JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

قمنا بتطوير نموذج الفئران لالتهاب القرنية الحاد من خلال كشط ظهارة القرنية جنبا إلى جنب مع خيوط القرنية. قيمت الدراسة أنماط التهاب القرنية ، والتكاثر الظهاري ، والتغيرات في الخلايا الجذعية القوفية في ظل الظروف الالتهابية.

Abstract

يلعب التهاب القرنية ، وخاصة التهاب القرنية الحاد ، دورا مهما في تطور خلل الخلايا الجذعية القرنية الداكنة. يمكن أن يساعدنا بناء نماذج حيوانية مناسبة في التركيز على آثار الالتهاب الشديد على الخلايا الجذعية القحفية للقرنية. تم استخدام مزيل الصدأ 2 مم لإزالة ظهارة القرنية المركزية لفئران Sprague Dawley (SD) لإحداث إصابة. بعد ذلك ، تم خياطة السدى المركزي للقرنية بخيوط من النايلون للحث على التهاب مستمر. بهذه الطريقة ، تم إنشاء نموذج التهاب القرنية مع تآكل ظهارة القرنية المركزية وخياطة السدى المركزي ، مما تسبب في التهاب شديد في القرنية. لوحظت التغيرات في التهاب القرنية وحالة الخلايا الجذعية الحزفية بعد 1 و 3 و 7 أيام بعد النمذجة. فياليوم الثالث بعد النمذجة ، كان طيفي القرنية للفئران وذمة شديدة ، مع تضخم جديد واضح للأوعية الدموية وتضخم موضعي ، وهي علامات نموذجية لنقص الخلايا الجذعية الطرفية. بحلولاليوم السابع ، ساءت وذمة القرنية تدريجيا ، واستمرت الأوعية الدموية الجديدة في الزيادة. من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (RT-qPCR) وتلوين التألق المناعي ، وجدنا أن العوامل الالتهابية الظهارية للقرنية قد تم تنظيمها بشكل كبير ، وكان التمايز الظهاري للقرنية غير طبيعي ، وانخفضت الخلايا الجذعية الظهارية للقرنية بشكل كبير ، كما انخفض تكاثر الخلايا والجذعية. لذلك ، يوضح هذا النموذج أن الالتهاب الشديد يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا الجذعية القصوية دون إتلاف الخلايا الجذعية القوفية بشكل مباشر. النموذج مفيد لمراقبة آثار الالتهاب الشديد على الآليات البيولوجية للخلايا الجذعية ويوفر منصة مثالية لدراسة آليات خلل الخلايا الجذعية الظهارية للقرنية الناجم عن الالتهاب.

Introduction

يتميز الخلل الوظيفي للخلايا الجذعية الحزفية (LSCD) بعيوب ظهارية مستمرة ، والأوعية الدموية للقرنية ، والتهاب مزمن ، وتندب ، وملتحمة القرنية1،2. قد ينشأ من استنفاد أو خلل في الخلايا الجذعية الحوفية بعد أمراض سطح العين الشديدة ، مثل الحروق الكيميائية والحروق الحرارية ومتلازمة ستيفنز جونسون والإصابة علاجية المنشأ الناتجة عن جراحات العين2،3،4. تتضمن الآليات المسببة للأمراض ل LSCD بشكل أساسي تغييرات في الخلايا الجذعية واضطرابات في البيئة المكروية للخلايا الجذعية5،6 ، مما يؤثر على توازن ظهارة القرنية2،7. هناك نوعان أساسيان من تغيرات المصير في الخلايا الجذعية القحفية في LSCD: 1) تصبح إمكانات التمايز الاتجاهي للخلايا الجذعية الظهارية للقرنية غير طبيعية ، مما يؤدي إلى تمايزها إلى خلايا ظهارية الجلد. يتضح ذلك من خلال انخفاض في التعبير عن عامل النسخ الخاص بالخلايا الظهارية للقرنية Pax6 والكيراتين الخاص بالقرنية Krt12 و Krt3 ، إلى جانب زيادة كبيرة في التعبير عن علامات الحؤول الظهارية الحرشفية المرتبطة بالجلد Krt10 و Krt1 و Sprr1b8 ؛ 2) تؤدي إصابة سطح العين إلى تدمير الخلايا الجذعية الحزفية للقرنية بشكل مباشر ، مما يؤدي إلى نخر أو موت الخلايا المبرمج ، وبالتالي يتسبب في تكاثر أنسجة الملتحمة التي تغطي القرنية9. تم الإبلاغ عن أنه أثناء تطور LSCD ، تزداد الخلايا الالتهابية مثل الضامة والعدلات والخلايا المتغصنة بشكل كبير في البيئة المكروية للخلايا الجذعية الظهارية للقرنية. في المقابل ، تظهر السيتوكينات مثل الإنترفيرون جاما (IFN) -γ وعامل نخر الورم (TNF) -α والإنترلوكين (IL) -1β والبروتينات الالتهابية الضامة (MIP) -1α / β ارتفاعات كبيرة10.

تم إنشاء نماذج مختلفة من LSCD ، بما في ذلك تلك التي تسببها الغرز والإصابات الكيميائية واكتشاف كلوريد البنزالكونيوم11. كل من هذه النماذج له مزاياه وعيوبه. يمكن للإصابات الكيميائية أن تلحق الضرر بسطح العين بالكامل وتدمر الخلايا الجذعية الحزفية بشكل مباشر12. يعمل كلوريد البنزالكونيوم بشكل مشابه للإصابات الكيميائية ولكن له تأثير بطيء نسبيا13. يمكن أن يؤدي نموذج خياطة القرنية إلى استجابة التهابية مستقرة وطويلة الأمد ، لكن التفاعل الالتهابي خفيف نسبيا ولا يمكن أن يسبب LSCD.

للتحقيق في دور وآليات الالتهاب في تطور LSCD في القرنية ، تم إنشاء نموذج حيواني يجمع بين كشط ظهارة القرنية المركزية وخيوط القرنية. يحفز هذا النموذج التهابا مستمرا في ظهارة القرنية دون إتلاف الخلايا الجذعية القصوفية بشكل مباشر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تتوافق جميع الإجراءات مع إرشادات ARVO لاستخدام في أبحاث طب العيون والرؤية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة قويتشو الطبية (الموافقة رقم 2305192). تم إيواء الفئران في مركز التابع لجامعة قويتشو الطبية ، مع الالتزام بلوائح إدارة ذات الصلة.

1. اختيار

  1. استخدم إناث فئران Sprague-Dawley (SD) التي تتراوح أعمارها بين 7-8 أسابيع. تأكد من عدم وجود آفات على سطح العين تحت فحص المصباح الشقي.
  2. تعقيم الأدوات باستخدام معقم سريع. تشمل الأدوات المطلوبة مزيل حلقة الصدأ في القرنية ، وعلامة أخذ عينات الجلد بحجم 2 مم ، وحاملات الإبر ، وسكاكين طبقة الألواح ، والمقص الجراحي للعيون ، والملقط.
  3. تخدير الفئران بنسبة 1.25٪ ثلاثي البروم الإيثانول عن طريق الحقن داخل الصفاق بجرعة 0.3 مل لكل 100 غرام من وزن الجسم. تقييم عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم. غرس قطرة واحدة من قطرات العين تروبيكاميد لتوسيع حدقة العين. ضعي قطرات العين بوبيفاكائين هيدروكلوريد على العين. استخدم مرهم تشحيم العين على العين المقابلة للحفاظ على الرطوبة.
  4. تطهير الجلد والشعر حول العينين باليودوفور.
  5. إنشاء نموذج الالتهاب.
    1. ضع الجرذ في وضع الاستلقاء الجانبي. كشف مقلة العين تحت مجهر التشغيل.
    2. تم تمييز القرنية المركزية باستخدام علامة أخذ عينات من الجلد بحجم 2 مم ، وتم كشط ظهارة القرنية المركزية المسماة باستخدام مزيل حلقة الصدأ للقرنية.
    3. ضع ثلاث خيوط قرنية بزاوية 120 درجة باستخدام سلك نايلون 10-0 ، وحامل إبرة ، ومقص جراحي للعيون ، وملقط على بعد حوالي 3 مم من الطرفين ، ولا تخترق القرنية14،15.
  6. ضع مرهم العين Ofloxacin في نهاية الإجراء لمنع العدوى.
  7. راقب وصور القرنيةفي اليوم 1 و 3 و 7 بعد العملية باستخدام عدسة مكبرة بمصباح شقي 10x. سجل الأعراض مثل التئام ظهارة القرنية ، واحتقان الملتحمة ، ووذمة القرنية ، واحتقان الدم الحوفي ، والأوعية الدموية الجديدة للقرنية.

2. حساب مؤشر الالتهابات

  1. احسب المؤشر الالتهابي لسطح العين بعد إنشاء النموذج الحيواني.
    1. سجل احتقان الجسم الهدبي على النحو التالي: لا الازدحام (0 نقطة); وجود ازدحام أقل من 1 مم (نقطة واحدة) ؛ احتقان الدم بين 1 مم و 2 مم (نقطتان) ؛ احتقان الدم بين 1 مم و 2 مم (3 نقاط).
    2. سجل وذمة القرنية المركزية على النحو التالي: لا توجد وذمة (0 نقطة) ؛ وذمة مع رؤية واضحة للقزحية (1 نقطة) ؛ وذمة مع رؤية غير واضحة للقزحية (2 نقطة) ؛ وذمة مع القزحية غير مرئية (3 نقاط).
    3. يسجل وذمة القرنية شبه المركزية على النحو التالي: لا وذمة (0 نقطة) ؛ وذمة مع رؤية واضحة للقزحية (1 نقطة) ؛ وذمة مع رؤية غير واضحة للقزحية (2 نقطة) ؛ وذمة مع القزحية غير مرئية (3 نقاط).
    4. احسب مؤشر الالتهاب بجمع جميع الدرجات وقسمتها على 9.

3. تقييم الأوعية الدموية الجديدة للقرنية

  1. راقب الأوعية الدموية الجديدة للقرنية باستخدام مصباح شقي.
    1. تحليل الصور ومعالجتها باستخدام برنامج معالجة صور المصباحالشقي 16.
    2. سجل نمو الأوعية الدموية الجديدة للقرنية في كل نقطة زمنية للمراقبة ، وقياس أطول أوعية جديدة للقرنية باتجاه القرنية المركزية مع الحد الأدنى من الانحناء.
    3. صنفهم على النحو التالي: الصف 0: Avascular. الصف 1: مايكرو (<1 مم) ؛ الدرجة 2: معتدلة (1 مم إلى 1.5 مم) ؛ الدرجة 3: معتدلة (>1.5 مم إلى 2 مم) ؛ الدرجة 4: شديدة (>2 مم).

4. تحليل بيولوجيا النموذج

  1. تحضير عينات العين المجمدة.
    1. قم بتخدير الفئران بنسبة 4-5٪ من الأيزوفلوران والقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
    2. في وضع الاستلقاء الجانبي ، ارفع مقلة العين الفئران للخارج باستخدام ملاقط صغيرة واقطع الملتحمة على طول قبة العين العلوية والسفلية بمقص العين.
    3. قطع العصب البصري ، مع الانتباه إلى الحفاظ على سلامة ظهارة القرنية.
    4. جفف بقع الدم والماء على سطح مقلة العين بورق ترشيح وضعها في صندوق التضمين مع وسط تضمين درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
    5. قم بإزالة الفقاعات الموجودة في صندوق التضمين بماصة سعة 200 ميكرولتر ، وقم بتجميدها باستخدام النيتروجين السائل ، ثم احفظ العينات المدمجة في الثلاجة ذات درجة الحرارة المنخفضة للغاية.
  2. تحضير الأقسام المجمدة من مقل العيون.
    1. قبل تحضير القسم المجمد، قم بتبريد ناظم البرد إلى حوالي -28 درجة مئوية وحامل العينة إلى -26 درجة مئوية.
    2. أخرجي العينات المجمدة من الفريزر البارد وضعيها في الثلاجة لمدة 1 ساعة تقريبا.
    3. قم بتبريد العينة المجمدة في الثلاجة لمدة 10 دقائق. ضع علامة على العينة بقلم رصاص ، وثبتها على لوحة العينة باستخدام OCT ، وثبتها معا على رف التقسيم بعد التبريد.
    4. اضبط موضع واتجاه العينة المجمدة وقم بإصلاحها. أولا ، قم بقص 20 ميكرومتر حتى تظهر القرنية المركزية. بعد ذلك ، احصل على أقسام 6 ميكرومتر عن طريق التقطيع المستمر واجمع الأقسام الموجودة على شرائح الالتصاق المعدة مسبقا.
    5. حدد الاسم والمادة ووقت القسم والاسم ورقم الأنسجة الموجودة على الشريحة. ضعه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة تقريبا.
    6. بعد تجفيف الأقسام ، ضعيها في صندوق واحتفظي بها في الثلاجة ذات درجة الحرارة المنخفضة للغاية للاحتفاظ بها.
  3. أداء تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين.
    1. قم بإزالة الأجزاء المجمدة المعدة مسبقا من الثلاجة ذات درجة الحرارة المنخفضة للغاية وضعها في شفاط الدخان عند RT حتى تجف.
    2. قم بإصلاح الأقسام باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في RT. اشطف العينات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق.
    3. ضع أقسام العينة التي تحتوي على شرائح على حامل منزلق واغمرها في أسطوانة الصبغة بمحلول صبغة الهيماتوكسيلين في RT لمدة 5 دقائق.
    4. اشطف العينة التي تحتوي على شرائح ببطء بماء الصنبور لغسل الصبغة العائمة ، وضعها في خزان الصبغة باستخدام كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 0.1٪ ، وقم بإزالتها بسرعة بعد 1-2 ثانية.
    5. اشطف العينة ببطء بماء الصنبور لمدة 15 دقيقة.
    6. قم بإزالة العينة من الماء واغمر الشرائح في خزان صبغة اليوزين ؛ اتركيه في RT لمدة 3 دقائق.
    7. اشطف العينة ببطء بماء الصنبور ، واغسل الصبغة الزائدة ، وقم بإجراء تجفيف الكحول المتدرج باستخدام 75٪ كحول ، و 80٪ كحول ، و 95٪ كحول ، و 100٪ كحول (واحد) ، و 100٪ كحول (اثنان). قم بتقطيع الأقسام في كل تركيز لمدة 2 دقيقة.
    8. اجعل العينات شفافة لمدة دقيقتين في الزيلين (1) والزيلين (2) على التوالي.
    9. جفف العينة في غطاء الدخان ، وأغلق الأقسام باستخدام عامل مانع للتسرب ، واحرص على عدم إنتاج فقاعات.
    10. ضع الشرائح في مربع شريحة في RT. قم بتصوير الأقسام باستخدام مجهر.
  4. أداء تلطيخ التألق المناعي.
    1. قم بإزالة الأجزاء المجمدة وضعها في صندوق في RT في غطاء الدخان حتى يجف.
    2. ضع علامة على اسم الجسم المضاد المراد تلطيخه في الشريحة الزجاجية الفارغة للعينة المجمدة.
    3. قم بإصلاح العينات بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد في RT لمدة 15 دقيقة. تمت إضافة كمية صغيرة من ماء الصنبور إلى الصندوق لمنع العينة من الجفاف.
    4. قم بإزالة مثبت بارافورمالدهايد واغسل العينة ثلاث مرات باستخدام 1x PBS buffer. احرص على عدم طرد العينة.
    5. جفف السائل حول قسم الأنسجة ، وقم بتغطية العينة بمحلول غشاء الخلية (0.2٪ TritonX-100) ، واحتضنه في RT لمدة 20 دقيقة.
    6. قم بإزالة محلول غشاء الخلية واغسل الأقسام ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS buffer.
    7. جفف أقسام الأنسجة ، وقم بتغطية العينة بمحلول منع التألق المناعي (2٪ BSA) ، واحتضنه في RT لمدة 1 ساعة.
    8. تحضير الجسم المضاد الأساسي والمخفف (1٪ BSA) أثناء الحضانة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    9. قم بإزالة السائل المانع وجفف العينة بمضخة شفط. أضف الجسم المضاد الأساسي المحضر ، وقم بتغطية الصندوق ، واحتضنه في ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل (احتضنه لمدة 12-16 ساعة) بعيدا عن الضوء.
    10. تخلص من الجسم المضاد الأساسي واغسل العينة أربع مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في PBS.
    11. أثناء خطوة التنظيف ، قم بإعداد تخفيف الجسم المضاد الثانوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    12. قم بإزالة PBS ، وجفف العينة ، وأضف الجسم المضاد الثانوي المحضر إلى العينة. قم بتغطية العينة واحتضانها في RT لمدة 1 ساعة بعيدا عن الضوء.
    13. قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي ، واغسل العينة 4 مرات باستخدام 1x PBS buffer لمدة 10 دقائق لكل منها ، وقم بتغطية الشريحة بأكملها بمخزن مؤقت 1x PBS.
    14. قم بإزالة PBS ، وجفف العينة ، وأغلق الأقسام بوسيط تثبيت يحتوي على DAPI ، مع ضمان عدم وجود فقاعات هواء. لف الشرائح بورق قصدير واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.
    15. التقط صورا باستخدام نظام مجهر متحد البؤر بالليزر أو باستخدام نظام كاميرا مجهر مضان عمودي (سرعة المسح: 4 ميكرو ثانية / بكسل ، دقة المسح: 1024 × 1024).
  5. تحضير تعليق خلية واحدة لظهارة قرنية الفئران
    1. بعد القتل الرحيم ، قم بإزالة مقل العيون بالملاقط المنقوعة في 75٪ كحول وضعها في محلول ملح هانكس المتوازن 1x (HBSS) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) و 10٪ بنسلين ستربتومايسين معد مسبقا.
    2. نظف مقل العين واستخدم 1x HBBS يحتوي على 10٪ FBS و 10٪ بنسلين ستربتومايسين مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    3. إزالة الملتحمة على طول الهامش الصلبي; اترك الهامش الصلبي عند حوالي 1 مم. مرة أخرى ، اغسلي أنسجة القرنية مرتين باستخدام 1x HBBS يحتوي على 10٪ FBS و 10٪ بنسلين ستربتومايسين.
    4. نقل أنسجة القرنية النظيفة إلى وسط البشرة الهرموني المكمل (SHEM) الذي يحتوي على 2U / مل من Dispase II. أغلق الختم وضعه في 4 درجات مئوية لمدة 14-16 ساعة.
    5. جهز زوجا من الملقط والملاقط بدون أسنان وجهاز استعادة القزحية ومعقم جراحي.
    6. تحت المجهر الجراحي ، افصل ظهارة القرنية برفق على طول حافة القرنية.
    7. اغسل ظهارة القرنية باستخدام 1x HBSS يحتوي على 10٪ بنسلين ستربتومايسين لمدة 5 دقائق.
    8. انقل الأنسجة الظهارية للقرنية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل يحتوي على 200 مل من التربسين واحتضانه في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ ، 37 درجة مئوية. كل 5 دقائق ، قم بهز أنبوب الطرد المركزي ثلاث مرات لهضم الصفيحة الظهارية للقرنية في معلق أحادي الخلية.
    9. أضف كمية متساوية من وسط SHEM لإيقاف عمل محلول هضم التربسين وضعه في RT.
  6. استنساخ الخلايا الظهارية للقرنية
    1. تحضير خلايا الأرومة الغاذية.
      1. عندما تصل كثافة نمو خلايا الفأر NIH 3T3 إلى 80-90٪ ، تخلص من وسط زراعة الخلايا. أضف 10 مجم / مل من وسط ثقافة الميتومايسين NIH 3T3 المحضر مسبقا واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة.
      2. قم بإزالة الوسط ، واشطف الخلايا ب 1x HBSS ، واستبدلها بوسط خلية NIH 3T3 جديد ، واستمر في الحضانة في حاضنة CO2 (5٪ CO2 ، 37 °C).
    2. تحضير تعليق الخلايا الظهارية للقرنية وعد الخلايا حسب النسبة المطلوبة.
    3. أثناء تحضير تعليق الخلايا الظهارية للقرنية ، قم بمعالجة خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 المعالجة بالميتومايسين.
      1. تخلص من المادة الطافية ، واشطف الخلايا باستخدام 1x HBSS ، وأضف 1 مل من محلول التربسين-EDTA ، واحتضن في RT لمدة 2-3 دقائق.
      2. أضف كمية متساوية من الوسط الظهاري الهرموني التكميلي (وسيط SHEM: DMEM/F12، 10 نانوغرام/مل عامل نمو بشرة الفأر [EGF]، 10 ميكروغرام/مل من الأنسولين-ترانسفيرين-سيلينيوم [ITS]، 5٪ FBS، 1٪ بنسلين-ستربتومايسين، 0.5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]، 0.5 ملغم/مل هيدروكورتيزون)، ماصة برفق لعمل تعليق الخلية، وعد الخلايا.
    4. استخدم لوحا من 12 بئرا وأضف 0.5 مل من وسط SHEM إلى كل بئر.
    5. امزج الخلايا الظهارية للقرنية مع خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 بكثافة 500 خلية ظهارية للقرنية / سم2 و 5 × 105 خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 / سم2. أضف 1 مل من وسط SHEM إلى كل بئر.
    6. أضف 1 مل من خليط الخلية إلى كل بئر وقم بلطف الماصة لتوزيع الخلايا بالتساوي.
    7. احتضان في حاضنة (5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 37 درجة مئوية) ، وقم بتغيير الوسط كل 2-3 أيام. الثقافة لمدة 12-14 يوما.
  7. تلطيخ البنفسجي الكريستالي
    1. بعد حوالي 12 يوما ، عندما تكون المستنسخة الظهارية للقرنية على وشك الاندماج ، قم بإزالة وسط الثقافة وأضف 1 مل من محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ إلى كل بئر ، مع تغطية الخلايا بالكامل. قم بإصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة في RT.
    2. قم بإزالة 4٪ بارافورمالدهايد واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    3. قم بإزالة 1x PBS المؤقت وأضف محلول صبغة البنفسج البلوري بنسبة 0.4٪ إلى كل بئر. وصمة عار لمدة 30 دقيقة في RT.
    4. قم بإزالة أو إعادة تدوير محلول صبغة البنفسج البلوري واغسله ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة 10 دقائق لكل منهما.
    5. جفف الآبار بالهواء في RT حتى تجف تماما.
    6. استخدم نظام تصوير مجهر عمودي عادي (سرعة المسح: 4 ميكرو ثانية/بكسل، دقة المسح: 1024 × 1024).
  8. استخراج mRNA للقرنية
    1. اجمع مقص العيون ، ومقص القرنية ، والملقط المسنن ، ومكشطة ظهارة القرنية الكهربائية ، و Trizol ، وأنابيب الطرد المركزي الخالية من RNase سعة 1.5 مل ، وصندوق ثلج.
    2. اقتناء الظهارة
      1. قم بتخدير الفئران بنسبة 4-5٪ من الأيزوفلوران والقتل الرحيم بعد خلع عنق الرحم. ضع في وضع جانبي. قم بقص شعيرات الماوس بمقص العين لتجنب حجب الرؤية.
      2. ضع الجرذ تحت المجهر الجراحي واضبطه على ارتفاع مناسب للتركيز على مقلة العين. استخدم ملقط مسنن لدفع مقلة العين وفضحها برفق. ارفع ملتحمة الفئران واستخدم مكشطة ظهارية قرنية كهربائية نظيفة لكشط المنطقة المركزية 2 مم من ظهارة القرنية.
      3. اجمع ظهارة القرنية المكشطة باستخدام ملقط نظيف مسنن مرشوش بالكحول. ضع الأنسجة المجمعة في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 1 مل من Trizol.
      4. اعمل في أسرع وقت ممكن لشطف الأنسجة المجمعة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على ماء مزدوج منزوع الأيونات. امتصاص الماء الزائد بورق الترشيح. رش بالكحول بنسبة 75٪ وانتقل إلى الخطوة التالية.
      5. ارفع ملتحمة الفئران مرة أخرى باستخدام ملقط مسنن. استخدم مقص القرنية مع الجانب المقعر لأعلى لقطع الملتحمة على طول الأطراف ، مع ترك حوالي 0.5 مم من الملتحمة البيضاء.
      6. اكشط ظهارة القرنية في نطاق 2 مم في طيفي القرنية باستخدام الكاشطة الكهربائية. اجمع الأنسجة كما هو موضح من قبل. اجمع ظهارة القرنية المركزية من ثلاث مقل العيون والظهارة الحزوية من ثلاث مقل عيون.
      7. ضع الأنسجة المجمعة في أنابيب كاشف منفصلة لاستخراج Trizol RNA سعة 1 مل. قم بإجراء العملية بأكملها على الجليد للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. تابع الخطوات التالية على الفور أو قم بتخزين العينات في فريزر بدرجة حرارة منخفضة للغاية عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
    3. قم بإذابة العينة على الجليد ، واستخدم مخالط الأنسجة بالموجات فوق الصوتية لتحلل الخلايا. اضبط قوة الخالط بالموجات فوق الصوتية على 25٪ ، والوقت إلى 2 ثانية لكل رشقة ، ووقت الفاصل الزمني إلى 5 ثوان ، والوقت الإجمالي إلى 2 دقيقة. اتركه يقف على الجليد لمدة 10 دقائق.
    4. أضف الكلوروفورم (1/5 من الحجم الكلي ، حوالي 200 ميكرولتر) إلى كل عينة ، واخلطها جيدا عن طريق التقليب لمدة 30 ثانية ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. ترسيب الحمض النووي الريبي
      1. بعد الطرد المركزي ، يتم تقسيم السائل الموجود داخل أنبوب الطرد المركزي إلى ثلاثة أجزاء. الطبقة الصافية العليا هي الحمض النووي الريبي ، والطبقة البيضاء الوسطى الغائمة هي الحمض النووي والبروتينات ، والطبقة السفلية هي Trizol. قم بعمل ماصة بعناية حوالي 500 ميكرولتر من الطبقة الشفافة العلوية في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل، مع الحرص على عدم شفط الراسب الأبيض في الطبقة الوسطى. إذا تم الاستنشاق عن غير قصد ، كرر الطرد المركزي لجمع الطبقة الشفافة مرة أخرى.
      2. أضف كمية متساوية من الأيزوبروبانول المبرد مسبقا إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على الطبقة الشفافة ، حوالي 500 ميكرولتر ، اقلب الأنبوب عدة مرات لخلطه جيدا ، ثم ضعه على الفور في فريزر بدرجة حرارة منخفضة للغاية -80 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. تهدف هذه الخطوة إلى تسريع ترسيب الحمض النووي الريبي.
    6. أخرج العينة ، وقم على الفور بجهاز الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تظهر كمية صغيرة من الراسب الأبيض غير المستقر في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية.
    7. أضف 70٪ إيثانول معد مسبقا ومبرد بالثلج إلى كل أنبوب. جهاز طرد مركزي على الفور عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد عند 400 × جم لمدة 10 دقائق تقريبا ؛ كرر الخطوات المذكورة أعلاه مرة واحدة لغسل الراسب جيدا. في هذه الخطوة ، قم بتعقيم غطاء الدخان مسبقا بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
    8. بعد إزالة أنابيب الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية ، يتم استخدام جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 4 درجات مئوية عند حوالي 250 × جم لمدة دقيقتين. استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لشفط الكحول الزائد بعناية من الجانب المقابل للراسب ، وتجفيفه جيدا قدر الإمكان. ضعه في غطاء دخان معقم مسبقا للأشعة فوق البنفسجية حتى يجف ، وجفف الراسب في الهواء لمدة 15 دقيقة تقريبا.
    9. قم بإعداد المحلول عن طريق إضافة 1 مل من مثبط RNase إلى 40 مل من ماء ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC). أضف كمية مناسبة من خليط مثبط الماء / RNase DEPC ، حوالي 20-30 ميكرولتر ، لإذابة العينة. إذا كان هناك الكثير من الرواسب ، أضف 30-50 ميكرولتر.
  9. النسخ العكسي PCR
    1. تأكد من وجود هذه العناصر: جهاز PCR ، وأنابيب طرد مركزي خالية من RNase سعة 1.5 مل ، وأنابيب PCR سعة 0.2 مل ، وحمام جليدي أو صندوق ثلج ، وماصة ، وأطراف خالية من RNase.
    2. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير. لكل عينة ، تأكد من إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي إلى نظام التفاعل.
    3. يبلغ الحجم الإجمالي لنظام النسخ العكسي 20 ميكرولتر. احسب الكمية الإجمالية للكواشف المطلوبة بناء على عدد العينات. تخلط حسب النسبة المحددة في التعليمات.
    4. قم بإعداد نظام التفاعل على الجليد ، وقم بدوامه ، وقم بطرده المركزي لفترة وجيزة. احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وعند 90 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
    5. استخدم (كدنا) الذي تم الحصول عليه من عملية النسخ العكسي إما مباشرة لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي أو تخزينه في ثلاجة -80 درجة مئوية.
  10. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي
    1. استخدم مجموعة كاشف PCR الكميفي الوقت الفعلي 17 مع نظام تفاعل 10 ميكرولتر. استخدم التسلسلات التمهيدية الموضحة في الجدول 1.
    2. أضف نظام التفاعل الموصوف أعلاه إلى لوحة 96 بئرا أو أنبوب من ثمانية شرائط خصيصا ل RT-PCR. تأكد من خلط العينات جيدا. تحقق من وجود فقاعات في الأنابيب قبل وضعها على جهاز PCR.
    3. قم بتضخيم الجين باستخدام دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق) ، و 40 دورة (95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، وأكمل البيانات لحساب قيمة 2-ΔΔ Ct. معالجة البيانات وتحليلها ورسمها باستخدام برنامج تحليل البيانات المناسب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 1 أ ، من خلال الملاحظة باستخدام مصباح شقي ، وجدنا أن شفاء ظهارة القرنية قد ضعف. في ظل الظروف العادية ، تلتئم ظهارة القرنية المركزية تماما في غضون 24-48 ساعة بعد الإزالة ، ولكن في استئصال ظهارة القرنية المركزية جنبا إلى جنب مع نموذج الخياط?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يلعب الالتهاب دورا رئيسيا في تطور نقص الخلايا الجذعية الحوفي18 ، لكن آلياته وآثاره المحددة تتطلب مزيدا من الاستكشاف. لمعالجة هذه المشكلة ، قمنا بتحفيز LSCD عن طريق كشط ظهارة القرنية المركزية وخياطة سدى القرنية المركزية لإحداث التهاب شديد في القرنية. لاحظنا تط...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مشاريع العلوم والتكنولوجيا بمقاطعة قويتشو (QKHJC-ZK [2024] ZD043) ، وصندوق العلوم بمقاطعة فوجيان للعلماء الشباب المتميزين (2023J06053 [إلى S.O]) ؛ مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية (رقم 82101084 [إلى S.O.] ومجلس المنح الدراسية الصيني (CSC ، 202306310049 [إلى YW]).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10-0 suture lineAlcon, Inc., USA8065698001
2 mm corneal trephineSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, 1 mL pipette gun heads, cell culture plate culture plates, centrifuge tubesGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chinahttps://www.jetbiofil.com/index.html
-20/-80 °C fridgeQingdao Haier Company, Chinahttps://www.haier.com/cn/
A 10-mL syringe Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chinahttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Adhere to the slideShiTai Company188105
Amylene alcoholShanghai. Macklin Biochemical, Chinahttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, United Kingdomab76318
Anti-Keratin 12 antibody EPR17882Abcam, United Kingdomab185627
Anti-PAX6 antibodyAbcam, United Kingdomab195045
Anti-stripping slides, cover slipsJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd., Chinahttps://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, Japanhttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Chinahttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
CO2 Oven incubator, ultrasonic crusher, centrifugeThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Confocal microscopeShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chinahttps://www.clinx.cn/about
Corneal epithelial forcepsSuzhou XVI Vision Company, China53418D
DAPIVector. Inc., USAH-1000
DEPC water Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
Dicuro eye cream (ofloxacin eye cream)Santian Pharmaceutical Corporation, Japanhttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, culture medium, double antibody, and PBSThermo Fisher Scientific, Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, United Kingdom MCA341GA
Electronic balanceShanghai Ohaus Biotechnology Company, Chinahttp://shbio.com/company
Enclosure of the membraneParafilm, Inc., USAhttps://www.sigmaaldrich.cn
Fluorescein sodium test strip was used in ophthalmologyTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinahttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Fluorescent inverted phase-contrast micrographic systemTE-2000U, Nikon, Japanhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Frozen table-top centrifugeEppendorf, Germanyhttps://www.eppendorf.sh.cn 
Glass sheet frameXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://www.tagene.net/
H-1200 with DAPI sealagentXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Chinahttps://www.bosonbio.com.cn/
HE staining kitAuragene, Chinahttp://jushengwu.com/a048/
Hematoxylin-eosin dye solution kitAURAGEN, United StatesP032IH
High and low precision electronic balanceSdolis, Germanyhttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinahttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67 antibodyAbcam, United Kingdomab16667
liquid nitrogenXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chinahttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Microhand holderSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Multiformaldehyde powderSigm, Americahttps://www.sigmaaldrich.cn
Normal temperature centrifuge 46Eppendorf, Germanyhttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China4583
Ordinary biological micrographic systemEclipse 50i, Nikon, Japanhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChinaSH30256.01
PCR, and the reactor apparatusBiometra Thermocycler, Germanyhttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipettes of various specificationsEppendorf Company, Germanyhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers for Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaine hydrochloride 0.5% eye dropsAlcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Rat PMN antibodyFitzgerald, United States20R-PR020
Real time fluorescence quantitative PCRApplied Biosystems, United Stateshttps://www.thermofisher.cn
Reverse transcription kitTAKARA, Japanhttps://www.takarabiomed.com.cn/
Slit lampTOPCON, Japanhttps://topconchina.cn/
Smooth forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://chuangdianbio.com/
Superclean benchNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singaporehttps://www.hi-p.com/
Toothed forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Toppicamide eye drops (Medol)Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Trace nucleic acid protein concentration testerThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen The United Stateshttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, with a surgical microscopeCarl ZEIS, Germanyhttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html

References

  1. Ang, L. P., Tan, D. T. Ocular surface stem cells and disease: Current concepts and clinical applications. Ann Acad Med Singap. 33 (5), 576-580 (2004).
  2. Mao, Y., et al. Downregulation of p38 MAPK signaling pathway ameliorates tissue-engineered corneal epithelium. Tissue Eng Part A. 28 (23-24), 977-989 (2022).
  3. Sprogyte, L., Park, M., Di Girolamo, N. Pathogenesis of alkali injury-induced limbal stem cell deficiency: A literature survey of animal models. Cells. 12 (9), 1294(2023).
  4. He, X., et al. Lacrimal gland microenvironment changes after obstruction of lacrimal gland ducts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (3), 15(2022).
  5. Le, Q., Chauhan, T., Deng, S. X. Diagnostic criteria for limbal stem cell deficiency before surgical intervention- A systematic literature review and analysis. Surv Ophthalmol. 65 (1), 32-40 (2020).
  6. Li, W., Hayashida, Y., Chen, Y. T., Tseng, S. C. Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus. Cell Res. 17 (1), 26-36 (2007).
  7. Ou, S. K., et al. The role of ectodysplasin a on the ocular surface homeostasis. Int J Mol Sci. 23 (24), 12(2022).
  8. Lin, S., et al. Limbal stem cell dysfunction induced by severe dry eye via activation of the p38 MAPK signaling pathway. Am J Pathol. 193 (11), 1863-1878 (2023).
  9. Jiang, G. J., Li, B. B., Fan, T. J. Timolol induces necroptosis, apoptosis and senescence concentration-dependently in rabbit limbal stem cells in vitro. Life Sci. 277, 119453(2021).
  10. Castro-Munozledo, F. Review: Corneal epithelial stem cells, their niche and wound healing. Mol Vis. 19, 1600-1613 (2013).
  11. Atalay, E., et al. Animal models for limbal stem cell deficiency: A critical narrative literature review. Ophthalmol Ther. 13 (3), 671-696 (2024).
  12. Delic, N. C., Cai, J. R., Watson, S. L., Downie, L. E., Di Girolamo, N. Evaluating the clinical translational relevance of animal models for limbal stem cell deficiency: A systematic review. Ocul Surf. 23, 169-183 (2022).
  13. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  14. Ye, J., et al. Biomimetic nanocomplex based corneal neovascularization theranostics. J Control Release. 374, 50-60 (2024).
  15. Zhu, H. M., et al. A synergistic therapy with antioxidant and anti-VEGF: Toward its safe and effective elimination for corneal neovascularization. Adv Healthc Mater. 13 (5), 10(2024).
  16. Yu, J. W., et al. In vivo assembly drug delivery strategy based on ultra-small nanoparticles: Toward high drug permeation and accumulation for CNV treatment. Chem Eng J. 450, 137968(2022).
  17. Wu, H., et al. A SU6668 pure nanoparticle-based eyedrops: Toward its high drug accumulation and long-time treatment for corneal neovascularization. J Nanobiotechnol. 22 (1), 290(2024).
  18. Long, Q., et al. A novel tissue-engineered corneal epithelium based on ultra-thin amniotic membrane and mesenchymal stem cells. Sci Rep. 14 (1), 17407(2024).
  19. Giroux, V., Rustgi, A. K. Metaplasia: Tissue injury adaptation and a precursor to the dysplasia-cancer sequence. Nat Rev Cancer. 17 (10), 594-604 (2017).
  20. Herfs, M., Hubert, P., Delvenne, P. Epithelial metaplasia: Adult stem cell reprogramming and (pre)neoplastic transformation mediated by inflammation. Trends Mol Med. 15 (6), 245-253 (2009).
  21. Slack, J. M. Metaplasia and transdifferentiation: From pure biology to the clinic. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 369-378 (2007).
  22. Slack, J. M., Tosh, D. Transdifferentiation and metaplasia--switching cell types. Curr Opin Genet Dev. 11 (5), 581-586 (2001).
  23. Wang, S., et al. Impact of chronic smoking on meibomian gland dysfunction. PLoS One. 11 (12), e0168763(2016).
  24. Wu, Y., et al. Evolution of therapeutic strategy based on oxidant-antioxidant balance for fuchs endothelial corneal dystrophy. Ocul Surf. 34, 247-261 (2024).
  25. Li, Y., et al. Meibomian gland alteration in patients with systemic lupus erythematosus. Lupus. 31 (4), 407-414 (2022).
  26. Zhang, Y., et al. Histopathology-based diagnosis of Mooren's ulcer concealed beneath the pterygium on eye. J Histotechnol. 45 (4), 195-201 (2022).
  27. Tseng, S. C., Hatchell, D., Tierney, N., Huang, A. J., Sun, T. T. Expression of specific keratin markers by rabbit corneal, conjunctival, and esophageal epithelia during vitamin A deficiency. J Cell Biol. 99 (6), 2279-2286 (1984).
  28. Espana, E. M., et al. Characterization of corneal pannus removed from patients with total limbal stem cell deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9), 2961-2966 (2004).
  29. Li, W., et al. Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (1), 154-162 (2008).
  30. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Exp Eye Res. 161, 101-105 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved