茎溃疡病菌诱导的杨树不定根：研究根生物学和光反应相关过程的实验系统

摘要

在这里，我们提出了一种通过韧皮部或表皮带真菌病原体接种途径诱导不定根 （ARs） 产生的方案，适用于研究杨树的根生物学和光响应相关的生理过程。

摘要

Valsa sordida 和 Botryosphaeria dothidea 是两种重要的坏死营养真菌病原体，它们会损害许多植物宿主，尤其是 杨属物种。这两种真菌病原体主要发生在杨树的枝条、茎和小枝中，引起口腔溃疡病变、树冠枯萎和枯萎等典型症状。病原体接种是研究植物病害机制的最有效途径。除了茎上接种部位周围的溃疡病灶外，在接种茎溃疡病原菌后，在杨树物种中观察到一种新的发育现象，即大量鲜红色的不定根 （ARs）。在这项研究中，我们描述了在杨树中使用真菌病原体诱导 ARs 的方法。该方法的关键步骤是（韧皮部或表皮）束带作后的病原体接种。第二个关键步骤是保湿材料的应用。与使用 Parafilm 的保湿作相比，用家用聚乙烯 （PE） 保鲜膜包裹接种部位可以在环带接种后 20 天内产生色彩缤纷、数量众多且坚固的 AR。最后，经过遮光处理（用铝箔包裹茎）后，白色 ARs 从杨树茎的接种环中发芽。该方法引入了一种新的实验系统来研究根的发育和形态发生，这对于理解根系发育、形态发生和疾病胁迫下反应的生物学至关重要。此外，当与遮光处理相结合时，本研究可以为研究光响应相关过程提供一个方便的实验系统，例如，类黄酮、花青素或其他相关代谢物的生物合成，以及参与这些过程的基因或转录因子。

引言

由坏死性真菌病原体 Valsa sordida 和 Botryosphaeria dothidea 引起的杨树茎溃疡病是华北地区严重破坏杨树物种生态和经济人工林发展的两种重要树木病害。杨树溃疡病常发生在树干和树枝的树皮上，而溃疡病病变是其典型症状。发病后，扩大的口腔病灶逐渐损害宿主的韧皮部、形成层和木质部。此外，它们还影响了同化产物和水通过血管系统的运输。然而，溃疡病病原体如何阻碍韧皮部和木质部的运输仍不清楚。

为了揭示溃疡病菌感染的杨树中碳水化合物和水的运输机制，我们提出了韧皮部或表皮环接种方法 ^1,2，它结合了经典的花园束带作和病原体接种方法（菌丝体块伤接种）。这些方法可以模拟溃疡病病原体诱导的侵染过程以及水和碳水化合物的阻塞。

我们的研究表明，真菌病原体最初通过诱导碳饥饿而不是水力故障来导致杨树冠层枯死 1,3,4,5。令人惊讶的是，我们在杨树茎上观察到一种特殊的根际发生，这与茎溃疡病病原体的接种有关：大量的红色不定根 （ARs） 从上茎的低端长出（与韧皮部或表皮环的上边缘相对）。此外，我们的实验表明，ARs 的产生在杨树-溃疡病菌相互作用中是普遍的。它们可以由不同年龄（1 岁、2 岁甚至 6 岁）的杨树物种或克隆产生，并且可以由不同的溃疡病病原体（V. sordida 和 B. dothidea）或其分离株诱导。此外，我们还研究了杨树 ARs 的颜色机制，结果表明它与光照条件下类黄酮和花青素的生物合成以及光相关基因（或基因模块）的基因表达调控有关⁶。因此，这些由病原体诱导的杨树 ARs 可以作为研究植物-病原体相互作用、根系生物学以及光相关基因的功能和表达的稳定和理想的实验系统。

在本研究中，我们将介绍并提供通过环状接种途径建立杨树 ARs 实验系统的方案;此外，我们指出了影响 ARs 形成的关键因素，并阐述了环状接种在杨树根生物学和其他光响应相关生理过程研究中的潜在应用。

研究方案

1. 通过环状接种诱导杨树 ARs

1. 真菌性溃疡病病原体的培养
   1. 将 6 g 马铃薯提取物、20 g 葡萄糖和 20 g 琼脂溶于 1000 mL 水中，制备马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 培养基。将培养基在 121.1 °C 下消毒 30 分钟，然后将培养基倒入培养皿（直径 9 厘米）中，每个培养皿含有约 20 mL PDA 培养基。
   2. 将活化的真菌菌丝体立方体 （~0.5 cm） 接种在 PDA 培养皿的中心。
   3. 将接种的 PDA 板在 28 °C 的黑暗中孵育 7-10 天。
   4. 将带有真菌菌丝体的孵育的 PDA 培养基切成条状（宽 1.2 cm;长约 3-6 cm）。
2. 杨木材料的制备
   1. 选择 1-2 年树龄、生长旺盛的杨树树苗。
   2. 从杨树苗中选择成熟的茎/枝（直径 1-2 厘米，无病虫害）。
   3. 清洗杨树茎/枝条的接种区（离地面或树枝基部约 30 厘米高）;用 75% 酒精溶液对茎/枝消毒。
3. 通过韧皮部环接种诱导 AR
   1. 小心地将消毒的杨树茎/枝的表皮和韧皮部束带，去除系带的韧皮部环（宽 1 厘米，包括部分形成层），并露出白色的内形成层/木质部组织。
      注意：步骤 1.3.2-1.3.4 详细说明了接种的替代方法。
   2. 用菌丝带（1.2 cm 宽）完全覆盖环状区域，作为韧皮部环状接种处理 （GP）。真菌菌丝面向暴露的木质部。
   3. 用消毒刀刮擦并损坏暴露的内形成层组织，然后将 PDA 带（1.2 厘米宽）接种在带状区域，作为带状形成层去除处理 （GR）。
   4. 作为带状对照 （GC），直接用未培养的 PDA 中型带（1.2 cm 宽）接种环带区域。
   5. 用可拉伸、无色和透明的嫁接胶带（或 PE 塑料薄膜）包裹接种的茎/枝。包裹 4 层以保持水分。
   6. 用（金属、塑料或木质）棍（超过 50 厘米）绑住接种的茎/树枝，以防止它们被风吹走。
   7. 在实验过程中，通过定期灌溉培育带状杨树材料。
   8. 从外部观察并记录接种后 14-30 天杨树 ARs 的形成。
4. 通过表皮环扎接种诱导 ARs
   1. 如步骤 1.2 中所述选择并准备接种材料。
   2. 小心地束缚杨树茎/枝的表皮。
   3. 去除表皮环（1.0 cm 宽）并露出绿色韧皮部组织。
   4. 轻轻垂直刮擦韧皮部组织四次，露出韧皮部的内部结构。
   5. 用真菌菌丝体 （eGP） 和 PDA 带 （eGC） 接种带状表皮区域。执行类似于步骤 1.3.2-1.3.4 的接种作。
   6. 如步骤 1.3.5 所述，用嫁接带（或 PE 塑料薄膜）包裹接种的茎。
   7. 如步骤 1.3.6-1.3.8 中所述管理杨树并观察 AR。

2. 建立通过环接种法研究光相关基因的实验系统

1. 使用韧皮部环接种方法诱导杨树 AR（步骤 1.3.2-1.3.4）。
2. 或者，如步骤 1.4.5 中所述，使用表皮环状接种方法诱导杨树 AR。
3. 用铝箔（遮光处理，S）或无铝箔包裹（光照处理，L）包裹杨树茎/枝条（15 厘米高）的病原体接种区域。
4. 将茎/枝系在 >50 厘米长的棍子上，以防止它们被风吹走。定期种植和管理杨树，并在实验期间保持它们的良好灌溉，如步骤 1.3.6-1.3.7 所述。
5. 接种后 ~20 天从茎上去除铝箔。
6. 立即观察并拍摄有阴影 （S） 和无阴影的杨树 AR （L）。
7. 在阳光或其他人造光源/条件下培养阴凉的杨树 ARs。
8. 去除嫁接带（或 PE 塑料薄膜），并在光照后 1-5 天收获杨树 ARs。
9. 用铝箔包裹所有 AR 样品。对于经过遮蔽处理的杨树 AR，在黑暗中收获样品。
10. 将 AR 样品浸泡在液氮中并储存在 -80 °C 以备进一步研究。
11. 用铝箔包裹后收获光暴露或未暴露的杨树 ARs（在黑暗中进行），并将其储存在 4 °C 用于形态学和其他 原位 测定。

结果

茎溃疡病病原体通过环带接种诱导不定根的工作流程如图 1 所示。这里进行的实验表明，茎溃疡病菌 V. sordida、B. dothidea 及其分离株（来自不同的宿主、区域或致病性）都可以在杨树物种中诱导 ARs 的形成。在该方案中，我们使用 V. sordida 分离株 CZC、CFCC86775 和 B. dothidea 分离株 SD50 和 SD81 在 P. alba var. pyramidalis 中产生...

讨论

杨树物种容易从茎插条中产生 AR 或侧根 （LR），这有助于它们的繁殖，并作为木质植物根生物学研究的模型 ^7,8。此外，研究表明，接种特定微生物，例如有益细菌（根瘤农杆菌 ^9,10;植物促生长根际细菌 [PGPR]¹¹）、内生菌^12,13

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Solarbio	A8190	Provide nutrition for fungal growth
Aluminum foil	biosharp	BS-QT-027B	To provide shading for the infected area
Girdling knife	MoGong Hardware tool firms		Girdle the epidermis of poplar stems/branches
Grafting tape	CAPI	5cm	To fix fungi on the plants
PD (Potato extraction, Dextrose)	Solarbio	P7360	Provide nutrition for fungal growth
PE plastic film	MiaoJie	413703	To fix fungi on the plants
Petri dishes	Bkman biological Co.,Ltd	90mm	Prepare the PDA medium
Thermostatic incubator	Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd	KTD-6000	Provide an environment for fungal growth