שורשי צפצפה הרפתקניים המושרים על ידי פתוגנים של אפטות גזע: מערכת ניסויית לחקר ביולוגיה של שורשים ותהליכים הקשורים לתגובת אור

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגרימת ייצור שורשים הרפתקניים (ARs) דרך מסלול חיסון פתוגן פטרייתי של חגורת הפלום או האפידרמיס, המתאים לחקר הביולוגיה של השורשים והתהליכים הפיזיולוגיים הקשורים לתגובת האור בצפצפה.

Abstract

Valsa sordida ו-Botryosphaeria dothidea הם שני פתוגנים פטרייתיים נקרוטרופיים חיוניים הפוגעים בצמחים פונדקאים רבים, במיוחד מינים בסוג Populus. שני פתוגנים פטרייתיים אלה מופיעים בעיקר בענפי צפצפה, גבעולים וזרדים, וגורמים לתסמינים קלאסיים כמו נגעי אפטות, גסיסת חופה ונבול. חיסון פתוגנים הוא המסלול היעיל ביותר לחקר המנגנון של מחלות צמחים. מלבד נגעי האפטה סביב אתרי החיסון על הגבעולים, תופעה התפתחותית חדשה, שורשים הרפתקניים רבים (ARs) עם צבע אדום בוהק, נצפתה במיני צפצפה לאחר חיסונים נגד אפטות גזע. במחקר זה, תיארנו את השיטה להשראת ARs באמצעות פתוגנים פטרייתיים בעצי צפצפה. השלב המכריע בשיטה זו הוא חיסון הפתוגן לאחר מניפולציה של חגורות (פלום או אפידרמיס). השלב המכריע השני הוא מריחת חומר הלחות. בהשוואה למניפולציה של לחות עם Parafilm, עטיפת האתרים המחוסנים בניילון פוליאתילן ביתי (PE) יכולה לייצר ARs צבעוניים, רבים וחזקים תוך 20 יום לאחר החיסון. לבסוף, ARs לבנים נבטו מהטבעות המחוסנות בגבעולי הצפצפה לאחר טיפול הצללה (עטיפת הגבעולים בנייר אלומיניום). שיטה זו מציגה מערכת ניסויית חדשה לחקר התפתחות שורשים ומורפוגנזה, שהיא חיונית להבנת הביולוגיה של התפתחות שורשים, מורפוגנזה ותגובה תחת עקת מחלה. יתר על כן, בשילוב עם טיפול הצללה, מחקר זה יכול לספק מערכת ניסויית נוחה לחקירת תהליכים הקשורים לתגובת אור, למשל, ביוסינתזה של פלבנואידים, אנתוציאנינים או מטבוליטים קשורים אחרים, וגנים או גורמי שעתוק המעורבים בתהליכים אלה.

Introduction

מחלות אפטות גזע צפצפה הנגרמות על ידי פתוגנים פטרייתיים נקרוטרופיים, Valsa sordida ו-Botryosphaeria dothidea, הן שתי מחלות העצים החיוניות בצפון סין שפגעו קשות בפיתוח מטעים אקולוגיים וכלכליים של מיני צפצפה. מחלות אפטות צפצפה מופיעות תמיד על קליפת הגזעים והענפים, בעוד שנגעי אפטות הם הסימפטומים האופייניים להן. לאחר הופעת המחלות, נגעי האפטה המתרחבים פגעו בהדרגה בפלום, בקמביום ובקסילם של המארחים. יתר על כן, הם השפיעו על הובלת מוצרים מוטמעים ומים דרך מערכת כלי הדם. עם זאת, כיצד פתוגנים של אפטות מעכבים את הובלת הפלום והקסילם נותר לא ברור.

כדי לחשוף את מנגנוני ההובלה של פחמימות ומים בצפצפה הנגועה בפתוגנים של אפטות, הצענו את שיטות החיסון של חגורת הלחם או האפידרמיס ^1,2, ששילבו מניפולציה קלאסית של חגורת הגינה ושיטת חיסון פתוגנים (חיסון פצעי חסימת תפטיר). שיטות אלו יכולות לדמות את תהליך ההתפשטות ואת חסימת המים והפחמימות הנגרמת על ידי פתוגנים של אפטות.

המחקר שלנו הראה כי פתוגנים פטרייתיים גרמו למות חופת הצפצפה על ידי גרימת רעב פחמן בהתחלה, ולא כשל הידראולי 1,3,4,5. באופן מפתיע, ראינו ריזוגנזה מיוחדת על גבעולי צפצפה שהיו קשורים לחיסון של פתוגנים של אפטות גזע: שורשים אדומים אדומים שופעים (ARs) צומחים מהקצה התחתון של הגבעולים העליונים (בניגוד לקצה העליון של טבעות הלחגור או האפידרמיס). יתר על כן, הניסויים שלנו הראו כי ייצור ARs הוא אוניברסלי באינטראקציה בין צפצפה לאפטה. הם יכולים להיות מיוצרים מסוגים של מיני צפצפה או שיבוטים בגילאים שונים (בני שנה, שנתיים או אפילו 6 שנים) ויכולים להיגרם על ידי אפטות שונות (V. sordida ו-B. dothidea) או המבודדים שלהם. בנוסף, חקרנו את מנגנוני הצבע של ARs צפצפה, והתוצאות הראו שהוא קשור לביוסינתזה של פלבנואידים ואנתוציאנינים, כמו גם לוויסות ביטוי גנים של גנים הקשורים לאור (או מודולי גנים) בתנאי תאורה⁶. לכן, ARs צפצפה אלה המושרים על ידי פתוגנים יכולים לשמש כמערכת ניסויית יציבה ואידיאלית לחקר אינטראקציה בין צמח לפתוגן, ביולוגיה של שורשים ותפקוד וביטוי של גנים הקשורים לאור.

במחקר זה, נציג ונספק את הפרוטוקול להקמת מערכת ניסויית ARs צפצפה באמצעות מסלול חיסון חגורה; יתר על כן, אנו מצביעים על הגורמים המכריעים המשפיעים על היווצרות ARs ומסבירים על היישום הפוטנציאלי של חיסון החגורה בחקר הביולוגיה של שורשי הצפצפה ותהליכים פיזיולוגיים אחרים הקשורים לתגובת אור.

Protocol

1. אינדוקציה של ARs צפצפה באמצעות חיסון חגורה

1. תרבית של פתוגן אפטות פטרייתיות
   1. ממיסים 6 גרם תמצית תפוחי אדמה, 20 גרם דקסטרוז ו -20 גרם אגר במים של 1000 מ"ל להכנת מדיום אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA). מעקרים את המדיום בחום של 121.1 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ויוצקים את המדיום לצלחות פטרי (קוטר 9 ס"מ), כל צלחת מכילה כ -20 מ"ל מדיום PDA.
   2. חסנו את קוביית התפטיר הפטרייתי המופעלת (~0.5 ס"מ) במרכז צלחת פטרי PDA.
   3. דגרו את לוחות ה-PDA המחוסנים בחושך בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 7-10 ימים.
   4. חותכים את מדיום ה- PDA המודגר עם תפטיר פטרייתי לרצועות (רוחב 1.2 ס"מ; אורך של כ 3-6 ס"מ).
2. הכנת חומרי צפצפה
   1. בחר שתילי צפצפה בני 1-2 שנים, הגדלים נמרצות.
   2. בחר גבעולים/ענפים בוגרים משתילי צפצפה (קוטר 1-2 ס"מ, נקיים ממחלות ומזיקים).
   3. שטפו את אזורי החיסון (בגובה של כ-30 ס"מ מעל פני הקרקע או בסיס הענפים) מגבעולים/ענפי צפצפה; עקרו את הגבעולים/הענפים בתמיסת אלכוהול של 75%.
3. אינדוקציה של ARs באמצעות חיסון חגורת פלואם
   1. חגרו בזהירות את האפידרמיס והפלום של גבעולים/ענפי צפצפה מעוקרים, הסירו את טבעות הפלום החגורות (רוחב 1 ס"מ, כולל קמביום חלקי), וחשפו את רקמות הקמביום/קסילם הפנימיות הלבנות.
      הערה: שלבים 1.3.2-1.3.4 מפרטים שיטות חיסון חלופיות.
   2. יש לכסות לחלוטין את אזור החגורה ברצועות תפטיר (ברוחב 1.2 ס"מ) כטיפול בחיסון חגורת פלואם (GP). קורי הפטרייה פונים אל הקסילם החשוף.
   3. מגרדים ופוגעים ברקמת הקמביום הפנימית החשופה בעזרת סכינים מעוקרות, ולאחר מכן מחסנים את רצועות ה-PDA (ברוחב 1.2 ס"מ) על אזורי החגורה כטיפול להסרת קמביום חגורה (GR).
   4. חסנו את אזורי החגורה ישירות עם רצועות ה-PDA הבינוניות הלא מתורבתות (רוחב 1.2 ס"מ) כבקרת חגורה (GC).
   5. עטפו את הגבעולים/הענפים המחוסנים בסרט השתלה נמתח, חסר צבע ושקוף (או סרט פלסטיק PE). יש לעטוף 4 שכבות כדי לשמור על הלחות.
   6. קשרו את הגבעולים/הענפים המחוסנים במקלות (מתכת, פלסטיק או עץ) (מעל 50 ס"מ) כדי למנוע מהם לשבור רוח.
   7. טפחו את חומרי הצפצפה החגורים בהשקיה קבועה במהלך הניסוי.
   8. התבונן מבחוץ ורשום את היווצרות הצפצפה 14-30 יום לאחר החיסון.
4. אינדוקציה של ARs באמצעות חיסון אפידרמיס
   1. בחר והכן חומרים מחוסנים כמתואר בשלב 1.2.
   2. חגרו בזהירות את האפידרמיס של גבעולים/ענפי צפצפה.
   3. הסר את טבעות האפידרמיס (רוחב 1.0 ס"מ) וחשוף את רקמת הפלומה הירוקה.
   4. מגרדים מעט ואנכית את רקמת הפלום ארבע פעמים וחושפים את המבנה הפנימי של הפלום.
   5. חסנו את אזור האפידרמיס החגורה עם התפטיר הפטרייתי (eGP) ורצועות PDA (eGC). בצע מניפולציות חיסון בדומה לשלבים 1.3.2-1.3.4.
   6. עטפו את הגבעולים המחוסנים בנייר דבק (או סרט פלסטיק PE) כמתואר בשלב 1.3.5.
   7. נהל צפצפה והתבונן ב-ARs כמתואר בשלבים 1.3.6-1.3.8.

2. הקמת מערכת ניסויית לחקר גנים הקשורים לאור בשיטת חיסון חגורה

1. לגרום ל-ARs צפצפה בשיטת החיסון של חגורת הפלום (שלבים 1.3.2-1.3.4).
2. לחלופין, לגרום ל-ARs צפצפה באמצעות שיטת החיסון של חגורת האפידרמיס כמתואר בשלב 1.4.5.
3. עטפו את האזורים המחוסנים בפתוגן של גבעולים/ענפי צפצפה (15 ס"מ גובה) בנייר אלומיניום (טיפול הצללה, S) או ללא עטיפת נייר אלומיניום (טיפול תאורה, L).
4. קושרים את הגבעולים/ענפים למקלות באורך >50 ס"מ כדי למנוע מהם לשבור רוח. טפחו ונהלו את הצפצפה באופן קבוע ושמרו עליהן מושקות היטב במהלך הניסוי כמתואר בשלבים 1.3.6-1.3.7.
5. הסר את נייר האלומיניום מהגבעולים ~ 20 יום לאחר החיסון.
6. התבונן וצלם מיד את רדיד האלומיניום המוצלל (S) ואת הצפצפה הלא מוצלת (L).
7. טפחו את הצפצפה המוצלת באור השמש או במקורות/תנאי אור מלאכותיים אחרים.
8. הסר את סרטי ההשתלה (או סרטי פלסטיק PE) וקצור את ה-ARs של הצפצפה 1-5 ימים לאחר החשיפה לאור.
9. עטפו את כל דגימות ה- AR בנייר אלומיניום. עבור הצפצפה שעברו טיפול הצללה, קצרו את הדגימות בחושך.
10. השרו את דגימות ה-AR בחנקן נוזלי ואחסנו אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס להמשך חקירה.
11. קצרו את ה-ARs של הצפצפה החשופים לאור או הלא חשופים (שנערכו בחושך) לאחר עטיפתם בנייר אלומיניום, ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לבדיקות מורפולוגיות ואחרות באתרן .

תוצאות

זרימת העבודה של פתוגנים של אפטות גזע המעוררות שורשים הרפתקניים באמצעות חיסון חגורה מוצגת באיור 1. הניסויים שנערכו כאן הראו שגם פתוגנים של אפטות גזע, V. sordida, B . dothidea, וגם המבודדים שלהם (מפונדקאים שונים, אזורים או פתוגניות שונים) יכולים לגרום להיווצ...

Discussion

מיני צפצפה נוטים לייצר ARs או שורשים רוחביים (LRs) מגזרי גזע, מה שתורם להתרבות שלהם וכמודל לביולוגיה של שורשים בחקר צמחי עץ ^7,8. יתר על כן, מחקרים הצביעו על כך שחיסון של מיקרואורגניזמים ספציפיים, כגון חיידקים מועילים (Agrobacterium rhizogenes

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Solarbio	A8190	Provide nutrition for fungal growth
Aluminum foil	biosharp	BS-QT-027B	To provide shading for the infected area
Girdling knife	MoGong Hardware tool firms		Girdle the epidermis of poplar stems/branches
Grafting tape	CAPI	5cm	To fix fungi on the plants
PD (Potato extraction, Dextrose)	Solarbio	P7360	Provide nutrition for fungal growth
PE plastic film	MiaoJie	413703	To fix fungi on the plants
Petri dishes	Bkman biological Co.,Ltd	90mm	Prepare the PDA medium
Thermostatic incubator	Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd	KTD-6000	Provide an environment for fungal growth