Raízes adventícias de álamo induzidas por patógenos do cancro do caule: um sistema experimental para estudar a biologia das raízes e os processos relacionados à resposta à luz

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a produção de raízes adventícias (ARs) através da via de inoculação de patógenos floemáticos ou epiderme-cintura, que é adequado para o estudo da biologia radicular e dos processos fisiológicos relacionados à resposta à luz em choupo.

Resumo

Valsa sordida e Botryosphaeria dothidea são dois patógenos fúngicos necrotróficos cruciais que danificam muitas plantas hospedeiras, particularmente espécies do gênero Populus. Esses dois patógenos fúngicos ocorrem principalmente em galhos, caules e galhos de choupo, causando sintomas clássicos, como lesões de cancro, morte do dossel e murcha. A inoculação de patógenos é o caminho mais eficiente para estudar o mecanismo da doença das plantas. Além das lesões de cancro ao redor dos locais de inoculação nos caules, um novo fenômeno de desenvolvimento, raízes adventícias abundantes (ARs) com cor vermelha brilhante, foi observado em espécies de choupo após inoculações do patógeno do cancro do caule. Neste estudo, descrevemos o método para induzir ARs usando patógenos fúngicos em choupos. A etapa crucial deste método é a inoculação do patógeno após a manipulação do anelamento (floema ou epiderme). O segundo passo crucial é a aplicação do material hidratante. Em comparação com a manipulação hidratante com Parafilm, o envolvimento dos locais inoculados com filme plástico doméstico de polietileno (PE) pode produzir ARs coloridos, numerosos e robustos em 20 dias após a inoculação do anelamento. Finalmente, ARs brancos brotaram dos anéis inoculados nas hastes de choupo após o tratamento de sombreamento (envolvendo as hastes com papel alumínio). Este método introduz um novo sistema experimental para estudar o desenvolvimento e a morfogênese radicular, que é crucial para a compreensão da biologia do desenvolvimento radicular, morfogênese e resposta sob estresse da doença. Além disso, quando combinado com o tratamento de sombreamento, este estudo pode fornecer um sistema experimental conveniente para investigar processos relacionados à resposta à luz, por exemplo, a biossíntese de flavonóides, antocianinas ou outros metabólitos relacionados e genes ou fatores de transcrição envolvidos nesses processos.

Introdução

As doenças do cancro do caule do choupo causadas por patógenos fúngicos necrotróficos, Valsa sordida e Botryosphaeria dothidea, são as duas doenças cruciais das árvores no norte da China que prejudicaram severamente o desenvolvimento de plantações ecológicas e econômicas de espécies de choupo. As doenças do cancro do choupo sempre ocorrem na casca dos troncos e galhos, enquanto as lesões do cancro são seus sintomas típicos. Após o início das doenças, as lesões de cancro em expansão danificaram progressivamente o floema, o câmbio e o xilema dos hospedeiros. Além disso, eles afetaram o transporte de produtos assimilados e água através do sistema vascular. No entanto, como os patógenos do cancro impedem o transporte do floema e do xilema ainda não está claro.

Para revelar os mecanismos de transporte de carboidratos e água em choupos infectados por patógenos do cancro, propusemos os métodos de inoculação do floema ou da epiderme ^1,2, que combinaram a manipulação clássica da cintura de jardim e o método de inoculação do patógeno (inoculação do bloqueio do micélio). Esses métodos podem simular o processo de infestação e o bloqueio de água e carboidratos induzido por patógenos do cancro.

Nossa pesquisa ilustrou que os patógenos fúngicos causaram a morte do dossel do choupo, induzindo inicialmente a falta de carbono, não a falha hidráulica 1,3,4,5. Surpreendentemente, observamos uma rizogênese especial em caules de choupo que foram associados à inoculação de patógenos do cancro do caule: raízes adventícias vermelhas abundantes (ARs) crescem a partir da extremidade inferior dos caules superiores (oposta à borda superior do floema ou anéis de anelamento da epiderme). Além disso, nossos experimentos ilustraram que a produção de ARs é universal na interação patógeno choupo-cancro. Eles podem ser produzidos a partir de tipos de espécies de choupo ou clones em diferentes idades (1, 2 ou até 6 anos de idade) e podem ser induzidos por diferentes patógenos do cancro (V. sordida e B. dothidea) ou seus isolados. Além disso, estudamos os mecanismos de cor dos ARs de choupo, e os resultados mostraram que ela está associada à biossíntese de flavonóides e antocianinas, bem como à regulação da expressão gênica de genes relacionados à luz (ou módulos gênicos) sob condições de iluminação⁶. Portanto, esses ARs de choupo induzidos por patógenos podem ser usados como um sistema experimental estável e ideal para o estudo da interação planta-patógeno, biologia radicular e a função e expressão de genes relacionados à luz.

Neste estudo, apresentaremos e forneceremos o protocolo para estabelecer um sistema experimental de ARs de álamo por meio da via de inoculação de anel; além disso, apontamos os fatores cruciais que afetam a formação de ARs e expomos a aplicação potencial da inoculação de anelamento no estudo da biologia da raiz do choupo e outros processos fisiológicos relacionados à resposta à luz.

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Protocolo

1. Indução de ARs de choupo por meio de inoculação de anelamento

1. Cultura do patógeno do cancro fúngico
   1. Dissolva 6 g de extrato de batata, 20 g de dextrose e 20 g de ágar em 1000 mL de água para preparar o meio de ágar dextrose de batata (PDA). Esterilizar o meio a 121,1 °C durante 30 min e deitar o meio em placas de Petri (9 cm de diâmetro), cada placa contendo cerca de 20 ml de meio PDA.
   2. Inocular o cubo de micélio fúngico ativado (~0,5 cm) no centro da placa de Petri PDA.
   3. Incubar as placas de PDA inoculadas no escuro a 28 °C durante 7-10 dias.
   4. Corte o meio PDA incubado com micélio fúngico em tiras (1,2 cm de largura; cerca de 3-6 cm de comprimento).
2. Preparação de materiais de choupo
   1. Selecione mudas de choupo de crescimento vigoroso de 1-2 anos.
   2. Selecione caules/ramos maduros de mudas de choupo (1-2 cm de diâmetro, livres de doenças e infestação de pragas).
   3. Lave as regiões de inoculação (cerca de 30 cm de altura acima do solo ou da base dos ramos) dos caules/ramos do choupo; Esterilize os caules/galhos com solução alcoólica a 75%.
3. Indução de ARs por meio de inoculação de anelamento de floema
   1. Circundifique cuidadosamente a epiderme e o floema dos caules/ramos esterilizados do choupo, remova os anéis do floema cingidos (1 cm de largura, incluindo o câmbio parcial) e exponha os tecidos brancos internos do câmbio/xilema.
      NOTA: As etapas 1.3.2-1.3.4 detalham métodos alternativos de inoculação.
   2. Cubra completamente a região do anelamento com tiras de micélio (1,2 cm de largura) como tratamento de inoculação do anelamento do floema (GP). As hifas fúngicas estão voltadas para o xilema exposto.
   3. Raspe e danifique o tecido interno exposto do câmbio com facas esterilizadas e, em seguida, inocule as tiras de PDA (1,2 cm de largura) nas regiões de anelamento como tratamento de remoção de câmbio (GR).
   4. Inocular as regiões de anelamento directamente com as tiras médias de BDA não cultivadas (1,2 cm de largura) como controlo de anelamento (GC).
   5. Enrole os caules/galhos inoculados com fita adesiva elástica, incolor e transparente (ou filme plástico PE). Enrole 4 camadas para manter a umidade.
   6. Amarre os caules/galhos inoculados com palitos (de metal, plástico ou lenhosos) (mais de 50 cm) para evitar quebra-vento.
   7. Cultive os materiais de choupo cingidos com irrigação regular durante o experimento.
   8. Observe de fora e registre a formação de ARs de choupo 14-30 dias após a inoculação.
4. Indução de ARs por meio de anelamento-inoculação de epiderme
   1. Selecionar e preparar os materiais inoculados conforme descrito na etapa 1.2.
   2. Circundilite cuidadosamente a epiderme dos caules/ramos do choupo.
   3. Remova os anéis da epiderme (1,0 cm de largura) e exponha o tecido verde do floema.
   4. Raspe leve e verticalmente o tecido do floema quatro vezes e exponha a estrutura interna do floema.
   5. Inocular a região da epiderme circuncidada com o micélio fúngico (eGP) e tiras de PDA (eGC). Execute manipulações de inoculação semelhantes às etapas 1.3.2-1.3.4.
   6. Envolva as hastes inoculadas com fita adesiva (ou filme plástico PE) conforme descrito na etapa 1.3.5.
   7. Gerencie choupos e observe ARs conforme descrito nas etapas 1.3.6-1.3.8.

2. Estabelecimento de um sistema experimental para a pesquisa de genes relacionados à luz através do método de inoculação de anelamento

1. Induza ARs de choupo usando o método de inoculação de anelamento de floema (etapas 1.3.2-1.3.4).
2. Em alternativa, induzir ARs de choupo utilizando o método de inoculação do anelamento da epiderme, conforme descrito no passo 1.4.5.
3. Envolva as regiões inoculadas com patógenos de caules/galhos de choupo (15 cm de altura) com papel alumínio (tratamento de sombreamento, S) ou sem papel alumínio (tratamento de iluminação, L).
4. Amarre os caules/galhos em palitos de >50 cm de comprimento para mantê-los longe do quebra-vento. Cultive e gerencie os choupos regularmente e mantenha-os bem irrigados durante o experimento, conforme descrito nas etapas 1.3.6 a 1.3.7.
5. Remova a folha de alumínio das hastes ~ 20 dias após a inoculação.
6. Observe e fotografe os ARs de folha de alumínio sombreados (S) e não sombreados (L) imediatamente.
7. Cultive os ARs de choupo sombreados à luz do sol ou outras fontes/condições de luz artificial.
8. Remova as fitas de enxerto (ou filmes plásticos de PE) e colha os ARs de choupo em 1-5 dias após a exposição à luz.
9. Embrulhe todas as amostras de AR com papel alumínio. Para os ARs de choupo submetidos ao tratamento de sombreamento, colha as amostras no escuro.
10. Mergulhe as amostras de AR em nitrogênio líquido e armazene-as a -80 ° C para investigação posterior.
11. Colha os ARs de choupo expostos ou não expostos à luz (conduzidos no escuro) depois de envolvê-los com papel alumínio e armazene-os a 4 ° C para ensaios morfológicos e outros ensaios in situ .

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Resultados

O fluxo de trabalho dos patógenos do cancro do caule que induzem raízes adventícias por meio da inoculação do anelamento é mostrado na Figura 1. Os experimentos aqui conduzidos mostraram que ambos os patógenos do cancro do caule, V. sordida, B. dothidea, e seus isolados (de diferentes hospedeiros, regiões ou patogenicidade) podem induzir a formação de ARs em espécies de choupo. Neste protocolo, usamos isolados de V. sordida

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Discussão

As espécies de choupo são aptas a produzir ARs ou raízes laterais (LRs) a partir de estacas caulinares, o que contribui para sua reprodução e como modelo para o estudo da biologia radicular em plantas madeireiras ^7,8. Além disso, pesquisas indicaram que a inoculação de microrganismos específicos, como bactérias benéficas (Agrobacterium rhizogenes ^9,10;...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Solarbio	A8190	Provide nutrition for fungal growth
Aluminum foil	biosharp	BS-QT-027B	To provide shading for the infected area
Girdling knife	MoGong Hardware tool firms		Girdle the epidermis of poplar stems/branches
Grafting tape	CAPI	5cm	To fix fungi on the plants
PD (Potato extraction, Dextrose)	Solarbio	P7360	Provide nutrition for fungal growth
PE plastic film	MiaoJie	413703	To fix fungi on the plants
Petri dishes	Bkman biological Co.,Ltd	90mm	Prepare the PDA medium
Thermostatic incubator	Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd	KTD-6000	Provide an environment for fungal growth