Adventivwurzeln von Pappeln, die durch Stängelkrebserreger induziert werden: Ein experimentelles System zur Untersuchung der Wurzelbiologie und der Prozesse im Zusammenhang mit der Lichtreaktion

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Induktion der Produktion von Adventivwurzeln (ARs) über den Phloem- oder Epidermisgürtel-Pilzerreger-Impfweg vor, das für die Untersuchung der Wurzelbiologie und der physiologischen Prozesse im Zusammenhang mit der Lichtreaktion in Pappeln geeignet ist.

Zusammenfassung

Valsa sordida und Botryosphaeria dothidea sind zwei wichtige nekrotrophe Pilzpathogene, die viele pflanzliche Wirte schädigen, insbesondere Arten der Gattung Populus. Diese beiden pilzlichen Erreger kommen vor allem in Pappelzweigen, -stämmen und -zweigen vor und verursachen klassische Symptome wie Krebsläsionen, Kronensterben und Welken. Die Impfung mit Krankheitserregern ist der effizienteste Weg, um den Mechanismus von Pflanzenkrankheiten zu untersuchen. Neben den Krebsläsionen um die Inokulationsstellen an den Stängeln wurde bei Pappelarten nach Impfungen mit Stammkrebserregern ein neues Entwicklungsphänomen beobachtet, reichlich Adventivwurzeln (ARs) mit leuchtend roter Farbe. In dieser Studie haben wir die Methode zur Induktion von ARs mit Hilfe von pilzlichen Krankheitserregern in Pappeln beschrieben. Der entscheidende Schritt dieser Methode ist die Inokulation des Erregers nach (Phloem- oder Epidermis-)Gürtelmanipulation. Der zweite entscheidende Schritt ist das Auftragen des feuchtigkeitsspendenden Materials. Im Vergleich zur feuchtigkeitsspendenden Manipulation mit Parafilm kann das Umwickeln der geimpften Stellen mit Haushaltsfolie aus Polyethylen (PE) innerhalb von 20 Tagen nach der Umgürtung und Impfung farbenfrohe, zahlreiche und robuste ARs erzeugen. Schließlich keimten aus den geimpften Ringen in den Pappelstämmen nach der Beschattungsbehandlung (Umwickeln der Stängel mit Aluminiumfolie) weiße ARs. Mit dieser Methode wird ein neuartiges experimentelles System zur Untersuchung der Wurzelentwicklung und Morphogenese eingeführt, das für das Verständnis der Biologie der Wurzelentwicklung, der Morphogenese und der Reaktion auf Krankheitsstress von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus kann diese Studie in Kombination mit einer Beschattungsbehandlung ein geeignetes experimentelles System zur Untersuchung von Prozessen im Zusammenhang mit der Lichtreaktion bieten, beispielsweise der Biosynthese von Flavonoiden, Anthocyanen oder anderen verwandten Metaboliten und Genen oder Transkriptionsfaktoren, die an diesen Prozessen beteiligt sind.

Einleitung

Pappelstammkrebskrankheiten, die durch nekrotrophe Pilzpathogene, Valsa sordida und Botryosphaeria dothidea, verursacht werden, sind die beiden entscheidenden Baumkrankheiten in Nordchina, die die Entwicklung ökologischer und wirtschaftlicher Plantagen von Pappelarten schwer beeinträchtigt haben. Pappelkrebserkrankungen treten immer an der Rinde der Stämme und Äste auf, während Krebsläsionen ihre typischen Symptome sind. Nach dem Ausbruch der Krankheiten schädigten die expandierenden Krebsläsionen nach und nach das Phloem, das Kambium und das Xylem der Wirte. Darüber hinaus beeinflussten sie den Transport von assimilierten Produkten und Wasser durch das Gefäßsystem. Wie die Krebserreger den Phloem- und Xylemtransport behindern, bleibt jedoch unklar.

Um die Transportmechanismen von Kohlenhydraten und Wasser in Pappeln aufzudecken, die von Krebserregern befallen sind, haben wir die Phloem- oder Epidermisgürtel-Inokulationsmethode ^1,2 vorgeschlagen, die die klassische Manipulation des Gartengürtels und die Methode der Erregerinokulation (Myzelia-Block-Wunden-Inokulation) kombiniert. Mit diesen Methoden kann der Befallsprozess und die durch Krebserreger induzierte Verstopfung von Wasser und Kohlenhydraten simuliert werden.

Unsere Forschung zeigte, dass Pilzpathogene das Absterben des Pappelkronendachs verursachten, indem sie zunächst einen Kohlenstoffmangel und nicht ein hydraulisches Versagen induzierten 1,3,4,5. Überraschenderweise haben wir eine besondere Rhizogenese an Pappelstämmen beobachtet, die mit der Inokulation von Stammkrebserregern in Verbindung gebracht wurden: Reichlich rote Adventivwurzeln (ARs) wachsen aus dem unteren Ende der oberen Stängel (gegenüber dem oberen Rand der Phloem- oder Epidermis-Gürtelringe). Darüber hinaus zeigten unsere Experimente, dass die Produktion von ARs bei der Interaktion zwischen Pappel und Krebserregern universell ist. Sie können aus Pappelarten oder Klonen unterschiedlichen Alters (1-, 2- oder sogar 6 Jahre) hergestellt werden und können durch verschiedene Krebspathogene (V. sordida und B. dothidea) oder deren Isolate induziert werden. Darüber hinaus haben wir die Farbmechanismen von Pappel-ARs untersucht, und die Ergebnisse zeigten, dass sie mit der Biosynthese von Flavonoiden und Anthocyanen sowie mit der Regulation der Genexpression von lichtbezogenen Genen (oder Genmodulen) unter Lichtbedingungen verbunden ist⁶. Daher können diese durch Krankheitserreger induzierten Pappel-ARs als stabiles und ideales experimentelles System für die Untersuchung der Pflanzen-Pathogen-Interaktion, der Wurzelbiologie und der Funktion und Expression lichtbezogener Gene verwendet werden.

In dieser Studie werden wir das Protokoll zur Etablierung eines experimentellen Systems für Pappel-ARs durch einen Gürtel-Impfweg vorstellen und bereitstellen. Darüber hinaus weisen wir auf die entscheidenden Faktoren hin, die die Bildung von ARs beeinflussen, und erläutern die mögliche Anwendung der Gürtelimpfung bei der Erforschung der Biologie der Pappelwurzel und anderer physiologischer Prozesse, die mit der Lichtreaktion zusammenhängen.

Protokoll

1. Induktion von Pappel-ARs durch Gürtung-Inokulation

1. Kultur von Pilzkrebserregern
   1. Lösen Sie 6 g Kartoffelextrakt, 20 g Dextrose und 20 g Agar in 1000 ml Wasser auf, um das Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)-Medium herzustellen. Sterilisieren Sie das Medium 30 Minuten lang bei 121,1 °C und gießen Sie das Medium in Petrischalen (9 cm Durchmesser), wobei jede Schale etwa 20 ml PDA-Medium enthält.
   2. Beimpfen Sie den aktivierten Pilzmyzelwürfel (~0,5 cm) in der Mitte der PDA-Petrischale.
   3. Inkubieren Sie die inokulierten PDA-Platten im Dunkeln bei 28 °C für 7-10 Tage.
   4. Schneiden Sie das inkubierte PDA-Medium mit Pilzmyzel in Streifen (1,2 cm breit; ca. 3-6 cm lang).
2. Aufbereitung von Pappelmaterialien
   1. Wählen Sie 1-2 Jahre alte, kräftig wachsende Pappelsetzlinge aus.
   2. Wählen Sie reife Stängel/Zweige von Pappelsetzlingen (1-2 cm Durchmesser, frei von Krankheiten und Schädlingsbefall).
   3. Waschen Sie die Impfbereiche (ca. 30 cm hoch über dem Boden oder der Basis der Äste) von Pappelstängeln/-ästen; Die Stängel/Zweige mit 75%iger Alkohollösung sterilisieren.
3. Induktion von ARs durch Phloem-Girdling-Inokulation
   1. Umgürten Sie vorsichtig die Epidermis und das Phloem der sterilisierten Pappelstängel/-äste, entfernen Sie die umgürteten Phloemringe (1 cm breit, einschließlich teilweisem Kambium) und legen Sie das weiße, innere Kambium-/Xylemgewebe frei.
      HINWEIS: In den Schritten 1.3.2-1.3.4 werden alternative Impfmethoden beschrieben.
   2. Decken Sie den Gürtelbereich vollständig mit Myzelbändern (1,2 cm breit) als Phloemgürtel-Inokulationsbehandlung (GP) ab. Die Pilzhyphen sind dem freigelegten Xylem zugewandt.
   3. Kratzen und beschädigen Sie das freiliegende innere Kambiumgewebe mit sterilisierten Messern und impfen Sie dann die PDA-Bänder (1,2 cm breit) an den Gürtelbereichen als Gürtelkambiumentfernungsbehandlung (GR).
   4. Beimpfen Sie die Gürtelregionen direkt mit den unkultivierten PDA Medium Straps (1,2 cm Breite) als Gürtelkontrolle (GC).
   5. Wickeln Sie die beimpften Stängel/Zweige mit dehnbarem, farblosem und transparentem Pfropfband (oder PE-Plastikfolie) ein. Wickeln Sie 4 Schichten ein, um die Feuchtigkeit im Inneren zu halten.
   6. Binden Sie die geimpften Stängel/Zweige mit (Metall-, Plastik- oder holzigen) Stäben (über 50 cm) zusammen, um sie vor Windschutz zu schützen.
   7. Kultivieren Sie das umgürtete Pappelmaterial mit regelmäßiger Bewässerung während des Experiments.
   8. Beobachten Sie von außen und notieren Sie die Bildung von Pappel-ARs 14-30 Tage nach der Inokulation.
4. Induktion von ARs durch Epidermisgürtel-Inokulation
   1. Inokulierte Materialien auswählen und vorbereiten, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
   2. Die Epidermis von Pappelstämmen/-zweigen vorsichtig umgürten.
   3. Entfernen Sie die Epidermisringe (1,0 cm breit) und legen Sie das grüne Phloemgewebe frei.
   4. Kratzen Sie das Phloemgewebe viermal leicht und senkrecht ab und legen Sie die innere Struktur des Phloems frei.
   5. Beimpfen Sie die umgürtete Epidermisregion mit den Pilzmyzel- (eGP) und PDA-Bändern (eGC). Führen Sie Impfmanipulationen ähnlich wie in den Schritten 1.3.2-1.3.4 durch.
   6. Wickeln Sie die beimpften Stängel mit Pfropfband (oder PE-Plastikfolie) ein, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.
   7. Verwalten Sie Pappeln und beobachten Sie ARs, wie in den Schritten 1.3.6-1.3.8 beschrieben.

2. Etablierung eines experimentellen Systems zur Erforschung lichtbezogener Gene durch Girdling-Inokulationsmethode

1. Induzieren Sie Pappel-ARs mit der Phloem-Gürtel-Inokulationsmethode (Schritte 1.3.2-1.3.4).
2. Alternativ können Pappel-ARs mit der in Schritt 1.4.5 beschriebenen Epidermis-Gürtel-Inokulationsmethode induziert werden.
3. Wickeln Sie die mit Krankheitserregern beimpften Bereiche von Pappelstämmen/-ästen (15 cm hoch) mit Alufolie (Beschattungsbehandlung, S) oder ohne Alufolienfolie (Beleuchtungsbehandlung, L) ein.
4. Binden Sie die Stängel/Zweige an >50 cm lange Stäbe, damit sie vor Windschutz geschützt sind. Kultivieren und bewirtschaften Sie die Pappeln regelmäßig und halten Sie sie während des Versuchs gut bewässert, wie in den Schritten 1.3.6-1.3.7 beschrieben.
5. Entfernen Sie die Alufolie ~20 Tage nach der Inokulation von den Stielen.
6. Beobachten und fotografieren Sie sofort die schattierten (S) und unschattierten Pappel-ARs (L) aus Aluminiumfolie.
7. Kultivieren Sie die beschatteten Pappel-ARs im Sonnenlicht oder anderen künstlichen Lichtquellen/Bedingungen.
8. Entfernen Sie die Pfropfbänder (oder PE-Kunststofffolien) und ernten Sie die Pappel-ARs 1-5 Tage nach der Lichteinwirkung.
9. Wickeln Sie alle AR-Proben mit Alufolie ein. Für die Pappel-ARs, die einer Beschattungsbehandlung unterzogen wurden, ernten Sie die Proben im Dunkeln.
10. Weichen Sie die AR-Proben in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei -80 °C für weitere Untersuchungen.
11. Die lichtexponierten oder nicht belichteten Pappel-ARs (im Dunkeln durchgeführt) werden geerntet, nachdem sie mit Aluminiumfolie umwickelt wurden, und lagern Sie sie bei 4 °C für morphologische und andere In-situ-Analysen .

Ergebnisse

Der Arbeitsablauf von Stammkrebserregern, die durch Gürtelinokulation Adventivwurzeln induzieren, ist in Abbildung 1 dargestellt. Die hier durchgeführten Experimente zeigten, dass sowohl die Stammkrebserreger V. sordida, B. dothidea als auch ihre Isolate (aus verschiedenen Wirten, Regionen oder Pathogenitäten) die Bildung von ARs bei Pappelarten induzieren können. In diesem Protokoll verwendeten wir die V . sordida-Isolate CZC,...

Diskussion

Pappelarten sind in der Lage, ARs oder Seitenwurzeln (LRs) aus Stängelstecklingen zu produzieren, was zu ihrer Fortpflanzung beiträgt und als Modell für die Erforschung der Wurzelbiologie bei Holzpflanzen dient ^7,8. Darüber hinaus deutete die Forschung darauf hin, dass die Inokulation spezifischer Mikroorganismen, wie z. B. nützlicher Bakterien (Agrobacterium rhizogenes ^9,10

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Solarbio	A8190	Provide nutrition for fungal growth
Aluminum foil	biosharp	BS-QT-027B	To provide shading for the infected area
Girdling knife	MoGong Hardware tool firms		Girdle the epidermis of poplar stems/branches
Grafting tape	CAPI	5cm	To fix fungi on the plants
PD (Potato extraction, Dextrose)	Solarbio	P7360	Provide nutrition for fungal growth
PE plastic film	MiaoJie	413703	To fix fungi on the plants
Petri dishes	Bkman biological Co.,Ltd	90mm	Prepare the PDA medium
Thermostatic incubator	Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd	KTD-6000	Provide an environment for fungal growth