Radici avventizie di pioppo indotte da patogeni del cancro del fusto: un sistema sperimentale per lo studio della biologia delle radici e dei processi correlati alla risposta alla luce

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per indurre la produzione di radici avventizie (AR) attraverso la via di inoculazione dei patogeni fungini del floema o della cintura dell'epidermide, che è adatto per lo studio della biologia delle radici e dei processi fisiologici correlati alla risposta alla luce nel pioppo.

Abstract

Valsa sordida e Botryosphaeria dothidea sono due patogeni fungini necrotrofi cruciali che danneggiano molte piante ospiti, in particolare le specie del genere Populus. Questi due patogeni fungini si verificano principalmente nei rami, negli steli e nei ramoscelli di pioppo, causando sintomi classici come lesioni del cancro, deperimento della chioma e appassimento. L'inoculazione di agenti patogeni è il percorso più efficiente per studiare il meccanismo delle malattie delle piante. Oltre alle lesioni del cancro intorno ai siti di inoculazione sugli steli, un nuovo fenomeno dello sviluppo, abbondanti radici avventizie (AR) di colore rosso vivo, sono state osservate nelle specie di pioppo dopo inoculazioni di agenti patogeni del cancro dello stelo. In questo studio, abbiamo descritto il metodo per indurre AR utilizzando patogeni fungini nei pioppi. Il passaggio cruciale di questo metodo è l'inoculazione del patogeno dopo la manipolazione del cingolo (floema o epidermide). Il secondo passaggio cruciale è l'applicazione del materiale idratante. Rispetto alla manipolazione idratante con Parafilm, avvolgere i siti inoculati con un involucro di plastica in polietilene (PE) per uso domestico può produrre AR colorati, numerosi e robusti in 20 giorni dopo l'inoculazione della cintura. Infine, gli AR bianchi sono spuntati dagli anelli inoculati negli steli di pioppo dopo il trattamento di ombreggiatura (avvolgendo gli steli con un foglio di alluminio). Questo metodo introduce un nuovo sistema sperimentale per lo studio dello sviluppo e della morfogenesi delle radici, che è fondamentale per comprendere la biologia dello sviluppo delle radici, della morfogenesi e della risposta allo stress della malattia. Inoltre, se combinato con il trattamento di ombreggiamento, questo studio può fornire un comodo sistema sperimentale per studiare i processi correlati alla risposta alla luce, ad esempio la biosintesi di flavonoidi, antociani o altri metaboliti correlati e geni o fattori di trascrizione coinvolti in questi processi.

Introduzione

Le malattie del cancro del fusto di pioppo causate da patogeni fungini necrotrofi, Valsa sordida e Botryosphaeria dothidea, sono le due malattie arboree cruciali nel nord della Cina che hanno gravemente danneggiato lo sviluppo ecologico ed economico delle piantagioni di specie di pioppo. Le afte del pioppo si manifestano sempre sulla corteccia dei tronchi e dei rami, mentre le lesioni del cancro sono i loro sintomi tipici. Dopo l'insorgenza delle malattie, le lesioni del cancro in espansione hanno progressivamente danneggiato il floema, il cambio e lo xilema degli ospiti. Inoltre, hanno influenzato il trasporto dei prodotti assimilati e dell'acqua attraverso il sistema vascolare. Tuttavia, il modo in cui i patogeni del cancro ostacolano il trasporto del floema e dello xilema rimane poco chiaro.

Per rivelare i meccanismi di trasporto dei carboidrati e dell'acqua nei pioppi infettati da agenti patogeni del cancro, abbiamo proposto i metodi di inoculazione del floema o della cintura dell'epidermide ^1,2, che combinavano la classica manipolazione della cintura da giardino e il metodo di inoculazione dei patogeni (inoculazione del blocco dei miceli). Questi metodi possono simulare il processo di infestazione e il blocco di acqua e carboidrati indotto da agenti patogeni del cancro.

La nostra ricerca ha dimostrato che i patogeni fungini hanno causato il deperimento della chioma dei pioppi inducendo inizialmente la carenza di carbonio, non il cedimento idraulico 1,3,4,5. Sorprendentemente, abbiamo osservato una particolare rizogenesi sugli steli di pioppo che è stata associata all'inoculazione di patogeni del cancro dello stelo: abbondanti radici avventizie rosse (AR) crescono dall'estremità inferiore degli steli superiori (opposta al bordo superiore del floema o degli anelli di cintura dell'epidermide). Inoltre, i nostri esperimenti hanno dimostrato che la produzione di AR è universale nell'interazione tra pioppo e cancro patogeno. Possono essere prodotti da specie di pioppo o cloni di età diverse (1, 2 o anche 6 anni) e possono essere indotti da diversi agenti patogeni del cancro (V. sordida e B. dothidea) o dai loro isolati. Inoltre, abbiamo studiato i meccanismi del colore degli AR di pioppo e i risultati hanno mostrato che è associato alla biosintesi di flavonoidi e antociani, nonché alla regolazione dell'espressione genica di geni correlati alla luce (o moduli genici) in condizioni di illuminazione⁶. Pertanto, questi AR di pioppo indotti da patogeni possono essere utilizzati come sistema sperimentale stabile e ideale per lo studio dell'interazione pianta-patogeno, della biologia delle radici e della funzione e dell'espressione di geni correlati alla luce.

In questo studio, introdurremo e forniremo il protocollo per stabilire un sistema sperimentale ARs di pioppo attraverso la via di inoculazione del cingolo; inoltre, sottolineiamo i fattori cruciali che influenzano la formazione di AR ed esponiamo la potenziale applicazione dell'inoculazione del cingolo nello studio della biologia delle radici di pioppo e di altri processi fisiologici correlati alla risposta alla luce.

Protocollo

1. Induzione di AR di pioppo mediante inoculazione di cintura

1. Coltura del patogeno del cancro fungino
   1. Sciogliere 6 g di estratto di patate, 20 g di destrosio e 20 g di agar agar in 1000 ml di acqua per preparare il terreno di agar destrosio di patate (PDA). Sterilizzare il terreno a 121,1 °C per 30 minuti e versare il terreno in piastre di Petri (9 cm di diametro), ciascuna contenente circa 20 ml di terreno PDA.
   2. Inoculare il cubo di micelio fungino attivato (~0,5 cm) al centro della capsula di Petri PDA.
   3. Incubare le piastre PDA inoculate al buio a 28 °C per 7-10 giorni.
   4. Tagliare il terreno PDA incubato con micelio fungino in cinghie (1,2 cm di larghezza; circa 3-6 cm di lunghezza).
2. Preparazione di materiali di pioppo
   1. Seleziona alberelli di pioppo di 1-2 anni, a crescita vigorosa.
   2. Seleziona steli/rami maturi da alberelli di pioppo (1-2 cm di diametro, privi di malattie e infestazioni di parassiti).
   3. Lavare le regioni di inoculazione (a circa 30 cm di altezza dal suolo o dalla base dei rami) dei fusti/rami di pioppo; Sterilizzare gli steli/rami con una soluzione alcolica al 75%.
3. Induzione di AR attraverso la cintura-inoculazione del floema
   1. Cingere con cura l'epidermide e il floema degli steli/rami di pioppo sterilizzati, rimuovere gli anelli floematici cinti (1 cm di larghezza, compreso il cambio parziale) ed esporre i tessuti bianchi interni del cambio/xilema.
      NOTA: I passaggi 1.3.2-1.3.4 descrivono in dettaglio i metodi alternativi di inoculazione.
   2. Coprire completamente la regione del cingolo con cinghie per miceli (1,2 cm di larghezza) come trattamento di inoculazione del cingolo floematico (GP). Le ife fungine sono rivolte verso lo xilema esposto.
   3. Raschiare e danneggiare il tessuto interno del cambio esposto con coltelli sterilizzati, quindi inoculare le cinghie PDA (1,2 cm di larghezza) sulle regioni di cintura come trattamento di rimozione del cambio di cintura (GR).
   4. Inoculare le regioni di cintura direttamente con le cinghie medie PDA non coltivate (1,2 cm di larghezza) come controllo della cintura (GC).
   5. Avvolgere gli steli/rami inoculati con nastro da innesto estensibile, incolore e trasparente (o pellicola di plastica PE). Avvolgi 4 strati per trattenere l'umidità.
   6. Lega gli steli/rami inoculati con bastoncini (di metallo, plastica o legnosi) (oltre 50 cm) per evitare che si rompano il vento.
   7. Coltivare i materiali di pioppo ciinto con irrigazione regolare durante l'esperimento.
   8. Osservare dall'esterno e registrare la formazione di AR di pioppo 14-30 giorni dopo l'inoculazione.
4. Induzione di AR attraverso la cintura-inoculazione dell'epidermide
   1. Selezionare e preparare i materiali inoculati come descritto al punto 1.2.
   2. Cingere con cura l'epidermide degli steli/rami di pioppo.
   3. Rimuovere gli anelli dell'epidermide (1,0 cm di larghezza) ed esporre il tessuto floematico verde.
   4. Raschiare leggermente e verticalmente il tessuto floematico quattro volte ed esporre la struttura interna del floema.
   5. Inoculare la regione dell'epidermide cinta con il micelio fungino (eGP) e le cinghie PDA (eGC). Eseguire manipolazioni di inoculazione simili ai passaggi 1.3.2-1.3.4.
   6. Avvolgere gli steli inoculati con nastro da innesto (o pellicola di plastica in PE) come descritto al punto 1.3.5.
   7. Gestisci i pioppi e osserva gli AR come descritto nei passaggi 1.3.6-1.3.8.

2. Messa a punto di un sistema sperimentale per la ricerca di geni correlati alla luce attraverso il metodo di inoculazione del cingolo

1. Indurre AR di pioppo utilizzando il metodo di inoculazione del cingolo floematico (passaggi 1.3.2-1.3.4).
2. In alternativa, indurre AR di pioppo utilizzando il metodo di inoculazione del cingimento epidermico come descritto nel passaggio 1.4.5.
3. Avvolgere le regioni inoculate da agenti patogeni di steli/rami di pioppo (15 cm di altezza) con un foglio di alluminio (trattamento ombreggiante, S) o senza pellicola di alluminio (trattamento di illuminazione, L).
4. Lega gli steli/rami a bastoncini lunghi >50 cm per evitare che si rompano il vento. Coltivare e gestire regolarmente i pioppi e mantenerli ben irrigati durante l'esperimento come descritto nei passaggi 1.3.6-1.3.7.
5. Rimuovere il foglio di alluminio dai gambi a ~20 giorni dopo l'inoculazione.
6. Osservare e fotografare immediatamente gli AR di pioppo sfumato (S) e non ombreggiato (L).
7. Coltiva gli AR di pioppo ombreggiato alla luce del sole o in altre fonti/condizioni di luce artificiale.
8. Rimuovere i nastri da innesto (o pellicole plastiche in PE) e raccogliere gli AR di pioppo a 1-5 giorni dopo l'esposizione alla luce.
9. Avvolgi tutti i campioni AR con un foglio di alluminio. Per gli AR di pioppo che hanno subito un trattamento di ombreggiamento, raccogliere i campioni al buio.
10. Immergere i campioni AR in azoto liquido e conservarli a -80 °C per ulteriori indagini.
11. Raccogliere gli AR di pioppo esposti alla luce o non esposti (condotti al buio) dopo averli avvolti con un foglio di alluminio e conservarli a 4 °C per saggi morfologici e altri saggi in situ .

Risultati

Il flusso di lavoro dei patogeni del cancro del fusto che inducono radici avventizie attraverso l'inoculazione del cingolo è mostrato nella Figura 1. Gli esperimenti condotti qui hanno dimostrato che sia i patogeni del cancro del fusto, V. sordida, B. dothidea, sia i loro isolati (provenienti da diversi ospiti, regioni o patogenicità) possono indurre la formazione di AR nelle specie di pioppo. In questo protocollo, abbiamo utilizzato l'is...

Discussione

Le specie di pioppo sono in grado di produrre AR o radici laterali (LR) da talee di fusto, il che contribuisce alla loro riproduzione e come modello per lo studio della biologia delle radici nelle piante legnose ^7,8. Inoltre, la ricerca ha indicato che l'inoculazione di microrganismi specifici, come i batteri benefici (Agrobacterium rhizogenes ^9,10; I rizobatteri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Solarbio	A8190	Provide nutrition for fungal growth
Aluminum foil	biosharp	BS-QT-027B	To provide shading for the infected area
Girdling knife	MoGong Hardware tool firms		Girdle the epidermis of poplar stems/branches
Grafting tape	CAPI	5cm	To fix fungi on the plants
PD (Potato extraction, Dextrose)	Solarbio	P7360	Provide nutrition for fungal growth
PE plastic film	MiaoJie	413703	To fix fungi on the plants
Petri dishes	Bkman biological Co.,Ltd	90mm	Prepare the PDA medium
Thermostatic incubator	Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd	KTD-6000	Provide an environment for fungal growth