茎潰瘍病原体によって誘発されるポプラ不定根:根の生物学と光応答関連過程を研究するための実験的システム

要約

ここでは、師部または表皮ガードル真菌病原体接種経路を介して不定根(AR)の産生を誘導するプロトコルを提示します。これは、根の生物学とポプラの光応答関連の生理学的プロセスの研究に適しています。

要約

Valsa sordida と Botryosphaeria dothidea は、多くの植物宿主、特に Populus 属の種に損傷を与える 2 つの重要な壊死性真菌病原体です。これら 2 つの真菌病原体は、主にポプラの枝、茎、小枝に発生し、潰瘍性病変、キャノピーの立ち枯れ、しおれなどの古典的な症状を引き起こします。病原体接種は、植物病害のメカニズムを研究するための最も効率的な経路です。茎の接種部位周辺の潰瘍病変の他に、茎潰瘍病原体接種後のポプラ種では、新たな発生現象である鮮やかな赤色の大量の不定根(AR)が観察されました。本研究では、ポプラの木に真菌病原体を用いてARを誘導する方法について説明しました。この方法の重要なステップは、(師部または表皮)ガードル操作後の病原体接種です。2番目の重要なステップは、保湿素材の塗布です。パラフィルムによる保湿マニピュレーションと比較して、接種部位を家庭用ポリエチレン(PE)ラップで包むと、ガードル接種後20日でカラフルで多数の強固なARを生成することができます。最後に、シェーディング処理(茎をアルミホイルで包む)した後、ポプラ茎の接種リングから白いARが発芽しました。この手法は、根の発生と形態形成を研究するための新しい実験システムを導入し、根の発生、形態形成、および疾患ストレス下での応答の生物学を理解するために重要です。さらに、シェーディング処理と組み合わせることで、この研究は、フラボノイド、アントシアニン、またはその他の関連代謝産物の生合成、およびこれらのプロセスに関与する遺伝子または転写因子など、光応答に関連するプロセスを調べるための便利な実験システムを提供できます。

概要

壊死性真菌病原体である バルサ・ソルディダ と ボツリオスファリア・ドティディアによって引き起こされるポプラ茎潰瘍病は、ポプラ種の生態学的および経済的プランテーションの発展に深刻な損害を与えた中国北部の2つの重要な樹木病です。ポプラ潰瘍病は、常に幹や枝の樹皮に発生しますが、潰瘍性病変が典型的な症状です。疾患の発症後、拡大する潰瘍性病変は、宿主の師部、形成層、および木部に徐々に損傷を与えました。さらに、それらは血管系を通る同化製品と水の輸送に影響を与えました。しかし、潰瘍性病原体がどのように師部と木部の輸送を妨げるかは不明のままです。

潰瘍性病原体に感染したポプラの糖質と水分の輸送機構を明らかにするために、古典的なガーデンガードル操作と病原体接種法(菌糸ブロック創傷接種)を組み合わせた師部または表皮ガードルリング接種法^1,2を提案した。これらの方法は、潰瘍性病原体によって引き起こされる蔓延プロセスと水と炭水化物の閉塞をシミュレートできます。

私たちの研究は、真菌病原体がポプラのキャノピーの立ち枯れを引き起こしたことを示しました 最初に炭素飢餓を誘発することにより、水力障害 1,3,4,5.驚くべきことに、茎潰瘍病原体の接種に関連するポプラ茎の特別な根茎形成が観察されました:大量の赤い不定根(AR)は、上部の茎の下端(師部または表皮ガードルリングリングリングの上端の反対側)から成長します。さらに、私たちの実験は、ARの産生がポプラと潰瘍の病原体の相互作用において普遍的であることを示しました。それらは、さまざまな年齢(1歳、2歳、さらには6歳)のポプラ種またはクローンの種類から生成される可能性があり、さまざまな潰瘍性病原体(V.sordidaおよびB.dothidea)またはそれらの分離株によって引き起こされる可能性があります。また、ポプラARの発色メカニズムについても検討し、フラボノイドやアントシアニンの生合成や、照明条件下での光関連遺伝子(または遺伝子モジュール)の遺伝子発現制御と関連していることを明らかにしました⁶。したがって、病原体によって誘導されるこれらのポプラARは、植物と病原体の相互作用、根の生物学、および光関連遺伝子の機能と発現の研究のための安定した理想的な実験システムとして使用できます。

本研究では、ガードリング接種経路によるポプラARs実験システムを確立するためのプロトコールを紹介・提供する。さらに、ARの形成に影響を与える重要な要因を指摘し、ポプラの根の生物学やその他の光応答関連の生理学的プロセスの研究におけるガードリング接種の潜在的な適用について詳しく説明します。

プロトコル

1. ガードリング接種によるポプラARの誘導

1. 真菌性潰瘍病原体の培養
   1. ジャガイモ抽出物6g、デキストロース20g、寒天20gを1000mLの水に溶かし、ジャガイモデキストロース寒天培地(PDA)を調製します。培地を121.1°Cで30分間滅菌し、各皿に約20mLのPDA培地が入ったシャーレ(直径9cm)に培地を注ぎます。
   2. PDAペトリ皿の中央に活性化した真菌菌糸体キューブ(~0.5cm)を接種します。
   3. 接種したPDAプレートを28°Cの暗所で7〜10日間インキュベートします。
   4. インキュベートしたPDA培地を真菌菌糸体とともにストラップ(幅1.2cm、長さ約3〜6cm)に切ります。
2. ポプラ材の調製
   1. 1〜2歳で、元気に成長しているポプラの苗木を選択します。
   2. ポプラの苗木(直径1〜2 cm、病気や害虫の侵入がない)から成熟した茎/枝を選択します。
   3. ポプラの茎/枝の接種領域(地上または枝の付け根から約30cmの高さ)を洗います。茎/枝を75%アルコール溶液で滅菌します。
3. 師部ガードル接種によるARの誘導
   1. 滅菌したポプラの茎/枝の表皮と師部を慎重にガードルし、ガードルされた師部リング(幅1 cm、部分的な形成層を含む)を取り外し、白い内側の形成層/木部組織を露出させます。
      注:ステップ1.3.2-1.3.4では、接種の代替方法を詳しく説明しています。
   2. 師部ガードル接種(GP)として菌糸体ストラップ(幅1.2cm)でガードル領域を完全に覆います。真菌の菌糸は露出した木部に直面しています。
   3. 露出した内側の形成層組織を滅菌ナイフで削り取って損傷させた後、PDAストラップ(幅1.2cm)をガードルリング領域に接種し、ガードル形成層除去処理(GR)を行います。
   4. ガードルコントロール(GC)として、未培養のPDAミディアムストラップ(幅1.2cm)をガードルリング領域に直接接種します。
   5. 接種した茎/枝を伸縮性があり、無色で透明な接ぎ木テープ(またはPEプラスチックフィルム)で包みます。水分を保つために4層を包みます。
   6. 接種した茎/枝を(金属、プラスチック、または木質の)棒(50 cm以上)で結び、防風林から守ります。
   7. 実験中に定期的な灌漑でガードルポプラ材料を栽培します。
   8. 外部から観察し、接種後14〜30日でポプラARの形成を記録します。
4. 表皮ガードル接種によるARの誘導
   1. ステップ1.2で説明されているように、接種材料を選択して準備します。
   2. ポプラの茎/枝の表皮を慎重に包み込みます。
   3. 表皮リング(幅1.0cm)を取り外し、緑色の師部組織を露出させます。
   4. 師部組織をわずかに垂直に4回こすり落とし、師部の内部構造を露出させます。
   5. ガードル表皮領域に真菌性菌糸体(eGP)とPDAストラップ(eGC)を接種します。手順1.3.2-1.3.4と同様の接種操作を行います。
   6. ステップ1.3.5で説明されているように、接種した茎を接ぎ木テープ(またはPEプラスチックフィルム)で包みます。
   7. ポプラを管理し、手順1.3.6-1.3.8で説明されているようにARを観察します。

2. ガードル接種法による光関連遺伝子研究の実験系の確立

1. 師部ガードルリング接種法(ステップ1.3.2-1.3.4)を使用してポプラARを誘導します。
2. あるいは、ステップ1.4.5で説明したように、表皮ガードリング接種法を使用してポプラARを誘導します。
3. ポプラの茎/枝(高さ15cm)の病原菌接種領域をアルミホイルで包む(遮光処理、S)またはアルミホイルラップなしで包みます(照明処理、L)。
4. 茎/枝を>50cmの長さの棒に結び付けて、防風林から守ります。ポプラを定期的に栽培して管理し、ステップ1.3.6-1.3.7で説明されているように、実験中はポプラを十分に灌漑します。
5. 接種後~20日でステムからアルミホイルをはがします。
6. すぐにアルミホイルの陰影付き(S)と影なしのポプラAR(L)を観察して撮影します。
7. 日陰のポプラARは、日光またはその他の人工光源/条件で栽培します。
8. グラフトテープ(またはPEプラスチックフィルム)をはがし、光にさらされてから1〜5日後にポプラARを収穫します。
9. すべてのARサンプルをアルミホイルで包みます。シェーディング処理を施したポプラARについては、暗所でサンプルを採取します。
10. ARサンプルを液体窒素に浸し、さらに調査するために-80°Cで保存します。
11. 光に曝露したポプラまたは非露光のポプラARをアルミホイルで包んだ後(暗闇で実施)、形態学的およびその他の in situ アッセイのために4°Cで保存します。

結果

ガードリング接種を通じて不定根を誘導する茎潰瘍性病原体のワークフローを 図1に示します。ここで行われた実験では、茎潰瘍性病原体である V.sordida、 B.dothidea、およびそれらの分離株(異なる宿主、地域、または病原性から)の両方が、ポプラ種でARの形成を誘発できることが示されました。このプロトコルでは、 V. sordida ...

ディスカッション

ポプラ種は、茎の挿し木からARまたは側根(LR)を生成する傾向があり、これはそれらの繁殖に貢献し、木の植物で研究する根の生物学のモデルとして貢献しています^7,8。さらに、研究は、有益な細菌(Agrobacterium rhizogenes ^9,10;植物成長促進根茎菌[PGPR]¹¹)、エン?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Solarbio	A8190	Provide nutrition for fungal growth
Aluminum foil	biosharp	BS-QT-027B	To provide shading for the infected area
Girdling knife	MoGong Hardware tool firms		Girdle the epidermis of poplar stems/branches
Grafting tape	CAPI	5cm	To fix fungi on the plants
PD (Potato extraction, Dextrose)	Solarbio	P7360	Provide nutrition for fungal growth
PE plastic film	MiaoJie	413703	To fix fungi on the plants
Petri dishes	Bkman biological Co.,Ltd	90mm	Prepare the PDA medium
Thermostatic incubator	Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd	KTD-6000	Provide an environment for fungal growth