2 sites pour l’inoculation de la PDA.
3. Enveloppez les feuilles inoculées avec du ruban adhésif transparent (6,0 cm de largeur) et appuyez doucement pour les faire adhérer aux feuilles, empêchant ainsi le déplacement et la perte d’eau des cubes de mycélium (ou PDA) pendant l’expérience.
4. Percez les feuilles et les cubes de mycélium (ou PDA) à cinq endroits jusqu’à ce que les aiguilles pénètrent dans les cubes de la face supérieure à la surface inférieure des feuilles de peuplier. Un site se trouve au centre, et les quatre autres se trouvent à 1-2 mm près des quatre sommets des cubes.
   REMARQUE : Une collaboration d’équipe de 3 personnes est recommandée pour la manipulation de l’inoculation fongique. La manipulation de l’inoculation d’une population hybride de peuplier (>100 génotypes) peut être réalisée en 4 h grâce à un travail d’équipe. Les manipulations de perçage ont été effectuées après que toutes les feuilles testées aient été inoculées et enveloppées pour atténuer l’impact des différents moments de perçage sur la gravité de la maladie.
5. Inspectez le déplacement de l’emplacement et la perte d’eau des inoculants de mycélium, et observez l’apparition de lésions nécrotiques autour des sites de plaie de perçage à partir de la surface inférieure des feuilles jusqu’au 3^e jour de l’inoculation.
   1. Dans les 3 jours suivant l’inoculation, observez le déplacement de l’emplacement et la perte d’eau des cubes de mycélium. Définir et marquer les cubes de mycélium déplacés et séchés comme des inoculations inefficaces et les éliminer de l’identification finale des pathotypes tout en définissant les autres cubes comme des inoculations efficaces.
      REMARQUE : Ce protocole définit les clones de peuplier testés avec plus de cinq cubes d’inoculation efficaces comme des clones inoculés invalides ; Par conséquent, chaque clone de peuplier a fourni au moins 30 sites d’inoculation efficaces, qui se développeront en 30 taches nécrotiques indépendantes.
6. Retirez toutes les feuilles inoculées à la fin de l’expérience (~5-7 jours après l’inoculation), rapportez-les au laboratoire dans des sacs d’échantillons en plastique et conservez-les à 4 °C.

5. Acquisition du pathotype foliaire et évaluation de la résistance du peuplier aux maladies du chancre de la tige en laboratoire

1. Retirez délicatement les rubans adhésifs transparents et les inoculants de mycélium (ou PDA) des feuilles.
2. Observez et identifiez les pathotypes foliaires de chaque clone de peuplier, y compris la forme et la couleur des taches nécrotiques, et peuvent inclure la structure fongique en forme d’hyphes, les pycnides et les conidies qui se sont formées à la surface des feuilles autour des sites de perforation.
3. Photographiez les feuilles (avec une règle supplémentaire) avec un appareil photo, ou numérisez les feuilles (avec une règle supplémentaire) à l’aide d’un scanner pour obtenir des images avec une résolution de plus de 300 ppp, puis enregistrez les images au format JPEG, TIFF ou PNG.

6. Identification et analyse statistique de l’apparition de la maladie

1. Ouvrez les images des feuilles malades dans le logiciel ImageJ 1.54g (http://imagj.org).
2. Réglez l’échelle en fonction de la règle dans les images feuilles.
3. Identifiez et mesurez les lésions à l’aide de la baguette (traçage).
4. Enregistrez et exportez les valeurs de surface sous forme de tableur après avoir mesuré les surfaces de tous les points nécrotiques.
5. Définissez les critères de détermination de la maladie :
   1. Si la zone de lésion autour des cubes de mycélium recouverts de sites de perçage est significativement plus grande que celle couverte par les cubes de PDA, alors définissez ces sites comme des sites de maladie.
   2. Si les caractéristiques morphologiques des sites de perçage recouverts de cubes de mycélium ont considérablement changé par rapport aux sites recouverts de PDA, y compris les couleurs de la lésion, produisant une structure semblable à celle des hyphes, les pycnides et les conidies, définissent également le site comme un site de maladie.
6. Calculez les surfaces moyennes des taches de lésion PDA efficaces de chaque clone d’hybride de peuplier. En fonction des superficies moyennes, divisez toutes les taches inoculées au mycélium d’un clone de peuplier en deux catégories : débutantes et non débutantes. Ensuite, calculez le taux d’incidence de la maladie du clone de peuplier testé (Formule 1 : Taux d’incidence de la maladie (%) = Nombre de sites de piqûre malades/Nombre total de sites de piqûre efficaces × 100).
7. Calculez la superficie moyenne des taches malades dans les feuilles (n = 50). Selon les valeurs des zones moyennes de taches malades des feuilles dans tous les clones de peuplier testés, établissez une norme de classement des maladies à 5 niveaux.
8. Calculez l’indice de maladie de chaque clone de peuplier (Formule 2) sur la base de la norme de classification de la maladie ci-dessus (Formule 2 : Indice de maladie = ∑(Nombre de sites de piqûre par niveau × Valeurs de gravité à tous les niveaux)/(Valeur du niveau de gravité le plus élevé × Nombre total de sites de piqûre efficaces) × 100).
9. Vérifiez la distribution normale du nombre de clones de peupliers à travers différents niveaux de résistance à l’aide du test Shapiro-Wilk à l’aide de tout logiciel d’analyse de données approprié.
10. Selon l’indice de maladie, identifier tous les clones de peuplier testés en cinq (ou sept) groupes : très haute résistance (VHR), haute résistance (HR), résistance (R), aucune résistance et aucune sensibilité (NRNS), sensibilité (S), sensibilité élevée (HS) et très haute sensibilité (VHS) groupe⁵.

Résultats

Dans ce protocole, le flux de travail schématique a été réalisé sur 48 clones hybrides de peuplier infectés par l’agent pathogène du chancre de la tige C. chrysosperma (Figure 1). Les clones hybrides de peuplier font partie de la descendance d’hybridation de P. deltoides, cultivée en pépinière de l’Académie chinoise de foresterie (CAF), à Pékin.

L’agent pathogène du chancre de la tige C....

Discussion

Ce protocole fournit une méthode d’inoculation rapide et efficace des agents pathogènes résistants au chancre du peuplier, qui convient aux domaines de recherche nécessitant un dépistage à grande échelle de la résistance au chancre du peuplier, tels que la sélection hybride de la résistance au chancre du peuplier et le dépistage de la pathogénicité des agents pathogènes du chancre de la tige.

Le premier point clé de la méthode est d’évalu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum foil	Biosharp	BS-QT-027B
C. chrysosperma isolate	China Forestry Culture Collection Center	CFCC86775	Separation and preservation by our laboratory
Cytospora chrysosperma	Plant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry	NCBI accession number: MK994101 for rRNA-ITS and MN025273 for EF1α gene   CGMCC number:40575	Separation and preservation by our laboratory
Epson Perfection V370 Photo	Epson	V370	Scanner; Scan the leaves into image
PDA (Potato Dextrose Agar)	Solarbio	P8931	Provide nutrition for fungal growth
PE plastic film			To fix fungi on the leaves
Populus alba var. Pyramidalis	Plant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry		Cultivated by our laboratory
SPSS	IBM		Data analysis software
Thermostatic incubator	Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd	KTD-6000	Provide an environment for fungal growth
Tough TG-6 camera	OLYMPUS		To take photos of diseased leaves