JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פיתחנו מודל חולדה של דלקת קרנית חמורה באמצעות גרידת אפיתל בקרנית בשילוב עם תפרים בקרנית. המחקר העריך דפוסי דלקת בקרנית, התפשטות אפיתל ושינויים בתאי גזע לימבליים בתנאים דלקתיים.

Abstract

דלקת בקרנית, במיוחד דלקת קרנית חמורה, ממלאת תפקיד משמעותי בהתפתחות תפקוד לקוי של תאי גזע לימביים בקרנית. בניית מודלים מתאימים של בעלי חיים יכולה לעזור לנו להתמקד בהשפעות של דלקת חמורה על תאי גזע לימבליים בקרנית. מסיר חלודה בקוטר 2 מ"מ שימש להסרת אפיתל הקרנית המרכזי של חולדות Sprague Dawley (SD) כדי ליצור פציעה. לאחר מכן, הסטרומה המרכזית של הקרנית נתפרה בתפרי ניילון כדי לגרום לדלקת מתמשכת. באופן זה נבנה מודל דלקת בקרנית עם שחיקה של אפיתל מרכזי בקרנית ותפירת סטרומה מרכזית, שגרמה לדלקת קרנית חמורה. נצפו השינויים בדלקת הקרנית ובמצב תאי הגזע הלימבליים לאחר 1, 3 ו-7 ימים לאחר המודל. ביוםהשלישי לאחר המודל, לימבוס הקרנית של החולדות היה בצקתי חמור, עם ניאו-וסקולריזציה ברורה והיפרפלזיה מקומית, שהם סימנים אופייניים למחסור בתאי גזע לימבליים. ביום השביעי, בצקת הקרנית החמירה בהדרגה, והניאו-וסקולריזציה המשיכה להתגבר. באמצעות תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך כמותי (RT-qPCR) וצביעה אימונופלואורסצנטית, מצאנו כי הגורמים הדלקתיים של אפיתל הקרנית היו מווסתים באופן משמעותי, התמיינות האפיתל של הקרנית הייתה חריגה, תאי הגזע של אפיתל הקרנית הופחתו משמעותית, וגם התפשטות התאים והגזע פחתו. לכן, מודל זה מדגים שדלקת חמורה יכולה לגרום לנזק לתאי גזע לימבליים מבלי לפגוע ישירות בתאי הגזע הלימבליים. המודל מועיל להתבוננות בהשפעות של דלקת חמורה על המנגנונים הביולוגיים של תאי גזע ומספק פלטפורמה אידיאלית לחקר המנגנונים של תפקוד לקוי של תאי גזע אפיתל בקרנית הנגרם על ידי דלקת.

Introduction

תפקוד לקוי של תאי גזע לימבליים (LSCD) מאופיין במומים אפיתליים מתמשכים, כלי דם בקרנית, דלקת כרונית, צלקות ולחמית של הקרנית 1,2. זה יכול לנבוע מדלדול או תפקוד לקוי של תאי גזע לימבליים לאחר מחלות קשות על פני העין, כגון כוויות כימיות, כוויות תרמיות, תסמונת סטיבנס-ג'ונסון ופגיעה יאטרוגנית הנגרמת מניתוחי עיניים 2,3,4. המנגנונים הפתוגניים של LSCD כוללים בעיקר שינויים בתאי גזע והפרעות במיקרו-סביבה של תאי גזע 5,6, המשפיעים על ההומאוסטזיס של אפיתל הקרנית 2,7. ישנם שני סוגים עיקריים של שינויי גורל בתאי גזע לימבליים ב-LSCD: 1) פוטנציאל ההתמיינות הכיוונית של תאי גזע אפיתל בקרנית הופך להיות לא תקין, מה שמוביל להתמיינות שלהם לתאי אפיתל של העור. עדות לכך היא ירידה בביטוי של גורם שעתוק ספציפי לתאי אפיתל בקרנית Pax6 וקרטין ספציפיים לקרנית Krt12 ו-Krt3, לצד עלייה משמעותית בביטוי של סמני מטפלזיה אפיתל קשקשיים הקשורים לעור Krt10, Krt1 ו-Sprr1b8; 2) פגיעה במשטח העין הורסת ישירות תאי גזע לימבליים בקרנית, וכתוצאה מכך נמק או אפופטוזיס, וכתוצאה מכך גורמת לשגשוג רקמת הלחמית המכסה את הקרנית9. דווח כי במהלך התפתחות LSCD, תאים דלקתיים כגון מקרופאגים, נויטרופילים ותאים דנדריטיים גדלים משמעותית במיקרו-סביבת תאי הגזע של הקרנית. בהתאמה, ציטוקינים כגון אינטרפרון-גמא (IFN)-γ, גורם נמק גידול (TNF)-α, אינטרלוקין (IL)-1β וחלבונים דלקתיים מקרופאגים (MIP)-1α/β מראים גם הם עליות משמעותיות10.

מודלים שונים של LSCD הוקמו, כולל אלה המושרים על ידי תפרים, פציעות כימיות ואיתור בנזלקוניום כלוריד11. לכל אחד מהדגמים הללו היתרונות והחסרונות שלו. פגיעות כימיות עלולות לפגוע בכל פני העין ולהרוס ישירות תאי גזע לימבלים12. בנזלקוניום כלוריד מתפקד באופן דומה לפגיעות כימיות אך השפעתו איטית יחסית13. מודל תפר הקרנית יכול לגרום לתגובה דלקתית יציבה וארוכת טווח, אך התגובה הדלקתית קלה יחסית ואינה יכולה לגרום ל-LSCD.

כדי לחקור את תפקיד ומנגנוני הדלקת בהתפתחות LSCD בקרנית, הוקם מודל של בעלי חיים המשלב גרידה של אפיתל הקרנית המרכזי עם תפרים בקרנית. מודל זה גורם לדלקת מתמשכת של אפיתל הקרנית מבלי לפגוע ישירות בתאי גזע לימבליים.

Protocol

כל הנהלים תאמו את הנחיות ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של גוויג'ואו (אישור מס' 2305192). החולדות שוכנו במרכז החיות של האוניברסיטה הרפואית של גוויג'ואו, תוך הקפדה על תקנות ניהול בעלי חיים רלוונטיות.

1. בחירת בעלי חיים

  1. השתמש בחולדות Sprague-Dawley (SD) נקבות בגילאי 7-8 שבועות. ודא שאין נגעים במשטח העין בבדיקת מנורת חריץ.
  2. עקר את המכשירים באמצעות מעקר מהיר. המכשירים הנדרשים כוללים מסיר טבעת חלודה בקרנית, טוש דגימת עור בגודל 2 מ"מ, מחזיקי מחטים, סכינים בשכבת צלחת, מספריים כירורגיים לעיניים ומלקחיים.
  3. להרדים חולדות עם 1.25% טריברומו-אתנול באמצעות הזרקה תוך צפקית במינון של 0.3 מ"ל לכל 100 גרם משקל גוף. העריכו את עומק ההרדמה על ידי צביטת הבוהן. יש לטפטף טיפה אחת של טיפות עיניים טרופיקמיד להרחבת האישונים. יש למרוח טיפות עיניים bupivacaine hydrochloride על העין. השתמש במשחת סיכה לעיניים על העין הנגדית כדי לשמור על לחות.
  4. לחטא את העור והשיער סביב העיניים עם יודופור.
  5. קבע את מודל הדלקת.
    1. הנח את החולדה במצב דקוביטוס לרוחב. חשוף את גלגל העין תחת מיקרוסקופ הפעלה.
    2. הקרנית המרכזית סומנה באמצעות סמן דגימת עור בגודל 2 מ"מ, ואפיתל הקרנית המרכזי המסומן גורד באמצעות מסיר טבעת חלודה בקרנית.
    3. הנח שלושה תפרי קרנית של 120 מעלות באמצעות חוט ניילון 10-0, מחזיק מחט ומספריים ומלקחיים כירורגיים לעיניים במרחק של כ-3 מ"מ מהלימבוס, אל תחדור לקרנית 14,15.
  6. יש למרוח משחת עיניים אופלוקסצין בסוף ההליך למניעת זיהום.
  7. התבונן וצלם את הקרניתביום הראשון,השלישי והשביעי לאחר הניתוח באמצעות מנורת חריץ מוגדלת פי 10. רשום את התסמינים כגון ריפוי אפיתל בקרנית, היפרמיה של הלחמית, בצקת בקרנית, היפרמיה לימבלית וניאו-וסקולריזציה של הקרנית.

2. חישוב המדד הדלקתי

  1. לחשב את האינדקס הדלקתי של משטח העין לאחר קביעת מודל החיות.
    1. ציון גודש בגוף הרירי באופן הבא: אין גודש (0 נקודות); נוכחות של גודש פחות מ -1 מ"מ (נקודה אחת); היפרמיה בין 1 מ"מ ל -2 מ"מ (2 נקודות); היפרמיה בין 1 מ"מ ל -2 מ"מ (3 נקודות).
    2. ציון בצקת מרכזית בקרנית באופן הבא: ללא בצקת (0 נקודות); בצקת עם נראות קשתית ברורה (נקודה אחת); בצקת עם ראות קשתית לא ברורה (2 נקודות); בצקת עם הקשתית לא נראית (3 נקודות).
    3. ציון בצקת בקרנית פרה-מרכזית באופן הבא: ללא בצקת (0 נקודות); בצקת עם נראות קשתית ברורה (נקודה אחת); בצקת עם ראות קשתית לא ברורה (2 נקודות); בצקת עם הקשתית לא נראית (3 נקודות).
    4. חשב את מדד הדלקת על ידי הוספת כל הציונים וחלוקתו ב-9.

3. הערכת ניאו-וסקולריזציה של הקרנית

  1. התבונן בניאו-וסקולריזציה של הקרנית עם מנורת חריץ.
    1. נתח ועבד תמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה של מנורת חריץ16.
    2. רשום את הצמיחה של ניאו-וסקולריזציה של הקרנית בכל נקודת זמן תצפית, ומדוד את הניאו-וסקולריזציה הארוכה ביותר של הקרנית לכיוון מרכז הקרנית עם עקמומיות מינימלית.
    3. דרג אותם באופן הבא: כיתה 0: אווסקולרי; כיתה 1: מיקרו (<1 מ"מ); דרגה 2: קל (1 מ"מ עד 1.5 מ"מ); דרגה 3: בינוני (>1.5 מ"מ עד 2 מ"מ); דרגה 4: חמור (>2 מ"מ).

4. ניתוח הביולוגיה של המודל

  1. הכן דגימות עיניים קפואות.
    1. להרדים את החולדה עם 4-5% איזופלורן ולהמית אותה על ידי פריקת צוואר הרחם.
    2. במצב דקוביטוס לרוחב, הרם את גלגל העין של החולדה כלפי חוץ בעזרת פינצטה מיקרו וחתוך את הלחמית לאורך כיפת העין העליונה והתחתונה בעזרת מספריים.
    3. חתוך את עצב הראייה, תוך שימת לב לשמירה על שלמות אפיתל הקרנית.
    4. יבש את כתמי הדם והמים על משטח גלגל העין עם נייר פילטר והכניס אותם לקופסת ההטבעה עם מדיום הטמעה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).
    5. הסר את הבועות בקופסת ההטבעה בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר, הקפיא אותה באמצעות חנקן נוזלי ולאחר מכן שמור את הדגימות המוטבעות במקרר בטמפרטורה נמוכה במיוחד.
  2. הכן חלקים קפואים של גלגלי העיניים.
    1. לפני הכנת החלק הקפוא, יש לקרר את הקריוסטט לכ-28 מעלות צלזיוס ואת מחזיק הדגימה ל-26 מעלות צלזיוס.
    2. מוציאים את הדגימות הקפואות מהמקפיא הקר ומניחים אותן בקריוטום למשך כשעה.
    3. מצננים מראש את הדגימה הקפואה בקריוטום למשך 10 דקות. סמן את הדגימה בעיפרון, קבע אותה על כרית הדגימה עם OCT, וקבע אותם יחד על מתלה החיתוך לאחר הקירור.
    4. התאם את המיקום והכיוון של הדגימה הקפואה ותקן אותה. ראשית, חותכים קטעים של 20 מיקרומטר עד שרואים את הקרנית המרכזית. לאחר מכן, השג חתכים של 6 מיקרומטר על ידי חיתוך רציף ואסוף את החלקים על שקופיות ההדבקה שהוכנו מראש.
    5. סמן את השם, החומר, זמן המקטע, השם ומספר הרקמה בשקופית. מניחים אותו בטמפרטורת החדר (RT) למשך כ -30 דקות.
    6. לאחר ייבוש החלקים, הכניסו אותם לקופסה ושמרו אותם במקרר בטמפרטורה נמוכה במיוחד לשמורה.
  3. בצע צביעת המטוקסילין ואאוזין.
    1. הסר את החלקים הקפואים שהוכנו מראש מהמקרר בטמפרטורה נמוכה במיוחד והנח אותם במכסה האדים ב-RT לייבוש.
    2. תקן את החלקים באמצעות 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות ב-RT. שטפו את הדגימות עם 1x PBS למשך 5 דקות.
    3. הנח את חלקי הדגימה המכילים שקופיות על מחזיק שקופיות וטבל אותם לתוך גליל הצבע עם תמיסת צבע המטוקסילין ב-RT למשך 5 דקות.
    4. שטפו לאט את הדגימה המכילה שקופיות במי ברז כדי לשטוף את הצבע הצף, הכניסו אותם למיכל הצבע עם 0.1% אלכוהול חומצה הידרוכלורית, והוציאו אותם במהירות לאחר 1-2 שניות.
    5. שטפו לאט את הדגימה במי ברז למשך 15 דקות.
    6. הסר את הדגימה מהמים וטבל את השקופיות במיכל הצבע של אאוזין; השאירו ב-RT למשך 3 דקות.
    7. שטפו לאט את הדגימה במי ברז, שטפו את עודפי הצבע ובצעו התייבשות אלכוהול שיפוע באמצעות 75% אלכוהול, 80% אלכוהול, 95% אלכוהול, 100% אלכוהול (אחד) ו-100% אלכוהול (שניים). מסדרים את החלקים בכל ריכוז למשך 2 דקות.
    8. הפוך את הדגימות לשקופות למשך 2 דקות בקסילן (1) וקסילן (2) בהתאמה.
    9. יבש את הדגימה במכסה האדים, אטום את החלקים באמצעות חומר איטום והיזהר לא לייצר בועות.
    10. מקם את השקופיות בתיבת שקופיות ב- RT. דמיין את המקטעים באמצעות מיקרוסקופ.
  4. בצע צביעה אימונופלואורסצנטית.
    1. הסר את החלקים הקפואים והנח אותם בקופסה ב-RT במכסה האדים לייבוש.
    2. סמן את שם הנוגדן שיוכתם בשקופית הזכוכית הריקה של הדגימה הקפואה.
    3. תקן את הדגימות עם 4% פרפורמלדהיד ב-RT למשך 15 דקות. כמות קטנה של מי ברז נוספה לקופסה כדי למנוע את התייבשות הדגימה.
    4. הסר את הקיבוע הפרפורמלדהיד ושטוף את הדגימה שלוש פעמים עם מאגר PBS 1x. היזהר לא לשטוף את הדגימה.
    5. יבש את הנוזל סביב קטע הרקמה, כסה את הדגימה בתמיסת קרום התא (0.2% TritonX-100), ודגר ב-RT למשך 20 דקות.
    6. הסר את תמיסת קרום התא ושטוף את החלקים שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחד עם מאגר PBS 1x.
    7. יבש את חלקי הרקמה, כסה את הדגימה בתמיסת חסימת אימונופלואורסצנציה (2% BSA), ודגר ב-RT למשך שעה.
    8. יש להכין את הנוגדן והמדלל העיקרי (1% BSA) במהלך הדגירה לפי הוראות היצרן.
    9. הסר את הנוזל החוסם וייבש את הדגימה בעזרת משאבת יניקה. מוסיפים את הנוגדן הראשוני המוכן, מכסים את הקופסה ומדגרים אותו במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (מדגרים כ-12-16 שעות) הרחק מהאור.
    10. השליכו את הנוגדן העיקרי ושטפו את הדגימה ארבע פעמים למשך 10 דקות כל אחת ב-PBS.
    11. במהלך שלב הניקוי, הכינו את דילול הנוגדנים המשני לפי הוראות היצרן.
    12. הסר PBS, יבש את הדגימה והוסף את הנוגדן המשני המוכן לדגימה. כסו את הדגימה ודגרו ב-RT למשך שעה אחת מהאור.
    13. הסר את הנוגדן המשני, שטוף את הדגימה 4 פעמים עם מאגר PBS 1x למשך 10 דקות כל אחד, וכסה את כל השקופית במאגר PBS 1x.
    14. הסר PBS, יבש את הדגימה ואטום את החלקים באמצעי הרכבה המכיל DAPI, וודא שאין בועות אוויר. עוטפים את השקופיות בנייר כסף ושומרים אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס הרחק מאור.
    15. צלם תמונות עם מערכת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי או עם מערכת מצלמות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף (מהירות סריקה: 4 מיקרון/פיקסל, רזולוציית סריקה: 1024 x 1024).
  5. הכנת תרחיף חד-תאית של אפיתל קרנית החולדה
    1. לאחר המתת חסד, יש להסיר את גלגלי העיניים בעזרת פינצטה ספוגה ב-75% אלכוהול ולהכניס אותם לתמיסת המלח המאוזנת של 1x Hanks' (HBSS) המכילה 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-10% פניצילין-סטרפטומיצין שהוכן מראש.
    2. נקו את גלגלי העיניים והשתמשו ב-1x HBBS המכיל 10% FBS ו-10% פניצילין-סטרפטומיצין פעמיים למשך 5 דקות כל אחד.
    3. הסר את הלחמית לאורך השוליים הסקלרליים; השאירו את השוליים הסקלריים על כ -1 מ"מ. שוב, שטפו את רקמת הקרנית פעמיים עם 1x HBBS המכיל 10% FBS ו-10% פניצילין-סטרפטומיצין.
    4. העבירו את רקמת הקרנית הנקייה למדיום אפידרמיס הורמונלי (SHEM) המכיל 2U/mL של Dispase II. סגור את החותם והנח אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 14-16 שעות.
    5. הכינו זוג פינצטה, פינצטה ללא שיניים, מכשיר לשחזור קשתית ומעקר כירורגי.
    6. תחת מיקרוסקופ כירורגי, הפרד בעדינות את אפיתל הקרנית לאורך קצה הקרנית.
    7. שטפו את אפיתל הקרנית עם 1x HBSS המכיל 10% פניצילין-סטרפטומיצין למשך 5 דקות.
    8. מעבירים את רקמת האפיתל של הקרנית לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 200 מ"ל טריפסין ודוגרים באינקובטור 5% CO2, 37 מעלות צלזיוס. כל 5 דקות, יש לנער את צינור הצנטריפוגה שלוש פעמים כדי לעכל את יריעת האפיתל של הקרנית לתרחיף חד-תאי.
    9. הוסף כמות שווה של מדיום SHEM כדי לעצור את פעולת תמיסת העיכול של טריפסין ולהניח אותו ב-RT.
  6. תרבית שיבוט של תאי אפיתל בקרנית
    1. הכן תאי טרופובלסטים.
      1. כאשר צפיפות הצמיחה של תאי עכבר NIH 3T3 מגיעה ל-80-90%, השליכו את מדיום תרבית התאים. הוסף 10 מ"ג/מ"ל NIH 3T3 מדיום תרבית מיטומיצין מוכן מראש ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות.
      2. הסר את המדיום, שטוף תאים עם 1x HBSS, החלף במדיום תאי NIH 3T3 חדש והמשך בדגירה בחממת CO2 (5% CO2, 37 °C).
    2. הכן את תרחיף תאי האפיתל בקרנית וספור את התאים לפי היחס הנדרש.
    3. בזמן הכנת תרחיף תאי האפיתל בקרנית, עבד תאי NIH 3T3 שטופלו במיטומיצין.
      1. יש להשליך את הסופרנטנט, לשטוף תאים עם 1x HBSS, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA ולדגור ב-RT למשך 2-3 דקות.
      2. הוסף כמות שווה של מדיום אפיתל הורמונלי משלים (מדיום SHEM: DMEM/F12, גורם גדילה אפידרמלי של עכבר 10 ננוגרם/מ"ל [EGF], 10 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין-טרנספרין-סלניום [ITS], 5% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 0.5% דימתיל סולפוקסיד [DMSO], 0.5 מ"ג/מ"ל הידרוקורטיזון), פיפטה בעדינות ליצירת תרחיף תאים וספירת התאים.
    4. השתמש בצלחת של 12 בארות והוסף 0.5 מ"ל מדיום SHEM לכל באר.
    5. מערבבים תאי אפיתל קרנית עם תאי NIH 3T3 בצפיפות של 500 תאי אפיתל קרנית/ס"מ2 ו-5 x 105 תאי NIH 3T3/ס"מ2. הוסף 1 מ"ל של מדיום SHEM לכל באר.
    6. מוסיפים 1 מ"ל מתערובת התאים לכל באר ופיפטה בעדינות כדי לפזר את התאים באופן שווה.
    7. דגירה בחממה (5% CO2, 37 מעלות צלזיוס), החלפת המדיום כל 2-3 ימים. תרבות למשך 12-14 יום.
  7. מכתים סגול קריסטל
    1. לאחר כ -12 יום, כאשר שיבוטי אפיתל הקרנית עומדים להתמזג, הסר את מדיום התרבות והוסף 1 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד 4% לכל באר, מכסה את התאים לחלוטין. תקן את התאים למשך 15 דקות ב-RT.
    2. הסר 4% פרפורמלדהיד ושטוף את הבארות שלוש פעמים עם 1x PBS למשך 5 דקות כל אחת.
    3. הסר 1x PBS buffer והוסף תמיסת צבע סגול קריסטל 0.4% לכל באר. כתם למשך 30 דקות ב-RT.
    4. הסר או מחזר את תמיסת הצבע הסגול קריסטל ושטוף אותה שלוש פעמים עם 1x PBS למשך 10 דקות כל אחת.
    5. יבש את הבארות באוויר ב-RT עד לייבוש יסודי.
    6. השתמש במערכת צילום מיקרוסקופ זקוף רגילה (מהירות סריקה: 4 מיקרון/פיקסל, רזולוציית סריקה: 1024 x 1024).
  8. מיצוי mRNA של הקרנית
    1. אסוף מספריים עיניים, מספריים לקרנית, מלקחיים עם שיניים, מגרד אפיתל חשמלי של הקרנית, טריזול, צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל ללא RNase וקופסת קרח.
    2. רכישת אפיתל
      1. להרדים את החולדה עם 4-5% איזופלורן ולהמית אותה לאחר פריקת צוואר הרחם. הנח את החיה במצב רוחבי. חתוך את שפם העכבר במספריים לעיניים כדי למנוע חסימת הנוף.
      2. הניחו את החולדה מתחת למיקרוסקופ כירורגי והתאימו אותה לגובה מתאים כדי להתמקד בגלגל העין. השתמש במלקחיים עם שיניים כדי לדחוף ולחשוף בעדינות את גלגל העין. הרם את הלחמית של החולדה והשתמש במגרד אפיתל קרנית חשמלי נקי כדי לגרד את השטח המרכזי של 2 מ"מ של אפיתל הקרנית.
      3. אוספים את אפיתל הקרנית המגורד בעזרת מלקחיים נקיים ומשוננים מרוססים באלכוהול. הנח את הרקמה שנאספה לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 1 מ"ל טריזול.
      4. עבדו במהירות האפשרית כדי לשטוף את הרקמה שנאספה בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל מים דו-יוניים. סופגים עודפי מים עם נייר פילטר. יש לרסס עם 75% אלכוהול ולהמשיך לשלב הבא.
      5. הרם שוב את הלחמית של החולדה באמצעות מלקחיים עם שיניים. השתמש במספריים של הקרנית כשהצד הקעור כלפי מעלה כדי לחתוך את הלחמית לאורך הלימבוס, ולהשאיר כ-0.5 מ"מ של לחמית לבנה.
      6. מגרדים את אפיתל הקרנית בטווח של 2 מ"מ בלימבוס הקרנית באמצעות המגרד החשמלי. אסוף את הרקמה כמתואר קודם. אסוף את אפיתל הקרנית המרכזי משלושה גלגלי עיניים ואת האפיתל הלימלי משלושה גלגלי עיניים.
      7. הנח את הרקמות שנאספו בצינורות ריאגנטים נפרדים של 1 מ"ל טריזול למיצוי RNA. בצע את כל הפעולה על קרח כדי לשמור על שלמות ה-RNA. המשך מיד לשלבים הבאים או אחסן את הדגימות במקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
    3. הפשירו את הדגימה על קרח, השתמשו בהומוגנייזר רקמות קולי כדי ליז את התאים. הגדר את עוצמת ההומוגנייזר האולטראסוני ל-25%, זמן ל-2 שניות לכל פרץ, זמן מרווח ל-5 שניות והזמן הכולל ל-2 דקות. תן לזה לעמוד על קרח במשך 10 דקות.
    4. הוסף כלורופורם (1/5 מהנפח הכולל, כ-200 מיקרוליטר) לכל דגימה, ערבב היטב על ידי היפוך למשך 30 שניות, וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    5. משקעי RNA
      1. לאחר הצנטריפוגה, הנוזל בתוך צינור הצנטריפוגה מרובד לשלושה חלקים. השכבה השקופה העליונה היא RNA, השכבה העכורה הלבנה האמצעית היא DNA וחלבונים, והשכבה התחתונה היא טריזול. פיפטה בזהירות כ -500 מיקרוליטר מהשכבה השקופה העליונה לתוך צינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל, נזהר לא לשאוב את המשקעים הלבנים בשכבה האמצעית. אם נשאבים בטעות, חזור על הצנטריפוגה כדי לאסוף שוב את השכבה השקופה.
      2. הוסף כמות שווה של איזופרופנול מקורר מראש לצינור הצנטריפוגה המכיל את השכבה השקופה, כ-500 מיקרוליטר, הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לערבב היטב, ולאחר מכן הכניס אותו מיד למקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד של -80 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. צעד זה נועד להאיץ את משקעי ה-RNA.
    6. הוצא את הדגימה, ומיד צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. כמות קטנה של משקעים לבנים ומתקלפים נראית בתחתית צינור הצנטריפוגה; השליכו את הסופרנטנט.
    7. הוסף 70% אתנול מוכן מראש ומקורר קרח לכל צינור. צנטריפוגה מיד ב-4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה מקוררת ב-400 x גרם למשך כ-10 דקות; חזור על השלבים לעיל פעם אחת כדי לשטוף היטב את המשקעים. בשלב זה, יש לעקר מראש את מכסה המנוע באור UV למשך 15 דקות.
    8. לאחר הסרת צינורות הצנטריפוגה והשלכת הסופרנטנט, צנטריפוגה שוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בכ-250 x גרם למשך 2 דקות. השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לשאוב בזהירות את עודפי האלכוהול מהצד שממול למשקעים, ולייבש בצורה יסודית ככל האפשר. מניחים בקולט אדים מעוקר מראש UV לייבוש, מייבשים את המשקעים באוויר למשך כ-15 דקות.
    9. הכן את התמיסה על ידי הוספת 1 מ"ל של מעכב RNase ל-40 מ"ל של מי דיאתיל פירוקרבונט (DEPC). הוסף כמות מתאימה של תערובת מעכבי מים/RNase של DEPC, כ-20-30 מיקרוליטר, כדי להמיס את הדגימה. אם יש הרבה משקעים, הוסף 30-50 מיקרוליטר.
  9. PCR שעתוק הפוך
    1. ודא שהפריטים הבאים קיימים: מכונת PCR, צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל ללא RNase, צינורות PCR של 0.2 מ"ל, אמבט קרח או קופסת קרח, פיפטה וטיפים ללא RNase.
    2. מדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח. עבור כל דגימה, ודא ש-1 מיקרוגרם של RNA מתווסף למערכת התגובה.
    3. למערכת השעתוק ההפוכה נפח כולל של 20 מיקרוליטר. חשב את הכמות הכוללת של ריאגנטים הדרושים על סמך מספר הדגימות. מערבבים לפי היחס המצוין בהוראות.
    4. הכן את מערכת התגובה על קרח, מערבל אותה וצנטריפוגה קצרה. דגירה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ובטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
    5. השתמש ב-cDNA המתקבל מתהליך השעתוק ההפוך ישירות לניתוח PCR כמותי בזמן אמת או לאחסן במקרר -80 מעלות צלזיוס.
  10. תגובת PCR כמותית בזמן אמת
    1. השתמש בערכת ריאגנטים PCR כמותיתבזמן אמת 17 עם מערכת תגובה של 10 μL. השתמש ברצפי הפריימר המוצגים בטבלה 1.
    2. הוסף את מערכת התגובה שתוארה לעיל לצלחת של 96 בארות או לצינור בעל שמונה רצועות במיוחד עבור RT-PCR. ודא שהדגימות מעורבבות היטב. בדוק אם יש בועות בצינורות לפני הנחתם על מכונת ה-PCR.
    3. הגבירו את הגן באמצעות מחזור ה-PCR (95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות), 40 מחזורים (95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות), והשלימו את הנתונים כדי לחשב את ערך ה-2-ΔΔ Ct. עיבוד, ניתוח ושרטוט הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתאימה.

תוצאות

כפי שמוצג באיור 1A, באמצעות תצפית עם מנורת חריץ, מצאנו שהריפוי של אפיתל הקרנית נפגע. בנסיבות רגילות, אפיתל הקרנית המרכזי היה נרפא לחלוטין תוך 24-48 שעות לאחר ההסרה, אך בכריתת האפיתל המרכזי של הקרנית בשילוב עם מודל תפרים, כלי דם חדשים המשיכו להתקיים. ביום השליש...

Discussion

דלקת ממלאת תפקיד מפתח בהתפתחות מחסור בתאי גזע לימביים18, אך המנגנונים וההשפעות הספציפיים שלה דורשים חקירה נוספת. כדי לטפל בבעיה זו, גרמנו ל-LSCD על ידי גירוד אפיתל הקרנית המרכזי ותפירת הסטרומה המרכזית של הקרנית כדי לגרום לדלקת חמורה בקרנית. צפינו באבולוציה של ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי פרויקטי המדע והטכנולוגיה המחוזיים של גוויג'ואו (QKHJC-ZK [2024]ZD043), קרן המדע המחוזית של פוג'יאן לחוקרים צעירים מצטיינים (2023J06053 [ל-S.O]); הקרן למדעי הטבע של סין (מס' 82101084 [ל-S.O.] ומועצת המלגות של סין (CSC, 202306310049 [ל-Y.W.]).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10-0 suture lineAlcon, Inc., USA8065698001
2 mm corneal trephineSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, 1 mL pipette gun heads, cell culture plate culture plates, centrifuge tubesGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chinahttps://www.jetbiofil.com/index.html
-20/-80 °C fridgeQingdao Haier Company, Chinahttps://www.haier.com/cn/
A 10-mL syringe Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chinahttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Adhere to the slideShiTai Company188105
Amylene alcoholShanghai. Macklin Biochemical, Chinahttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, United Kingdomab76318
Anti-Keratin 12 antibody EPR17882Abcam, United Kingdomab185627
Anti-PAX6 antibodyAbcam, United Kingdomab195045
Anti-stripping slides, cover slipsJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd., Chinahttps://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, Japanhttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Chinahttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
CO2 Oven incubator, ultrasonic crusher, centrifugeThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Confocal microscopeShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chinahttps://www.clinx.cn/about
Corneal epithelial forcepsSuzhou XVI Vision Company, China53418D
DAPIVector. Inc., USAH-1000
DEPC water Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
Dicuro eye cream (ofloxacin eye cream)Santian Pharmaceutical Corporation, Japanhttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, culture medium, double antibody, and PBSThermo Fisher Scientific, Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, United Kingdom MCA341GA
Electronic balanceShanghai Ohaus Biotechnology Company, Chinahttp://shbio.com/company
Enclosure of the membraneParafilm, Inc., USAhttps://www.sigmaaldrich.cn
Fluorescein sodium test strip was used in ophthalmologyTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinahttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Fluorescent inverted phase-contrast micrographic systemTE-2000U, Nikon, Japanhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Frozen table-top centrifugeEppendorf, Germanyhttps://www.eppendorf.sh.cn 
Glass sheet frameXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://www.tagene.net/
H-1200 with DAPI sealagentXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Chinahttps://www.bosonbio.com.cn/
HE staining kitAuragene, Chinahttp://jushengwu.com/a048/
Hematoxylin-eosin dye solution kitAURAGEN, United StatesP032IH
High and low precision electronic balanceSdolis, Germanyhttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinahttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67 antibodyAbcam, United Kingdomab16667
liquid nitrogenXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chinahttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Microhand holderSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Multiformaldehyde powderSigm, Americahttps://www.sigmaaldrich.cn
Normal temperature centrifuge 46Eppendorf, Germanyhttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China4583
Ordinary biological micrographic systemEclipse 50i, Nikon, Japanhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChinaSH30256.01
PCR, and the reactor apparatusBiometra Thermocycler, Germanyhttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipettes of various specificationsEppendorf Company, Germanyhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers for Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaine hydrochloride 0.5% eye dropsAlcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Rat PMN antibodyFitzgerald, United States20R-PR020
Real time fluorescence quantitative PCRApplied Biosystems, United Stateshttps://www.thermofisher.cn
Reverse transcription kitTAKARA, Japanhttps://www.takarabiomed.com.cn/
Slit lampTOPCON, Japanhttps://topconchina.cn/
Smooth forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://chuangdianbio.com/
Superclean benchNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singaporehttps://www.hi-p.com/
Toothed forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Toppicamide eye drops (Medol)Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Trace nucleic acid protein concentration testerThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen The United Stateshttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, with a surgical microscopeCarl ZEIS, Germanyhttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html

References

  1. Ang, L. P., Tan, D. T. Ocular surface stem cells and disease: Current concepts and clinical applications. Ann Acad Med Singap. 33 (5), 576-580 (2004).
  2. Mao, Y., et al. Downregulation of p38 MAPK signaling pathway ameliorates tissue-engineered corneal epithelium. Tissue Eng Part A. 28 (23-24), 977-989 (2022).
  3. Sprogyte, L., Park, M., Di Girolamo, N. Pathogenesis of alkali injury-induced limbal stem cell deficiency: A literature survey of animal models. Cells. 12 (9), 1294 (2023).
  4. He, X., et al. Lacrimal gland microenvironment changes after obstruction of lacrimal gland ducts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (3), 15 (2022).
  5. Le, Q., Chauhan, T., Deng, S. X. Diagnostic criteria for limbal stem cell deficiency before surgical intervention- A systematic literature review and analysis. Surv Ophthalmol. 65 (1), 32-40 (2020).
  6. Li, W., Hayashida, Y., Chen, Y. T., Tseng, S. C. Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus. Cell Res. 17 (1), 26-36 (2007).
  7. Ou, S. K., et al. The role of ectodysplasin a on the ocular surface homeostasis. Int J Mol Sci. 23 (24), 12 (2022).
  8. Lin, S., et al. Limbal stem cell dysfunction induced by severe dry eye via activation of the p38 MAPK signaling pathway. Am J Pathol. 193 (11), 1863-1878 (2023).
  9. Jiang, G. J., Li, B. B., Fan, T. J. Timolol induces necroptosis, apoptosis and senescence concentration-dependently in rabbit limbal stem cells in vitro. Life Sci. 277, 119453 (2021).
  10. Castro-Munozledo, F. Review: Corneal epithelial stem cells, their niche and wound healing. Mol Vis. 19, 1600-1613 (2013).
  11. Atalay, E., et al. Animal models for limbal stem cell deficiency: A critical narrative literature review. Ophthalmol Ther. 13 (3), 671-696 (2024).
  12. Delic, N. C., Cai, J. R., Watson, S. L., Downie, L. E., Di Girolamo, N. Evaluating the clinical translational relevance of animal models for limbal stem cell deficiency: A systematic review. Ocul Surf. 23, 169-183 (2022).
  13. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  14. Ye, J., et al. Biomimetic nanocomplex based corneal neovascularization theranostics. J Control Release. 374, 50-60 (2024).
  15. Zhu, H. M., et al. A synergistic therapy with antioxidant and anti-VEGF: Toward its safe and effective elimination for corneal neovascularization. Adv Healthc Mater. 13 (5), 10 (2024).
  16. Yu, J. W., et al. In vivo assembly drug delivery strategy based on ultra-small nanoparticles: Toward high drug permeation and accumulation for CNV treatment. Chem Eng J. 450, 137968 (2022).
  17. Wu, H., et al. A SU6668 pure nanoparticle-based eyedrops: Toward its high drug accumulation and long-time treatment for corneal neovascularization. J Nanobiotechnol. 22 (1), 290 (2024).
  18. Long, Q., et al. A novel tissue-engineered corneal epithelium based on ultra-thin amniotic membrane and mesenchymal stem cells. Sci Rep. 14 (1), 17407 (2024).
  19. Giroux, V., Rustgi, A. K. Metaplasia: Tissue injury adaptation and a precursor to the dysplasia-cancer sequence. Nat Rev Cancer. 17 (10), 594-604 (2017).
  20. Herfs, M., Hubert, P., Delvenne, P. Epithelial metaplasia: Adult stem cell reprogramming and (pre)neoplastic transformation mediated by inflammation. Trends Mol Med. 15 (6), 245-253 (2009).
  21. Slack, J. M. Metaplasia and transdifferentiation: From pure biology to the clinic. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 369-378 (2007).
  22. Slack, J. M., Tosh, D. Transdifferentiation and metaplasia--switching cell types. Curr Opin Genet Dev. 11 (5), 581-586 (2001).
  23. Wang, S., et al. Impact of chronic smoking on meibomian gland dysfunction. PLoS One. 11 (12), e0168763 (2016).
  24. Wu, Y., et al. Evolution of therapeutic strategy based on oxidant-antioxidant balance for fuchs endothelial corneal dystrophy. Ocul Surf. 34, 247-261 (2024).
  25. Li, Y., et al. Meibomian gland alteration in patients with systemic lupus erythematosus. Lupus. 31 (4), 407-414 (2022).
  26. Zhang, Y., et al. Histopathology-based diagnosis of Mooren's ulcer concealed beneath the pterygium on eye. J Histotechnol. 45 (4), 195-201 (2022).
  27. Tseng, S. C., Hatchell, D., Tierney, N., Huang, A. J., Sun, T. T. Expression of specific keratin markers by rabbit corneal, conjunctival, and esophageal epithelia during vitamin A deficiency. J Cell Biol. 99 (6), 2279-2286 (1984).
  28. Espana, E. M., et al. Characterization of corneal pannus removed from patients with total limbal stem cell deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9), 2961-2966 (2004).
  29. Li, W., et al. Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (1), 154-162 (2008).
  30. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Exp Eye Res. 161, 101-105 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved