JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kornea sütürleri ile birlikte kornea epitel küretajı yoluyla şiddetli kornea iltihabının bir sıçan modeli geliştirdik. Çalışma, enflamatuar koşullar altında kornea iltihabı paternlerini, epitel proliferasyonunu ve limbal kök hücrelerdeki değişiklikleri değerlendirdi.

Özet

Kornea iltihabı, özellikle şiddetli kornea iltihabı, kornea limbal kök hücre disfonksiyonunun gelişiminde önemli bir rol oynar. Uygun hayvan modelleri oluşturmak, şiddetli inflamasyonun kornea limbal kök hücreleri üzerindeki etkilerine odaklanmamıza yardımcı olabilir. Sprague Dawley (SD) sıçanlarının merkezi kornea epitelini çıkarmak için 2 mm'lik bir pas sökücü kullanıldı. Daha sonra, korneanın merkezi stroması, kalıcı inflamasyonu indüklemek için naylon dikişlerle dikildi. Bu şekilde, ciddi kornea iltihabına neden olan merkezi kornea epitel aşınması ve merkezi stroma sütürü ile bir kornea iltihabı modeli oluşturuldu. Modellemeden 1, 3 ve 7 gün sonra kornea iltihabındaki değişiklikler ve limbal kök hücrelerin durumu gözlendi. Modellemeden sonraki 3. günde , sıçanların kornea limbusu, limbal kök hücre eksikliğinin tipik belirtileri olan belirgin neovaskülarizasyon ve lokal hiperplazi ile ciddi şekilde ödemliydi. 7.günde , kornea ödemi giderek kötüleşti ve neovaskülarizasyon artmaya devam etti. Kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ve immünofloresan boyama yoluyla, kornea epitelyal inflamatuar faktörlerinin önemli ölçüde yukarı regüle olduğunu, kornea epitel farklılaşmasının anormal olduğunu, kornea epitel kök hücrelerinin önemli ölçüde azaldığını ve hücre proliferasyonunun ve sapının da azaldığını bulduk. Bu nedenle, bu model, şiddetli inflamasyonun limbal kök hücrelere doğrudan zarar vermeden limbal kök hücre hasarına neden olabileceğini göstermektedir. Model, şiddetli inflamasyonun kök hücrelerin biyolojik mekanizmaları üzerindeki etkilerini gözlemlemek için faydalıdır ve inflamasyonun neden olduğu kornea epitelyal kök hücre disfonksiyonunun mekanizmalarını incelemek için ideal bir platform sağlar.

Giriş

Limbal kök hücre disfonksiyonu (LSCD), kalıcı epitel defektleri, kornea vaskülarizasyonu, kronik inflamasyon, yara izi ve korneanın konjonktivalizasyonu ile karakterizedir 1,2. Kimyasal yanıklar, termal yanıklar, Stevens-Johnson sendromu ve oküler ameliyatların neden olduğu iyatrojenik yaralanma gibi ciddi oküler yüzey hastalıklarından sonra limbal kök hücrelerin tükenmesinden veya işlev bozukluğundan kaynaklanabilir 2,3,4. LSCD'nin patojenik mekanizmaları esas olarak kök hücrelerdeki değişiklikleri ve kornea epitelinin 2,7 homeostazını etkileyen kök hücre mikro ortamındaki 5,6 bozuklukları içerir. LSCD'de limbal kök hücrelerde iki ana kader değişikliği türü vardır: 1) Kornea epitel kök hücrelerinin yönlü farklılaşma potansiyeli anormal hale gelir ve bu da cilt epitel hücrelerine farklılaşmalarına yol açar. Bu, kornea epitel hücresine özgü transkripsiyon faktörü Pax6 ve korneaya özgü keratinler Krt12 ve Krt3'ün ekspresyonunda bir azalma ve ayrıca cilt ile ilişkili skuamöz epitelyal metaplazi belirteçleri Krt10, Krt1 ve Sprr1b8'in ekspresyonunda önemli bir artış ile kanıtlanır; 2) Oküler yüzey yaralanması, kornea limbal kök hücrelerini doğrudan yok ederek nekroz veya apoptoz ile sonuçlanır ve ardından korneayı kaplayan konjonktival doku proliferasyonuna neden olur9. LSCD'nin gelişimi sırasında, makrofajlar, nötrofiller ve dendritik hücreler gibi inflamatuar hücrelerin kornea epitelyal kök hücre mikroçevresinde önemli ölçüde arttığı bildirilmiştir. Buna bağlı olarak, interferon-gama (IFN)-γ, tümör nekroz faktörü (TNF)-α, interlökin (IL)-1β ve makrofaj inflamatuar proteinler (MIP)-1α/β gibi sitokinler de önemli yükselmeler gösterir10.

Sütürler, kimyasal yaralanmalar ve benzalkonyum klorür lekelenmesi11 tarafından indüklenenler de dahil olmak üzere çeşitli LSCD modelleri oluşturulmuştur. Bu modellerin her birinin avantajları ve dezavantajları vardır. Kimyasal yaralanmalar tüm oküler yüzeye zarar verebilir ve limbal kök hücreleri doğrudan yok edebilir12. Benzalkonyum klorür, kimyasal yaralanmalara benzer şekilde işlev görür, ancak nispeten yavaş bir etkiye sahiptir13. Kornea sütür modeli, stabil ve uzun süreli bir inflamatuar yanıtı indükleyebilir, ancak enflamatuar reaksiyon nispeten hafiftir ve LSCD'ye neden olamaz.

Kornea LSCD gelişiminde inflamasyonun rolünü ve mekanizmalarını araştırmak için, merkezi kornea epitelinin küretajını kornea sütürleri ile birleştiren bir hayvan modeli oluşturulmuştur. Bu model, limbal kök hücrelere doğrudan zarar vermeden kornea epitelinin kalıcı iltihaplanmasına neden olur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm prosedürler, hayvanların oftalmik ve görme araştırmalarında kullanılmasına ilişkin ARVO yönergelerine uygundur ve Guizhou Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Onay No. 2305192). Sıçanlar, ilgili hayvan yönetimi yönetmeliklerine bağlı kalarak Guizhou Tıp Üniversitesi Hayvan Merkezi'ne yerleştirildi.

1. Hayvan seçimi

  1. 7-8 haftalık dişi Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını kullanın. Yarık lamba muayenesi altında oküler yüzey lezyonları olmadığından emin olun.
  2. Aletleri hızlı bir sterilizatör kullanarak sterilize edin. Gerekli aletler arasında kornea pas halkası çıkarıcı, 2 mm boyutunda cilt örnekleme kalemi, iğne tutucular, plaka tabakası bıçakları, oftalmik cerrahi makas ve forseps bulunur.
  3. Sıçanları, 100 g vücut ağırlığı başına 0.3 mL'lik bir dozda intraperitoneal enjeksiyon yoluyla% 1.25 tribromoetanol ile anesteziyin. Anestezi derinliğini ayak parmağınızı sıkıştırarak değerlendirin. Göz bebeği genişlemesi için bir damla tropikamid göz damlası damlatın. Göze bupivakain hidroklorür göz damlası uygulayın. Nemi korumak için karşı gözde oküler kayganlaştırıcı merhem kullanın.
  4. Göz çevresindeki cildi ve saçları iyodofor ile dezenfekte edin.
  5. Enflamasyon modelini oluşturun.
    1. Fareyi lateral dekübit pozisyonuna getirin. Göz küresini ameliyat mikroskobu altında açığa çıkarın.
    2. Santral kornea, 2 mm boyutunda bir cilt örnekleme markörü kullanılarak etiketlendi ve etiketli merkezi kornea epiteli, bir Kornea pas halkası çıkarıcı kullanılarak kazındı.
    3. Limbustan yaklaşık 3 mm uzağa 10-0 naylon tel, iğne tutucu ve oftalmik cerrahi makas ve forseps kullanarak üç adet 120° kornea sütürü yerleştirin, korneaya nüfuz etmeyin14,15.
  6. Enfeksiyonu önlemek için işlemin sonunda Ofloksasin göz merhemi uygulayın.
  7. Ameliyattan sonraki 1., 3. ve 7. günlerde yarık lamba ile büyütülmüş 10x lens kullanarak korneayı gözlemleyin ve fotoğraflayın. Kornea epitel iyileşmesi, konjonktival hiperemi, kornea ödemi, limbal hiperemi ve kornea neovaskülarizasyonu gibi semptomları kaydedin.

2. Enflamatuar indeksin hesaplanması

  1. Hayvan modelini oluşturduktan sonra oküler yüzeyin enflamatuar indeksini hesaplayın.
    1. Siliyer cisim tıkanıklığını aşağıdaki gibi puanlayın: tıkanıklık yok (0 puan); 1 mm'den (1 puan) daha az tıkanıklık varlığı; 1 mm ile 2 mm arasında hiperemi (2 puan); 1 mm ile 2 mm arasında hiperemi (3 puan).
    2. Merkezi kornea ödemini aşağıdaki gibi puanlayın: ödem yok (0 puan); net iris görünürlüğü ile ödem (1 puan); belirsiz iris görünürlüğü olan ödem (2 puan); iris görünmezken ödem (3 puan).
    3. Parasantral kornea ödemini aşağıdaki gibi puanlayın: ödem yok (0 puan); net iris görünürlüğü ile ödem (1 puan); belirsiz iris görünürlüğü olan ödem (2 puan); iris görünmezken ödem (3 puan).
    4. Tüm puanları toplayıp 9'a bölerek inflamasyon indeksini hesaplayın.

3. Kornea neovaskülarizasyonunun değerlendirilmesi

  1. Bir yarık lamba ile kornea neovaskülarizasyonunu gözlemleyin.
    1. Yarık lamba görüntü işleme yazılımı16 kullanarak görüntüleri analiz edin ve işleyin.
    2. Her gözlem zaman noktasında kornea neovaskülarizasyonunun büyümesini kaydedin ve minimum eğrilik ile merkezi korneaya doğru en uzun kornea neovaskülarizasyonunu ölçün.
    3. Bunları aşağıdaki gibi derecelendirin: Sınıf 0: Avasküler; Derece 1: Mikro (<1 mm); 2. Derece: Hafif (1 mm ila 1,5 mm); 3. Derece: Orta (>1,5 mm ila 2 mm); Derece 4: Şiddetli (>2 mm).

4. Modelin biyolojisini analiz etmek

  1. Dondurulmuş göz örnekleri hazırlayın.
    1. Sıçatanı% 4-5 izofluran ile uyuşturun ve servikal çıkık ile ötenazi yapın.
    2. Lateral dekübit pozisyonunda, sıçan göz küresini mikro cımbızla dışarı doğru kaldırın ve konjonktivayı göz makası ile üst ve alt göz kubbesi boyunca kesin.
    3. Kornea epitelinin bütünlüğünün korunmasına dikkat ederek optik siniri kesin.
    4. Göz küresi yüzeyindeki kan lekelerini ve suyu filtre kağıdı ile kurutun ve bunları optimum kesme sıcaklığı (OCT) gömme ortamına sahip gömme kutusuna koyun.
    5. Gömme kutusundaki baloncukları 200 μL'lik bir pipetle çıkarın, sıvı nitrojen kullanarak dondurun ve ardından gömülü numuneleri ultra düşük sıcaklıktaki buzdolabında saklayın.
  2. Göz kürelerinin donmuş kısımlarını hazırlayın.
    1. Donmuş bölümü hazırlamadan önce, kriyostatı yaklaşık -28 °C'ye ve numune tutucuyu -26 °C'ye kadar önceden soğutun.
    2. Dondurulmuş örnekleri soğuk dondurucudan çıkarın ve yaklaşık 1 saat kriyotomda bekletin.
    3. Dondurulmuş numuneyi bir kriyotomda 10 dakika önceden soğutun. Numuneyi bir kalemle işaretleyin, OCT ile numune pedine sabitleyin ve soğuduktan sonra bunları kesit rafına sabitleyin.
    4. Donmuş numunenin konumunu ve yönünü ayarlayın ve sabitleyin. İlk olarak, merkezi kornea görülene kadar 20 μm'lik bölümler kesin. Daha sonra sürekli dilimleme ile 6 μm'lik kesitler elde edin ve kesitleri önceden hazırlanmış yapıştırma slaytları üzerinde toplayın.
    5. Slayttaki dokunun adını, malzemesini, kesit süresini, adını ve numarasını işaretleyin. Yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında (RT) bekletin.
    6. Bölümleri kuruttuktan sonra bir kutuya koyun ve rezerv için ultra düşük sıcaklıktaki buzdolabında saklayın.
  3. Hematoksilen ve eozin boyama yapın.
    1. Önceden hazırlanmış donmuş bölümleri ultra düşük sıcaklıktaki buzdolabından çıkarın ve kuruması için RT'deki çeker ocak içine yerleştirin.
    2. RT'de 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit kullanarak bölümleri sabitleyin. Örnekleri 1x PBS ile 5 dakika durulayın.
    3. Slaytlar içeren numune bölümlerini bir slayt tutucuya yerleştirin ve bunları RT'de 5 dakika boyunca hematoksilen boya çözeltisi ile boya silindirine daldırın.
    4. Yüzen boyayı yıkamak için slaytlar içeren numuneyi musluk suyuyla yavaşça durulayın, bunları %0.1 hidroklorik asit alkol ile boya tankına koyun ve 1-2 saniye sonra hızlı bir şekilde çıkarın.
    5. Numuneyi 15 dakika boyunca musluk suyuyla yavaşça durulayın.
    6. Numuneyi sudan çıkarın ve slaytları eozin boya tankına daldırın; RT'de 3 dakika bekletin.
    7. Numuneyi musluk suyuyla yavaşça durulayın, fazla boyayı yıkayın ve %75 alkol, %80 alkol, %95 alkol, %100 alkol (bir) ve %100 alkol (iki) kullanarak gradyan alkol dehidrasyonu gerçekleştirin. Her konsantrasyondaki bölümleri 2 dakika boyunca immsere edin.
    8. Numuneleri sırasıyla ksilen (1) ve ksilen (2) içinde 2 dakika boyunca şeffaf hale getirin.
    9. Numuneyi çeker ocakta kurutun, bölümleri bir sızdırmazlık maddesi kullanarak kapatın ve kabarcık oluşturmamaya dikkat edin.
    10. Slaytları RT'deki bir slayt kutusuna yerleştirin. Mikroskop kullanarak bölümleri görüntüleyin.
  4. İmmünofloresan boyama yapın.
    1. Donmuş bölümleri çıkarın ve kuruması için çeker ocaktaki RT'de bir kutuya koyun.
    2. Donmuş numunenin boş cam slaytında lekelenecek antikorun adını işaretleyin.
    3. Numuneleri RT'de %4 paraformaldehit ile 15 dakika sabitleyin. Numunenin kurumasını önlemek için kutuya az miktarda musluk suyu eklendi.
    4. Paraformaldehit fiksatifini çıkarın ve numuneyi 1x PBS tamponu ile üç kez yıkayın. Numuneyi yıkamamaya dikkat edin.
    5. Doku bölümünün etrafındaki sıvıyı kurutun, numuneyi hücre zarı çözeltisi (% 0.2 TritonX-100) ile kaplayın ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
    6. Hücre zarı çözeltisini çıkarın ve bölümleri her biri 1x PBS tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    7. Doku bölümlerini kurutun, numuneyi immünofloresan bloke edici solüsyon (% 2 BSA) ile örtün ve RT'de 1 saat inkübe edin.
    8. Üreticinin talimatlarına göre inkübasyon sırasında birincil antikoru ve seyrelticiyi (% 1 BSA) hazırlayın.
    9. Blokaj sıvısını çıkarın ve numuneyi bir emme pompası ile kurutun. Hazırlanan primer antikoru ekleyin, kutuyu kapatın ve gece boyunca 4 ° C'lik bir buzdolabında inkübe edin (yaklaşık 12-16 saat inkübe edin) ışıktan uzakta.
    10. Birincil antikoru atın ve numuneyi PBS'de her biri 10 dakika boyunca dört kez yıkayın.
    11. Temizleme adımı sırasında, ikincil antikor seyreltmesini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
    12. PBS'yi çıkarın, numuneyi kurutun ve hazırlanan ikincil antikoru numuneye ekleyin. Numuneyi örtün ve RT'de ışıktan 1 saat uzakta inkübe edin.
    13. İkincil antikoru çıkarın, numuneyi her biri 10 dakika boyunca 1x PBS tamponu ile 4 kez yıkayın ve tüm slaydı 1x PBS tamponu ile kaplayın.
    14. PBS'yi çıkarın, numuneyi kurutun ve hava kabarcığı olmadığından emin olarak bölümleri DAPI içeren bir montaj ortamıyla kapatın. Slaytları kalay folyoya sarın ve ışıktan 4 °C'de tutun.
    15. Lazer konfokal mikroskop sistemi veya dik floresan mikroskop kamera sistemi ile fotoğraf çekin (tarama hızı: 4 μs/piksel, tarama çözünürlüğü: 1024 x 1024).
  5. Sıçan kornea epitelinin tek hücreli süspansiyon hazırlığı
    1. Ötenaziden sonra,% 75 alkole batırılmış cımbızla gözbebeklerini çıkarın ve önceden hazırlanmış% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 penisilin-streptomisin içeren 1x Hanks'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS) koyun.
    2. Göz kürelerini temizleyin ve% 10 FBS ve% 10 penisilin-streptomisin içeren 1x HBBS'yi her biri 5 dakika boyunca iki kez kullanın.
    3. Konjonktivayı skleral kenar boyunca çıkarın; skleral marjı yaklaşık 1 mm'de bırakın. Yine kornea dokusunu %10 FBS ve %10 penisilin-streptomisin içeren 1x HBBS ile iki kez yıkayınız.
    4. Temiz kornea dokusunu 2U / mL Dispas II içeren takviye edilmiş bir hormonal epidermal ortama (SHEM) aktarın. Contayı kapatın ve 4-14 saat boyunca 16°C'ye yerleştirin.
    5. Bir cımbız, dişsiz cımbız, iris kurtarma cihazı ve cerrahi sterilizatör bulundurun.
    6. Cerrahi mikroskop altında, kornea epitelini korneanın kenarı boyunca nazikçe ayırın.
    7. Kornea epitelini %10 penisilin-streptomisin içeren 1x HBSS ile 5 dakika boyunca yıkayın.
    8. Kornea epitel dokusunu 200 mL tripsin içeren 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve% 5 CO2, 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin. Her 5 dakikada bir, kornea epitel tabakasını tek hücreli bir süspansiyona sindirmek için santrifüj tüpünü üç kez sallayın.
    9. Tripsin sindirim çözeltisinin etkisini durdurmak için eşit miktarda SHEM ortamı ekleyin ve RT'ye yerleştirin.
  6. Kornea epitel hücrelerinin klon kültürü
    1. Trofoblast hücrelerini hazırlayın.
      1. NIH 3T3 fare hücrelerinin büyüme yoğunluğu %80-90'a ulaştığında, hücre kültürü ortamını atın. Önceden hazırlanmış 10 mg / mL NIH 3T3 mitomisin kültür ortamını ekleyin ve 37 ° C'de 2,5 saat inkübe edin.
      2. Ortamı çıkarın, hücreleri 1x HBSS ile durulayın, yeni NIH 3T3 hücre ortamı ile değiştirin ve bir CO2 inkübatöründe (% 5 CO2, 37 ° C) inkübasyona devam edin.
    2. Kornea epitel hücresi süspansiyonunu hazırlayın ve hücreleri gerekli orana göre sayın.
    3. Kornea epitel hücresi süspansiyonunu hazırlarken, mitomisin ile muamele edilmiş NIH 3T3 hücrelerini işleyin.
      1. Süpernatanı atın, hücreleri 1x HBSS ile durulayın, 1 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve RT'de 2-3 dakika inkübe edin.
      2. Eşit miktarda ek hormonal epitel ortamı ekleyin (SHEM ortamı: DMEM / F12, 10 ng / mL fare epidermal büyüme faktörü [EGF], 10 μg / mL İnsülin-Transferrin-Selenyum [ITS,% 5 FBS,% 1 penisilin-streptomisin,% 0.5 dimetil sülfoksit [DMSO], 0.5 mg / mL hidrokortizon), bir hücre süspansiyonu yapmak için hafifçe pipetleyin ve hücreleri sayın.
    4. 12 oyuklu bir plaka kullanın ve her oyuğa 0,5 mL SHEM ortamı ekleyin.
    5. Kornea epitel hücrelerini 500 kornea epitel hücresi/cm2 ve 5 x 105 NIH 3T3 hücre/cm2 yoğunluğunda NIH 3T3 hücreleri ile NIH 3T3 hücreleri ile karıştırın. Her kuyucuğa 1 mL SHEM ortamı ekleyin.
    6. Her bir oyuğa 1 mL hücre karışımı ekleyin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için hafifçe pipetleyin.
    7. Bir inkübatörde (% 5 CO2, 37 ° C) inkübe edin, ortamı her 2-3 günde bir değiştirin. 12-14 gün boyunca kültür.
  7. Kristal menekşe boyama
    1. Yaklaşık 12 gün sonra, kornea epitel klonları kaynaşmak üzereyken, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri tamamen kaplayacak şekilde her oyuğa 1 mL% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin. Hücreleri RT'de 15 dakika sabitleyin.
    2. % 4 paraformaldehiti çıkarın ve kuyuları her biri 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    3. 1x PBS tamponunu çıkarın ve her oyuğa% 0.4 kristal viyole boya çözeltisi ekleyin. RT'de 30 dakika boyayın.
    4. Kristal viyole boya solüsyonunu çıkarın veya geri dönüştürün ve her biri 10 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    5. Kuyuları tamamen kuruyana kadar RT'de havayla kurutun.
    6. Normal bir dik mikroskop fotoğraf sistemi kullanın (tarama hızı: 4 μs/piksel, tarama çözünürlüğü: 1024 x 1024).
  8. Kornea mRNA'sının ekstraksiyonu
    1. Oftalmik makas, kornea makası, dişli forseps, elektrikli kornea epitel kazıyıcı, Trizol, RNaz içermeyen 1.5 mL santrifüj tüpleri ve bir buz kutusu toplayın.
    2. Epitel edinimi
      1. Sıçatanı% 4-5 izofluran ile uyuşturun ve servikal çıkıktan sonra ötenazi yapın. Hayvanı yanal pozisyonda yerleştirin. Görünümü engellememek için farenin bıyıklarını göz makasıyla kesin.
      2. Fareyi cerrahi mikroskop altına yerleştirin ve göz küresine odaklanmak için uygun bir yüksekliğe ayarlayın. Göz küresini nazikçe itmek ve ortaya çıkarmak için dişli forseps kullanın. Sıçanın konjonktivasını kaldırın ve kornea epitelinin merkezi 2 mm'lik alanını kazımak için temiz bir elektrikli kornea epitel kazıyıcı kullanın.
      3. Kazınmış kornea epitelini alkol püskürtülmüş temiz, dişli forseps ile toplayın. Toplanan dokuyu 1 mL Trizol içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
      4. Toplanan dokuyu çift deiyonize su içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde durulamak için mümkün olduğunca çabuk çalışın. Fazla suyu filtre kağıdı ile emdirin. % 75 alkol püskürtün ve bir sonraki adıma geçin.
      5. Dişli forseps kullanarak sıçanın konjonktivasını tekrar kaldırın. Konjonktivayı limbus boyunca kesmek için içbükey tarafı yukarı bakacak şekilde kornea makası kullanın ve yaklaşık 0,5 mm beyaz konjonktiva bırakın.
      6. Elektrikli kazıyıcı kullanarak kornea epitelini kornea limpusunda 2 mm'lik bir aralıkta kazıyın. Dokuyu daha önce anlatıldığı gibi toplayın. Merkezi kornea epitelini üç göz küresinden ve limbal epiteli üç göz küresinden toplayın.
      7. Toplanan dokuları ayrı 1 mL Trizol RNA ekstraksiyon reaktif tüplerine yerleştirin. RNA bütünlüğünü korumak için tüm işlemi buz üzerinde gerçekleştirin. Sonraki adımlara hemen geçin veya numuneleri daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de ultra düşük sıcaklıktaki bir dondurucuda saklayın.
    3. Numuneyi buz üzerinde çözdürün, hücreleri parçalamak için ultrasonik bir doku homojenizatörü kullanın. Ultrasonik homojenizatörün gücünü% 25'e, patlama başına 2 s'ye, aralık süresini 5 s'ye ve toplam süreyi 2 dakikaya ayarlayın. 10 dakika buz üzerinde bekletin.
    4. Her numuneye kloroform (toplam hacmin 1/5'i, yaklaşık 200 μL) ekleyin, 30 saniye ters çevirerek iyice karıştırın ve 400 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    5. RNA çökelmesi
      1. Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüpünün içindeki sıvı üç parçaya bölünür. En üstteki şeffaf tabaka RNA, ortadaki beyaz bulutlu tabaka DNA ve proteinler ve alt tabaka Trizol'dür. Üst şeffaf tabakanın yaklaşık 500 μL'sini yeni bir 1,5 mL'lik santrifüj tüpüne dikkatlice pipetleyin, orta tabakadaki beyaz çökeltiyi aspire etmemeye dikkat edin. Yanlışlıkla aspire edilirse, şeffaf tabakayı tekrar toplamak için santrifüjlemeyi tekrarlayın.
      2. Yaklaşık 500 μL'lik şeffaf tabakayı içeren santrifüj tüpüne eşit miktarda önceden soğutulmuş izopropanol ekleyin, iyice karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin, ardından hemen 20-30 dakika boyunca -80 °C ultra düşük sıcaklıklı bir dondurucuya koyun. Bu adım, RNA'nın çökelmesini hızlandırmayı amaçlar.
    6. Numuneyi çıkarın ve hemen 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Santrifüj tüpünün dibinde az miktarda beyaz, pul pul çökelti görülür; Süpernatanı atın.
    7. Her tüpe önceden hazırlanmış ve buzla soğutulmuş% 70 etanol ekleyin. Hemen 4 °C'de 400 x g'da soğutmalı bir santrifüjde yaklaşık 10 dakika santrifüjleyin; Çökeltiyi iyice yıkamak için yukarıdaki adımları bir kez tekrarlayın. Bu adımda, çeker ocak UV ışığı ile 15 dakika önceden sterilize edin.
    8. Santrifüj tüplerini çıkardıktan ve süpernatanı attıktan sonra, 4 ° C'de yaklaşık 250 x g'da 2 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak fazla alkolü çökeltinin karşı tarafından dikkatlice aspire edin ve mümkün olduğunca iyice kurulayın. Kuruması için UV ile sterilize edilmiş bir çeker ocak içine yerleştirin, çökeltiyi yaklaşık 15 dakika havayla kurutun.
    9. 40 mL Dietil pirokarbonat (DEPC) suya 1 mL RNaz inhibitörü ekleyerek çözeltiyi hazırlayın. Numuneyi çözmek için yaklaşık 20-30 μL olan uygun miktarda DEPC su/RNaz inhibitörü karışımı ekleyin. Çok fazla çökelti varsa, 30-50 μL ekleyin. Hemen ters transkripsiyon PCR ile devam edin.
  9. Ters transkripsiyon PCR
    1. Şu öğelerin mevcut olduğundan emin olun: PCR makinesi, RNaz içermeyen 1,5 mL santrifüj tüpleri, 0,2 mL PCR tüpleri, buz banyosu veya buz kutusu, pipet ve RNaz içermeyen uçlar.
    2. Mikrohacim spektrofotometresini kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün. Her numune için reaksiyon sistemine 1 μg RNA eklendiğinden emin olun.
    3. Ters transkripsiyon sisteminin toplam hacmi 20 μL'dir. Numune sayısına göre ihtiyaç duyulan toplam reaktif miktarını hesaplayın. Talimatlarda belirtilen orana göre karıştırın.
    4. Reaksiyon sistemini buz üzerinde hazırlayın, girdaplayın ve kısaca santrifüjleyin. 42 °C'de 15 dakika ve 90 °C'de 30 saniye inkübe edin.
    5. Ters transkripsiyon işleminden elde edilen cDNA'yı doğrudan gerçek zamanlı kantitatif PCR analizi için kullanın veya -80 °C'lik bir buzdolabında saklayın.
  10. Gerçek zamanlı kantitatif PCR reaksiyonu
    1. 17 μL reaksiyon sistemine sahip gerçek zamanlı kantitatif bir PCR reaktif kiti10 kullanın. Tablo 1'de gösterilen astar dizilerini kullanın.
    2. Yukarıda açıklanan reaksiyon sistemini, özellikle RT-PCR için 96 oyuklu bir plakaya veya sekiz şeritli bir tüpe ekleyin. Numunelerin iyi karıştırıldığından emin olun. PCR makinesine yerleştirmeden önce tüplerde kabarcık olup olmadığını kontrol edin.
    3. PCR döngüsü (5 dakika boyunca 95 ° C), 40 döngü (10 saniye boyunca 95 ° C, 30 saniye için 60 ° C) kullanarak geni amplifiye edin ve 2-ΔΔ Ct değerini hesaplamak için verileri tamamlayın. Uygun veri analizi yazılımını kullanarak verileri işleyin, analiz edin ve çizin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1A'da görüldüğü gibi, yarık lamba ile yapılan gözlem sonucunda kornea epitelinin iyileşmesinin bozulduğunu bulduk. Normal şartlar altında, merkezi kornea epiteli çıkarıldıktan sonra 24-48 saat içinde tamamen iyileşirdi, ancak kornea merkezi epitel eksizyonu bir sütür modeli ile birleştirildiğinde yeni kan damarları var olmaya devam etti. Model kurulduktan sonraki üçüncü günde, önemli kornea limbal ödemi ve neovaskülariza...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Enflamasyon, limbal kök hücre eksikliğinin18 gelişiminde önemli bir rol oynar, ancak spesifik mekanizmaları ve etkileri daha fazla araştırma gerektirir. Bu sorunu çözmek için, merkezi kornea epitelini kazıyarak ve merkezi kornea stromasını ciddi kornea iltihabına neden olacak şekilde dikerek LSCD'yi indükledik. Modelleme sonrası 1, 3 ve 7. günlerde kornea iltihabının evrimini ve limbal kök hücrelerin durumunu gözlemledik. Modelleme sonrası...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Guizhou İl Bilim ve Teknoloji Projeleri (QKHJC-ZK[2024]ZD043), Fujian Eyaleti Seçkin Genç Akademisyenler Bilim Fonu (2023J06053 [SO]); Çin Doğa Bilimleri Vakfı (No.82101084 [S.O.'ya] ve Çin Burs Konseyi (CSC, 202306310049 [YW'ye]).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10-0 suture lineAlcon, Inc., USA8065698001
2 mm corneal trephineSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, 1 mL pipette gun heads, cell culture plate culture plates, centrifuge tubesGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chinahttps://www.jetbiofil.com/index.html
-20/-80 °C fridgeQingdao Haier Company, Chinahttps://www.haier.com/cn/
A 10-mL syringe Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chinahttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Adhere to the slideShiTai Company188105
Amylene alcoholShanghai. Macklin Biochemical, Chinahttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, United Kingdomab76318
Anti-Keratin 12 antibody EPR17882Abcam, United Kingdomab185627
Anti-PAX6 antibodyAbcam, United Kingdomab195045
Anti-stripping slides, cover slipsJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd., Chinahttps://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, Japanhttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Chinahttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
CO2 Oven incubator, ultrasonic crusher, centrifugeThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Confocal microscopeShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chinahttps://www.clinx.cn/about
Corneal epithelial forcepsSuzhou XVI Vision Company, China53418D
DAPIVector. Inc., USAH-1000
DEPC water Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
Dicuro eye cream (ofloxacin eye cream)Santian Pharmaceutical Corporation, Japanhttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, culture medium, double antibody, and PBSThermo Fisher Scientific, Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, United Kingdom MCA341GA
Electronic balanceShanghai Ohaus Biotechnology Company, Chinahttp://shbio.com/company
Enclosure of the membraneParafilm, Inc., USAhttps://www.sigmaaldrich.cn
Fluorescein sodium test strip was used in ophthalmologyTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinahttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Fluorescent inverted phase-contrast micrographic systemTE-2000U, Nikon, Japanhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Frozen table-top centrifugeEppendorf, Germanyhttps://www.eppendorf.sh.cn 
Glass sheet frameXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://www.tagene.net/
H-1200 with DAPI sealagentXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Chinahttps://www.bosonbio.com.cn/
HE staining kitAuragene, Chinahttp://jushengwu.com/a048/
Hematoxylin-eosin dye solution kitAURAGEN, United StatesP032IH
High and low precision electronic balanceSdolis, Germanyhttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinahttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67 antibodyAbcam, United Kingdomab16667
liquid nitrogenXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chinahttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Microhand holderSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Multiformaldehyde powderSigm, Americahttps://www.sigmaaldrich.cn
Normal temperature centrifuge 46Eppendorf, Germanyhttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China4583
Ordinary biological micrographic systemEclipse 50i, Nikon, Japanhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChinaSH30256.01
PCR, and the reactor apparatusBiometra Thermocycler, Germanyhttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipettes of various specificationsEppendorf Company, Germanyhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers for Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaine hydrochloride 0.5% eye dropsAlcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Rat PMN antibodyFitzgerald, United States20R-PR020
Real time fluorescence quantitative PCRApplied Biosystems, United Stateshttps://www.thermofisher.cn
Reverse transcription kitTAKARA, Japanhttps://www.takarabiomed.com.cn/
Slit lampTOPCON, Japanhttps://topconchina.cn/
Smooth forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://chuangdianbio.com/
Superclean benchNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singaporehttps://www.hi-p.com/
Toothed forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Toppicamide eye drops (Medol)Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Trace nucleic acid protein concentration testerThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen The United Stateshttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, with a surgical microscopeCarl ZEIS, Germanyhttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html

Referanslar

  1. Ang, L. P., Tan, D. T. Ocular surface stem cells and disease: Current concepts and clinical applications. Ann Acad Med Singap. 33 (5), 576-580 (2004).
  2. Mao, Y., et al. Downregulation of p38 MAPK signaling pathway ameliorates tissue-engineered corneal epithelium. Tissue Eng Part A. 28 (23-24), 977-989 (2022).
  3. Sprogyte, L., Park, M., Di Girolamo, N. Pathogenesis of alkali injury-induced limbal stem cell deficiency: A literature survey of animal models. Cells. 12 (9), 1294(2023).
  4. He, X., et al. Lacrimal gland microenvironment changes after obstruction of lacrimal gland ducts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (3), 15(2022).
  5. Le, Q., Chauhan, T., Deng, S. X. Diagnostic criteria for limbal stem cell deficiency before surgical intervention- A systematic literature review and analysis. Surv Ophthalmol. 65 (1), 32-40 (2020).
  6. Li, W., Hayashida, Y., Chen, Y. T., Tseng, S. C. Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus. Cell Res. 17 (1), 26-36 (2007).
  7. Ou, S. K., et al. The role of ectodysplasin a on the ocular surface homeostasis. Int J Mol Sci. 23 (24), 12(2022).
  8. Lin, S., et al. Limbal stem cell dysfunction induced by severe dry eye via activation of the p38 MAPK signaling pathway. Am J Pathol. 193 (11), 1863-1878 (2023).
  9. Jiang, G. J., Li, B. B., Fan, T. J. Timolol induces necroptosis, apoptosis and senescence concentration-dependently in rabbit limbal stem cells in vitro. Life Sci. 277, 119453(2021).
  10. Castro-Munozledo, F. Review: Corneal epithelial stem cells, their niche and wound healing. Mol Vis. 19, 1600-1613 (2013).
  11. Atalay, E., et al. Animal models for limbal stem cell deficiency: A critical narrative literature review. Ophthalmol Ther. 13 (3), 671-696 (2024).
  12. Delic, N. C., Cai, J. R., Watson, S. L., Downie, L. E., Di Girolamo, N. Evaluating the clinical translational relevance of animal models for limbal stem cell deficiency: A systematic review. Ocul Surf. 23, 169-183 (2022).
  13. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  14. Ye, J., et al. Biomimetic nanocomplex based corneal neovascularization theranostics. J Control Release. 374, 50-60 (2024).
  15. Zhu, H. M., et al. A synergistic therapy with antioxidant and anti-VEGF: Toward its safe and effective elimination for corneal neovascularization. Adv Healthc Mater. 13 (5), 10(2024).
  16. Yu, J. W., et al. In vivo assembly drug delivery strategy based on ultra-small nanoparticles: Toward high drug permeation and accumulation for CNV treatment. Chem Eng J. 450, 137968(2022).
  17. Wu, H., et al. A SU6668 pure nanoparticle-based eyedrops: Toward its high drug accumulation and long-time treatment for corneal neovascularization. J Nanobiotechnol. 22 (1), 290(2024).
  18. Long, Q., et al. A novel tissue-engineered corneal epithelium based on ultra-thin amniotic membrane and mesenchymal stem cells. Sci Rep. 14 (1), 17407(2024).
  19. Giroux, V., Rustgi, A. K. Metaplasia: Tissue injury adaptation and a precursor to the dysplasia-cancer sequence. Nat Rev Cancer. 17 (10), 594-604 (2017).
  20. Herfs, M., Hubert, P., Delvenne, P. Epithelial metaplasia: Adult stem cell reprogramming and (pre)neoplastic transformation mediated by inflammation. Trends Mol Med. 15 (6), 245-253 (2009).
  21. Slack, J. M. Metaplasia and transdifferentiation: From pure biology to the clinic. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 369-378 (2007).
  22. Slack, J. M., Tosh, D. Transdifferentiation and metaplasia--switching cell types. Curr Opin Genet Dev. 11 (5), 581-586 (2001).
  23. Wang, S., et al. Impact of chronic smoking on meibomian gland dysfunction. PLoS One. 11 (12), e0168763(2016).
  24. Wu, Y., et al. Evolution of therapeutic strategy based on oxidant-antioxidant balance for fuchs endothelial corneal dystrophy. Ocul Surf. 34, 247-261 (2024).
  25. Li, Y., et al. Meibomian gland alteration in patients with systemic lupus erythematosus. Lupus. 31 (4), 407-414 (2022).
  26. Zhang, Y., et al. Histopathology-based diagnosis of Mooren's ulcer concealed beneath the pterygium on eye. J Histotechnol. 45 (4), 195-201 (2022).
  27. Tseng, S. C., Hatchell, D., Tierney, N., Huang, A. J., Sun, T. T. Expression of specific keratin markers by rabbit corneal, conjunctival, and esophageal epithelia during vitamin A deficiency. J Cell Biol. 99 (6), 2279-2286 (1984).
  28. Espana, E. M., et al. Characterization of corneal pannus removed from patients with total limbal stem cell deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9), 2961-2966 (2004).
  29. Li, W., et al. Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (1), 154-162 (2008).
  30. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Exp Eye Res. 161, 101-105 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 213Hayvan ModeliSprague Dawley S anlarKornea Epitel K retajKornea S t rleriNeovask larizasyonLimbal K k H cre Eksikli iKantitatif Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonumm nofloresan Boyamanflamatuar Fakt rlerH cre ProliferasyonuSapl l kKornea demi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır