JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا للحث على إنتاج الجذور العرضية (ARs) من خلال مسار تلقيح مسببات الأمراض الفطرية لحاء أو حزام البشرة ، وهو مناسب لدراسة بيولوجيا الجذر والعمليات الفسيولوجية المرتبطة بالاستجابة للضوء في الحور.

Abstract

Valsa sordida و Botryosphaeria dothidea هما مسببان للأمراض الفطرية الميتة التي تلحق الضرر بالعديد من المضيفين النباتيين ، وخاصة الأنواع في جنس Populus. يحدث هذان المسببان الفطريان بشكل رئيسي في أغصان الحور والسيقان والأغصان ، مما يسبب أعراضا كلاسيكية مثل آفات الفم وموت المظلة والذبول. تلقيح مسببات الأمراض هو المسار الأكثر فعالية لدراسة آلية أمراض النبات. إلى جانب آفات التقرح حول مواقع التلقيح على السيقان ، لوحظت ظاهرة تنموية جديدة ، وهي جذور عرضية غزيرة (ARs) ذات لون أحمر فاتح ، في أنواع الحور بعد تلقيح مسببات الأمراض الجذعية. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة إحداث ARs باستخدام مسببات الأمراض الفطرية في أشجار الحور. الخطوة الحاسمة لهذه الطريقة هي تلقيح مسببات الأمراض بعد التلاعب (اللحاء أو البشرة). الخطوة الثانية الحاسمة هي تطبيق مادة الترطيب. بالمقارنة مع التلاعب بالترطيب باستخدام Parafilm ، فإن تغليف المواقع الملقحة بغلاف بلاستيكي من البولي إيثيلين المنزلي (PE) يمكن أن ينتج عنه ARs ملونة وعديدة وقوية في غضون 20 يوما بعد التلقيح والحقائق. أخيرا ، نبتت ARs البيضاء من الحلقات الملقحة في سيقان الحور بعد معالجة التظليل (لف السيقان بورق الألمنيوم). تقدم هذه الطريقة نظاما تجريبيا جديدا لدراسة تطور الجذور وتكوين الجذور ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم بيولوجيا تطور الجذور والتشكل والاستجابة تحت إجهاد المرض. علاوة على ذلك ، عند دمجها مع معالجة التظليل ، يمكن أن توفر هذه الدراسة نظاما تجريبيا مناسبا للتحقيق في العمليات المتعلقة بالاستجابة للضوء ، على سبيل المثال ، التخليق الحيوي لمركبات الفلافونويد أو الأنثوسيانين أو المستقلبات الأخرى ذات الصلة والجينات أو عوامل النسخ المشاركة في هذه العمليات.

Introduction

أمراض قرحة جذع الحور التي تسببها مسببات الأمراض الفطرية الميترة ، Valsa sordida و Botryosphaeria dothidea ، هما مرضان حاسمان للأشجار في شمال الصين ألحقا أضرارا بالغة بتطور المزارع البيئية والاقتصادية لأنواع الحور. تحدث أمراض قرحة الحور دائما على لحاء الجذوع والفروع ، في حين أن آفات الفم هي أعراضها النموذجية. بعد ظهور الأمراض ، تسببت آفات الفم المتوسعة في إتلاف اللحاء والكامبيوم ونسيج الخشب تدريجيا للمضيفين. علاوة على ذلك ، أثرت على نقل المنتجات الممتصة والمياه عبر نظام الأوعية الدموية. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح كيف تعيق مسببات الأمراض الآفة نقل اللحاء والخشب الداخلي.

للكشف عن آليات نقل الكربوهيدرات والماء في أشجار الحور المصابة بمسببات الأمراض ، اقترحنا طرق تلقيح اللحاء أو البشرة1،2 ، والتي جمعت بين التلاعب الكلاسيكي بحزام الحديقة وطريقة تلقيح مسببات الأمراض (تلقيح جرح كتلة الفطريات). يمكن لهذه الطرق محاكاة عملية الإصابة وانسداد الماء والكربوهيدرات التي تسببها مسببات الأمراض القرحة.

أوضح بحثنا أن مسببات الأمراض الفطرية تسببت في موت مظلة الحور عن طريق إحداث تجويع الكربون في البداية ، وليس الفشل الهيدروليكي1،3،4،5. والمثير للدهشة أننا لاحظنا وجود جذور خاص على سيقان الحور التي ارتبطت بتلقيح مسببات الأمراض اللاحقة الجذعية: تنمو الجذور العرضية الحمراء الغزيرة (ARs) من الطرف السفلي للسيقان العلوية (مقابل الحافة العلوية لللحاء أو حلقات حزام البشرة). علاوة على ذلك ، أوضحت تجاربنا أن إنتاج ARs عالمي في تفاعل مسببات الأمراض بين الحور والتقرح. يمكن إنتاجها من أنواع الحور أو المستنسخة في أعمار مختلفة (1 أو 2 أو حتى 6 سنوات) ويمكن أن تسببها مسببات الأمراض المختلفة (V. sordida و B. dothidea) أو عزلتها. بالإضافة إلى ذلك ، درسنا آليات ألوان الحور ARs ، وأظهرت النتائج أنها مرتبطة بالتخليق الحيوي للفلافونويد والأنثوسيانين ، بالإضافة إلى تنظيم التعبير الجيني للجينات المرتبطة بالضوء (أو وحدات الجينات) في ظل ظروف الإضاءة6. لذلك ، يمكن استخدام هذه الحور ARs التي تسببها مسببات الأمراض كنظام تجريبي مستقر ومثالي لدراسة التفاعل بين مسببات الأمراض النباتية ، وبيولوجيا الجذر ، ووظيفة الجينات المرتبطة بالضوء والتعبير عنها.

في هذه الدراسة ، سنقدم ونوفر البروتوكول لإنشاء نظام تجريبي للحور ARs من خلال مسار التلقيح الحزاد. علاوة على ذلك ، نشير إلى العوامل الحاسمة التي تؤثر على تكوين ARs ونشرح التطبيق المحتمل للتلقيح الحزامي في دراسة بيولوجيا جذر الحور والعمليات الفسيولوجية الأخرى المتعلقة بالاستجابة للضوء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تحريض الحور ARs من خلال التلقيح

  1. ثقافة مسببات الأمراض الفطرية
    1. قم بإذابة 6 جم من مستخلص البطاطس و 20 جم من سكر العنب و 20 جم من أجار في 1000 مل من الماء لتحضير وسط سكر العنب للبطاطس (PDA). عقم الوسط عند 121.1 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة واسكب الوسط في أطباق بتري (قطرها 9 سم) ، يحتوي كل طبق على حوالي 20 مل من وسط المساعد الرقمي الشخصي.
    2. تلقيح مكعب الفطريات الفطرية المنشط (~ 0.5 سم) في وسط طبق المساعد الشخصي الرقمي بتري.
    3. احتضان ألواح المساعد الشخصي الرقمي الملقحة في الظلام عند 28 درجة مئوية لمدة 7-10 أيام.
    4. قطع وسط المساعد الشخصي الرقمي المحتضن بالفطريات الفطرية إلى أحزمة (عرض 1.2 سم ؛ طول حوالي 3-6 سم).
  2. تحضير مواد الحور
    1. اختر شتلات الحور التي يبلغ عمرها 1-2 سنوات وتنمو بقوة.
    2. اختر السيقان / الفروع الناضجة من شتلات الحور (قطرها 1-2 سم ، خالية من الأمراض والإصابة بالآفات).
    3. اغسل مناطق التلقيح (حوالي 30 سم فوق سطح الأرض أو قاعدة الفروع) من سيقان / فروع الحور ؛ تعقيم السيقان / الفروع بمحلول كحول 75٪.
  3. تحريض ARs من خلال تلقيح حزام اللحاء
    1. قم بربط البشرة واللحاء بعناية من سيقان / فروع الحور المعقمة ، وقم بإزالة حلقات اللحاء المغلقة (بعرض 1 سم ، بما في ذلك الكامبيوم الجزئي) ، وفضح أنسجة الكامبيوم / نسيج الخشب البيضاء الداخلية.
      ملاحظة: الخطوات 1.3.2-1.3.4 توضح بالتفصيل الطرق البديلة للتلقيح.
    2. قم بتغطية منطقة الحزام بالكامل بأشرطة الفطريات (بعرض 1.2 سم) كعلاج تلقيح حزام اللحاء (GP). تواجه الخيوط الفطرية نسيج الخشب المكشوف.
    3. اكشط وقم بإتلاف أنسجة الكامبيوم الداخلية المكشوفة بسكاكين معقمة ، ثم قم بتلقيح أحزمة المساعد الرقمي الشخصي (بعرض 1.2 سم) على مناطق الحزام كعلاج لإزالة الكامبيوم (GR).
    4. تلقيح مناطق الحزام مباشرة باستخدام الأشرطة المتوسطة المساعد الشخصي الرقمي غير المزروعة (بعرض 1.2 سم) كعنصر تحكم في الحزام (GC).
    5. لف السيقان / الفروع الملقحة بشريط تطعيم قابل للتمدد وعديم اللون وشفاف (أو فيلم بلاستيكي PE). لف 4 طبقات للحفاظ على الرطوبة.
    6. اربط السيقان / الفروع الملقحة بأعواد (معدنية أو بلاستيكية أو خشبية) (أكثر من 50 سم) لمنعها من مصدات الرياح.
    7. قم بزراعة مواد الحور المزخرفة بالري المنتظم أثناء التجربة.
    8. راقب من الخارج وسجل تكوين الحور ARs بعد 14-30 يوما من التلقيح.
  4. تحريض ARs من خلال تلقيح الجلد
    1. حدد المواد الملقحة وقم بإعدادها كما هو موضح في الخطوة 1.2.
    2. اربط البشرة بعناية من سيقان / فروع الحور.
    3. قم بإزالة حلقات البشرة (بعرض 1.0 سم) وكشف أنسجة اللحاء الأخضر.
    4. اكشط أنسجة اللحاء قليلا وعموديا أربع مرات وفضح الهيكل الداخلي لللحاء.
    5. تلقيح منطقة البشرة المحاطة بالفطريات الفطرية (eGP) وأشرطة المساعد الرقمي الشخصي (eGC). إجراء عمليات التلاعب بالتلقيح المشابهة للخطوات 1.3.2-1.3.4.
    6. لف السيقان الملقحة بشريط تطعيم (أو فيلم بلاستيكي PE) كما هو موضح في الخطوة 1.3.5.
    7. قم بإدارة أشجار الحور ومراقبة ARs كما هو موضح في الخطوات 1.3.6-1.3.8.

2. إنشاء نظام تجريبي لأبحاث الجينات المرتبطة بالضوء من خلال طريقة التلقيح الحزامي

  1. تحفيز الحور ARs باستخدام طريقة تلقيح حزام اللحاء (الخطوات 1.3.2-1.3.4).
  2. بدلا من ذلك ، قم بتحفيز ARs الحور باستخدام طريقة تلقيح حزام البشرة كما هو موضح في الخطوة 1.4.5.
  3. لف المناطق الملقحة بمسببات الأمراض من سيقان / فروع الحور (ارتفاع 15 سم) بورق الألمنيوم (معالجة التظليل ، S) أو بدون غلاف رقائق الألومنيوم (معالجة الإضاءة ، L).
  4. اربط السيقان / الفروع بأعواد بطول >50 سم لمنعها من مصدات الرياح. قم بزراعة أشجار الحور وإدارتها بانتظام والحفاظ عليها مروية جيدا أثناء التجربة كما هو موضح في الخطوات 1.3.6-1.3.7.
  5. قم بإزالة رقائق الألومنيوم من السيقان في ~ 20 يوما بعد التلقيح.
  6. راقب وصور رقائق الألومنيوم المظللة (S) والحور غير المظللة ARs (L) على الفور.
  7. ازرع الحور المظلل ARs في ضوء الشمس أو مصادر / ظروف الضوء الاصطناعي الأخرى.
  8. قم بإزالة أشرطة التطعيم (أو أغشية PE البلاستيكية) وحصاد الحور ARs في 1-5 أيام بعد التعرض للضوء.
  9. لف جميع عينات AR بورق الألمنيوم. بالنسبة للحور ARs التي خضعت لمعالجة التظليل ، قم بحصاد العينات في الظلام.
  10. انقع عينات AR في النيتروجين السائل وقم بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحقيق.
  11. احصد ARs الحور المكشوفة للضوء أو غير المكشوفة (التي يتم إجراؤها في الظلام) بعد لفها بورق الألمنيوم ، وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية للفحوصات المورفولوجية وغيرها من المقايسات في الموقع .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يظهر في الشكل 1 سير عمل مسببات الأمراض الجذعية التي تحفز الجذور العرضية من خلال التلقيح الحزامي. أظهرت التجارب التي أجريت هنا أن كلا من مسببات الأمراض الجذعية ، V. sordida ، B. dothidea ، وعزلاتها (من مضيفين أو مناطق أو إمراضية مختلفة) يمكن أن تحفز تكوين ARs ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

أنواع الحور مناسبة لإنتاج ARs أو الجذور الجانبية (LRs) من قصاصات الساق ، مما يساهم في تكاثرها وكنموذج لدراسة بيولوجيا الجذر في نباتات الخشب7،8. علاوة على ذلك ، أشارت الأبحاث إلى أن تلقيح الكائنات الحية الدقيقة المحددة ، مثل البكتيريا المفيدة (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث بشكل مشترك من قبل المؤسسة العلمية المركزية للمصلحة العامة ، صندوق البحوث الأساسية التابع للمختبر الرئيسي الحكومي لعلم الوراثة والأشجار (المنحة رقم CAFYBB2020ZY001-2) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 32171776) إلى Jiaping Zhao.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarSolarbioA8190  Provide nutrition for fungal growth
Aluminum foilbiosharpBS-QT-027BTo provide shading for the infected area
Girdling knifeMoGong Hardware tool firmsGirdle the epidermis of poplar stems/branches
Grafting tapeCAPI5cmTo fix fungi on the plants
PD (Potato extraction, Dextrose) SolarbioP7360Provide nutrition for fungal growth
PE plastic filmMiaoJie413703To fix fungi on the plants
Petri dishesBkman biological Co.,Ltd 90mmPrepare the PDA medium
Thermostatic incubatorShanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., LtdKTD-6000Provide an environment for fungal growth

References

  1. Xing, J., et al. Fungal pathogens of canker disease trigger canopy dieback in poplar saplings by inducing functional failure of the phloem and cambium and carbon starvation in the xylem. Physiol Mol Plant Pathol. 101523, 112(2020).
  2. Xing, J., et al. Stem canker pathogen Botryosphaeria dothidea inhibits poplar leaf photosynthesis in the early stage of inoculation. Front Plant Sci. 13, 1008834(2022).
  3. Li, P., et al. Fungal canker pathogens trigger carbon starvation by inhibiting carbon metabolism in poplar stems. Sci Rep. 9, 10111(2019).
  4. Li, J., et al. Effects of Valsa sordida infection on photosynthetic characteristics and carbon-water metabolism in Populus alba var. Pyramidalis. For Res. 34 (05), 58-68 (2021).
  5. Xing, J., et al. Comparisons of photosythetic response and characteristics in leaves of Populus alba var. pyramidalis infected by the stem canker pathogen Valsa sordida and Botryosphaeria dothidea at Early Stage. Scientia Silvae Sinicae. 57 (09), 121-129 (2021).
  6. Li, M. Physiological and molecular mechanisms of adventitious root formation in poplar induced by stem canker pathogens [Master's Thesis]. , Chinese Academy of Forestry. (2023).
  7. Ahkami, A. H. Systems biology of root development in Populus: Review and perspectives. Plant Sci. 335, 111818(2023).
  8. Dickmann, D. I. Silviculture and biology of short-rotation woody crops in temperate regions: then and now. Biomass Bioenergy. 30, 696-705 (2006).
  9. De Almeida, M. R., et al. Environmental control of adventitious rooting in Eucalyptus and Populus cuttings. Trees. 31, 1377-1390 (2017).
  10. Zavattieri, M. A., Ragonezi, C., Klimaszewska, K. Adventitious rooting of conifers: influence of biological factors. Trees. 30, 1021-1032 (2016).
  11. Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World J Microbiol Biotechnol. 28, 1327-1350 (2012).
  12. Khan, Z., et al. Growth enhancement and drought tolerance of hybrid poplar upon inoculation with endophyte consortia. Curr Plant Biol. 6, 38-47 (2016).
  13. Paz, I. C., et al. Eucalyptus growth promotion by endophytic Bacillus spp. Genet Mol Res. 11, 3711-3720 (2012).
  14. Olah, B., Briere, C., Becard, G., Denarie, J., Gough, C. Nod factors and a diffusible factor from arbuscular mycorrhizal fungi stimulate lateral root formation in Medicago truncatula via the DMI1/DMI2 signalling pathway. Plant J. 44, 195-207 (2005).
  15. Maillet, F., et al. Fungal lipochitooligosaccharide symbiotic signals in arbuscular mycorrhiza. Nature. 469, 58-63 (2011).
  16. Felten, J., et al. The ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor stimulates lateral root formation in poplar and Arabidopsis through auxin transport and signaling. Plant Physiol. 151, 1991-2005 (1991).
  17. Splivallo, R., Fischer, U., Gobel, C., Feussner, I., Karlovsky, P. Truffles regulate plant root morphogenesis via the production of auxin and ethylene. Plant Physiol. 150, 2018-2029 (2009).
  18. Druege, U., et al. Molecular and physiological control of adventitious rooting in cuttings: phytohormone action meets resource allocation. Ann Bot. 123, 929-949 (2019).
  19. Steffens, B., Rasmussen, A. The physiology of adventitious roots. Plant Physiol. 170, 603-617 (2016).
  20. Bannoud, F., Bellini, C. Adventitious rooting in Populus species: update and perspectives. Front Plant Sci. 12, 668837(2021).
  21. Li, Y., et al. Signal communication during microbial modulation of root system architecture. J Exp Bot. 75 (2), 526-537 (2024).
  22. Pascale, A., Proietti, S., Pantelides, I. S., Stringlis, I. A. Modulation of the root microbiome by plant molecules: the basis for targeted disease suppression and plant growth promotion. Front Plant Sci. 10, 1741(2020).
  23. Zoratti, L., Karppinen, K., Luengo Escobar, A., Häggman, H., Jaakola, L. Light-controlled flavonoid biosynthesis in fruits. Front Plant Sci. 5, 534(2014).
  24. Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences. Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).
  25. Sorin, C., et al. Auxin and light control of adventitious rooting in Arabidopsis require ARGONAUTE1. Plant Cell. 17 (5), 1343-1359 (2005).
  26. Jung, J. K., McCouch, S. Getting to the roots of it: Genetic and hormonal control of root architecture. Front Plant Sci. 4, 186(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Valsa Sordida Botryosphaeria Dothidea

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved