Racines adventives du peuplier induites par des agents pathogènes du chancre de la tige : un système expérimental pour étudier la biologie des racines et les processus liés à la réponse à la lumière

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour induire la production de racines adventives (RA) par la voie d’inoculation d’agents pathogènes fongiques du phloème ou de l’épiderme, qui convient à l’étude de la biologie des racines et des processus physiologiques liés à la réponse à la lumière chez le peuplier.

Résumé

Valsa sordida et Botryosphaeria dothidea sont deux agents pathogènes fongiques nécrotrophes cruciaux qui endommagent de nombreux hôtes végétaux, en particulier les espèces du genre Populus. Ces deux agents pathogènes fongiques se produisent principalement dans les branches, les tiges et les brindilles du peuplier, provoquant des symptômes classiques tels que des lésions de chancre, le dépérissement du couvert forestier et le flétrissement. L’inoculation d’agents pathogènes est la voie la plus efficace pour étudier le mécanisme des maladies des plantes. Outre les lésions du chancre autour des sites d’inoculation sur les tiges, un nouveau phénomène de développement, des racines adventives abondantes (RA) de couleur rouge vif, ont été observées chez les espèces de peupliers après l’inoculation d’agents pathogènes du chancre de la tige. Dans cette étude, nous avons décrit la méthode d’induction des AR à l’aide d’agents pathogènes fongiques chez les peupliers. L’étape cruciale de cette méthode est l’inoculation de l’agent pathogène après manipulation de l’annelage (phloème ou épiderme). La deuxième étape cruciale est l’application de la matière hydratante. Par rapport à la manipulation hydratante avec Parafilm, l’emballage des sites inoculés avec une pellicule plastique en polyéthylène (PE) ménager peut produire des AR colorés, nombreux et robustes dans les 20 jours suivant l’inoculation d’annelage. Enfin, des AR blancs ont germé à partir des anneaux inoculés dans les tiges de peuplier après un traitement d’ombrage (enveloppement des tiges avec une feuille d’aluminium). Cette méthode introduit un nouveau système expérimental pour étudier le développement des racines et la morphogenèse, ce qui est crucial pour comprendre la biologie du développement des racines, de la morphogenèse et de la réponse en cas de stress pathologique. De plus, lorsqu’elle est combinée à un traitement d’ombrage, cette étude peut fournir un système expérimental pratique pour étudier les processus liés à la réponse à la lumière, par exemple, la biosynthèse des flavonoïdes, des anthocyanes ou d’autres métabolites apparentés, et des gènes ou des facteurs de transcription impliqués dans ces processus.

Introduction

Les maladies du chancre de la tige du peuplier causées par des agents pathogènes fongiques nécrotrophes, Valsa sordida et Botryosphaeria dothidea, sont les deux maladies cruciales des arbres dans le nord de la Chine qui ont gravement endommagé le développement des plantations écologiques et économiques d’espèces de peupliers. Les maladies du chancre du peuplier se produisent toujours sur l’écorce des troncs et des branches, tandis que les lésions du chancre sont leurs symptômes typiques. Après l’apparition de maladies, les lésions du chancre en expansion ont progressivement endommagé le phloème, le cambium et le xylème des hôtes. De plus, ils ont affecté le transport des produits assimilés et de l’eau à travers le système vasculaire. Cependant, la façon dont les agents pathogènes du chancre entravent le transport du phloème et du xylème n’est pas claire.

Pour mettre en évidence les mécanismes de transport des glucides et de l’eau chez les peupliers infectés par des pathogènes du chancre, nous avons proposé les méthodes d’inoculation du phloème ou de l’épiderme ^1,2, qui combinaient la manipulation classique de la ceinture de jardin et la méthode d’inoculation des agents pathogènes (inoculation par lésions de blocs de mycélium). Ces méthodes peuvent simuler le processus d’infestation et le blocage de l’eau et des glucides induit par les agents pathogènes du chancre.

Nos recherches ont montré que les agents pathogènes fongiques ont causé le dépérissement du couvert forestier des peupliers en induisant initialement une carence en carbone, et non une défaillance hydraulique 1,3,4,5. Étonnamment, nous avons observé une rhizogenèse particulière sur les tiges de peuplier qui ont été associées à l’inoculation d’agents pathogènes du chancre de la tige : d’abondantes racines adventives rouges (RA) poussent à partir de l’extrémité inférieure des tiges supérieures (à l’opposé du bord supérieur des anneaux d’annelage du phloème ou de l’épiderme). De plus, nos expériences ont montré que la production de RA est universelle dans l’interaction entre les agents pathogènes du peuplier et du chancre. Ils peuvent être produits à partir d’espèces de peupliers ou de clones à différents âges (1, 2 ou même 6 ans) et peuvent être induits par différents agents pathogènes du chancre (V. sordida et B. dothidea) ou leurs isolats. De plus, nous avons étudié les mécanismes de couleur des AR du peuplier, et les résultats ont montré qu’il est associé à la biosynthèse des flavonoïdes et des anthocyanes, ainsi qu’à la régulation de l’expression génique des gènes liés à la lumière (ou modules de gènes) dans des conditions d’éclairage⁶. Par conséquent, ces AR de peuplier induits par des agents pathogènes peuvent être utilisés comme un système expérimental stable et idéal pour l’étude de l’interaction plante-pathogène, de la biologie des racines et de la fonction et de l’expression des gènes liés à la lumière.

Dans cette étude, nous présenterons et fournirons le protocole permettant d’établir un système expérimental d’ARs de peuplier par voie d’inoculation par annelage ; de plus, nous soulignons les facteurs cruciaux qui affectent la formation des AR et exposons l’application potentielle de l’inoculation d’annelage dans l’étude de la biologie de la racine de peuplier et d’autres processus physiologiques liés à la réponse lumineuse.

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Protocole

1. Induction des AR du peuplier par inoculation par annelage

1. Culture d’un agent pathogène fongique du chancre
   1. Dissoudre 6 g d’extrait de pomme de terre, 20 g de dextrose et 20 g de gélose dans 1000 ml d’eau pour préparer le milieu de gélose au dextrose de pomme de terre. Stérilisez le milieu à 121,1 °C pendant 30 min et versez le milieu dans des boîtes de Pétri (9 cm de diamètre), chaque boîte contenant environ 20 ml de milieu PDA.
   2. Inoculez le cube de mycélium fongique activé (~0,5 cm) au centre de la boîte de Pétri PDA.
   3. Incuber les plaques de PDA inoculées dans l’obscurité à 28 °C pendant 7 à 10 jours.
   4. Coupez le milieu PDA incubé avec du mycélium fongique en lanières (1,2 cm de largeur ; environ 3 à 6 cm de longueur).
2. Préparation des matériaux en peuplier
   1. Choisissez des jeunes peupliers de 1 à 2 ans à croissance vigoureuse.
   2. Choisissez des tiges ou des branches matures de jeunes peupliers (de 1 à 2 cm de diamètre, exemptes de maladies et d’infestations de ravageurs).
   3. Laver les régions d’inoculation (environ 30 cm de hauteur au-dessus du sol ou de la base des branches) des tiges/branches de peuplier ; Stérilisez les tiges/branches avec une solution d’alcool à 75 %.
3. Induction des AR par inoculation par annelage du phloème
   1. Ceinturez soigneusement l’épiderme et le phloème des tiges/branches de peuplier stérilisées, retirez les anneaux de phloème annelés (1 cm de largeur, y compris le cambium partiel) et exposez les tissus internes blancs du cambium/xylème.
      REMARQUE : Les étapes 1.3.2 à 1.3.4 détaillent les autres méthodes d’inoculation.
   2. Couvrir complètement la région d’annelage avec des sangles de mycélium (1,2 cm de largeur) comme traitement d’inoculation par l’annelage du phloème (GP). Les hyphes fongiques font face au xylème exposé.
   3. Gratter et endommager le tissu interne du cambium exposé à l’aide de couteaux stérilisés, puis inoculer les sangles de la PDA (1,2 cm de largeur) sur les régions d’annelage en tant que traitement d’élimination du cambium (GR).
   4. Inoculer les régions d’annelage directement avec les sangles moyennes PDA non cultivées (1,2 cm de largeur) comme contrôle d’annelage (GC).
   5. Enveloppez les tiges/branches inoculées avec du ruban adhésif extensible, incolore et transparent (ou un film plastique PE). Enroulez 4 couches pour garder l’humidité à l’intérieur.
   6. Attachez les tiges/branches inoculées avec des bâtonnets (métalliques, plastiques ou ligneux) (plus de 50 cm) pour les protéger du brise-vent.
   7. Cultivez les matériaux de peuplier annelé avec une irrigation régulière pendant l’expérience.
   8. Observer de l’extérieur et noter la formation des AR du peuplier 14 à 30 jours après l’inoculation.
4. Induction des AR par l’inoculation de l’épiderme
   1. Sélectionner et préparer le matériel inoculé comme décrit à l’étape 1.2.
   2. Ceinturez soigneusement l’épiderme des tiges/branches de peuplier.
   3. Retirez les anneaux de l’épiderme (1,0 cm de largeur) et exposez le tissu vert, du phloème.
   4. Grattez légèrement et verticalement le tissu du phloème quatre fois et exposez la structure interne du phloème.
   5. Inoculer la région de l’épiderme annelé avec le mycélium fongique (eGP) et les sangles PDA (eGC). Effectuer des manipulations d’inoculation similaires aux étapes 1.3.2 à 1.3.4.
   6. Enveloppez les tiges inoculées avec du ruban adhésif (ou un film plastique PE) comme décrit à l’étape 1.3.5.
   7. Gérez les peupliers et observez les RA comme décrit aux étapes 1.3.6 à 1.3.8.

2. Mise en place d’un système expérimental pour la recherche de gènes liés à la lumière par la méthode d’inoculation par annelage

1. Induire des AR chez le peuplier à l’aide de la méthode d’inoculation par annelage du phloème (étapes 1.3.2-1.3.4).
2. Alternativement, induire des AR de peuplier en utilisant la méthode d’inoculation de l’anneau de l’épiderme décrite à l’étape 1.4.5.
3. Envelopper les régions inoculées d’agents pathogènes des tiges/branches de peuplier (15 cm de hauteur) avec une feuille d’aluminium (traitement d’ombrage, S) ou sans pellicule d’aluminium (traitement d’éclairage, L).
4. Attachez les tiges/branches à des bâtons de >50 cm de long pour les protéger du brise-vent. Cultivez et gérez régulièrement les peupliers et gardez-les bien irrigués pendant l’expérience, comme décrit aux étapes 1.3.6-1.3.7.
5. Retirez la feuille d’aluminium des tiges à ~20 jours après l’inoculation.
6. Observez et photographiez immédiatement les AR de peuplier ombré (S) et de peuplier non ombré (L).
7. Cultivez les AR de peuplier ombragés à la lumière du soleil ou dans d’autres sources/conditions de lumière artificielle.
8. Retirez les rubans de greffe (ou les films plastiques PE) et récoltez les AR de peuplier 1 à 5 jours après l’exposition à la lumière.
9. Enveloppez tous les échantillons AR avec du papier d’aluminium. Pour les AR de peuplier qui ont subi un traitement d’ombrage, récoltez les échantillons dans l’obscurité.
10. Faites tremper les échantillons d’AR dans de l’azote liquide et stockez-les à -80 °C pour une enquête plus approfondie.
11. Récoltez les AR de peuplier exposés à la lumière ou non exposés (effectués dans l’obscurité) après les avoir enveloppés de papier d’aluminium, et stockez-les à 4 °C pour des essais morphologiques et autres essais in situ .

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Résultats

La figure 1 illustre le flux de travail des agents pathogènes du chancre de la tige induisant des racines adventives par inoculation par annelage. Les expériences menées ici ont montré que les agents pathogènes du chancre de la tige, V. sordida, B. dothidea, et leurs isolats (provenant de différents hôtes, régions ou pathogénicités) peuvent induire la formation de RA chez les espèces de peupliers. Dans ce protocole, nous avons ut...

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Discussion

Les espèces de peupliers sont susceptibles de produire des AR ou des racines latérales (LR) à partir de boutures de tige, ce qui contribue à leur reproduction et sert de modèle pour l’étude de la biologie des racines chez les plantes ligneuses ^7,8. De plus, la recherche a indiqué que l’inoculation de micro-organismes spécifiques, tels que des bactéries bénéfiques (Agrobacterium rhizogenes ^9,10

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Solarbio	A8190	Provide nutrition for fungal growth
Aluminum foil	biosharp	BS-QT-027B	To provide shading for the infected area
Girdling knife	MoGong Hardware tool firms		Girdle the epidermis of poplar stems/branches
Grafting tape	CAPI	5cm	To fix fungi on the plants
PD (Potato extraction, Dextrose)	Solarbio	P7360	Provide nutrition for fungal growth
PE plastic film	MiaoJie	413703	To fix fungi on the plants
Petri dishes	Bkman biological Co.,Ltd	90mm	Prepare the PDA medium
Thermostatic incubator	Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd	KTD-6000	Provide an environment for fungal growth