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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir haben ein Rattenmodell für schwere Hornhautentzündungen durch Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten entwickelt. Die Studie untersuchte Entzündungsmuster der Hornhaut, die epitheliale Proliferation und Veränderungen der limbalen Stammzellen unter entzündlichen Bedingungen.

Zusammenfassung

Eine Hornhautentzündung, insbesondere eine schwere Hornhautentzündung, spielt eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung einer Dysfunktion der limbalen Stammzellen der Hornhaut. Die Konstruktion geeigneter Tiermodelle kann uns helfen, uns auf die Auswirkungen schwerer Entzündungen auf limbale Stammzellen der Hornhaut zu konzentrieren. Ein 2 mm Rostlöser wurde verwendet, um das zentrale Hornhautepithel von Sprague Dawley (SD) Ratten zu entfernen, um eine Verletzung zu verursachen. Dann wurde das zentrale Stroma der Hornhaut mit Nylonnähten vernäht, um eine anhaltende Entzündung auszulösen. Auf diese Weise wurde ein Hornhautentzündungsmodell mit zentraler Hornhautepithelabrasion und zentraler Stromanaht konstruiert, das eine schwere Hornhautentzündung induzierte. Es wurden Veränderungen der Hornhautentzündung und des Zustands der limbalen Stammzellen 1, 3 und 7 Tage nach der Modellierung beobachtet. Am 3. Tag nach der Modellierung war der Hornhautlimbus der Ratten stark ödematös, mit offensichtlicher Neovaskularisation und lokaler Hyperplasie, die typische Anzeichen eines limbalen Stammzellmangels sind. Bis zum 7. Tag verschlimmerte sich das Hornhautödem allmählich und die Neovaskularisation nahm weiter zu. Durch quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) und Immunfluoreszenzfärbung fanden wir, dass die Entzündungsfaktoren des Hornhautepithels signifikant hochreguliert waren, die Differenzierung des Hornhautepithels abnormal war, die Stammzellen des Hornhautepithels signifikant reduziert waren und die Zellproliferation und Stammzellen ebenfalls abgenommen hatten. Daher zeigt dieses Modell, dass eine schwere Entzündung eine Schädigung der limbalen Stammzellen induzieren kann, ohne die limbalen Stammzellen direkt zu schädigen. Das Modell ist nützlich für die Beobachtung der Auswirkungen schwerer Entzündungen auf die biologischen Mechanismen von Stammzellen und bietet eine ideale Plattform, um die Mechanismen der durch Entzündungen induzierten Dysfunktion von Hornhautepithelstammzellen zu untersuchen.

Einleitung

Die limbale Stammzelldysfunktion (LSCD) ist gekennzeichnet durch persistierende Epitheldefekte, Hornhautvaskularisation, chronische Entzündungen, Narbenbildung und Bindehautverengung der Hornhaut 1,2. Sie kann durch die Erschöpfung oder Funktionsstörung limbaler Stammzellen nach schweren Erkrankungen der Augenoberfläche wie Verätzungen, thermischen Verbrennungen, Stevens-Johnson-Syndrom und iatrogenen Verletzungen, die durch Augenoperationen verursacht werden, entstehen 2,3,4. Die pathogenen Mechanismen der LSCD beinhalten hauptsächlich Veränderungen in den Stammzellen und Störungen in der Mikroumgebung der Stammzellen 5,6, die die Homöostase des Hornhautepithels beeinflussen 2,7. Es gibt zwei Haupttypen von Schicksalsänderungen in limbalen Stammzellen bei LSCD: 1) Das gerichtete Differenzierungspotenzial von Hornhautepithelstammzellen wird abnormal, was zu ihrer Differenzierung in Hautepithelzellen führt. Dies zeigt sich in einer Abnahme der Expression des Hornhautepithelzell-spezifischen Transkriptionsfaktors Pax6 und der hornhautspezifischen Keratine Krt12 und Krt3 sowie in einer signifikanten Zunahme der Expression der hautbezogenen Plattenepithelmetaplasie-Marker Krt10, Krt1 und Sprr1b8; 2) Eine Verletzung der Augenoberfläche zerstört direkt die limbalen Stammzellen der Hornhaut, was zu Nekrose oder Apoptose führt und anschließend zu einer Proliferation des Bindehautgewebes führt, die die Hornhaut bedeckt9. Es wurde berichtet, dass während der Entwicklung der LSCD Entzündungszellen wie Makrophagen, Neutrophile und dendritische Zellen in der Mikroumgebung der Hornhautepithelstammzellen signifikant zunehmen. Dementsprechend weisen auch Zytokine wie Interferon-gamma (IFN)-γ, Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interleukin (IL)-1β und Makrophagen-Entzündungsproteine (MIP)-1α/β signifikante Erhöhungen auf10.

Es wurden verschiedene LSCD-Modelle etabliert, darunter solche, die durch Nähte, chemische Verletzungen und Benzalkoniumchlorid-Schmierblutungen induziert wurden11. Jedes dieser Modelle hat seine Vor- und Nachteile. Chemische Verletzungen können die gesamte Augenoberfläche schädigen und limbale Stammzellen direkt zerstören12. Benzalkoniumchlorid funktioniert ähnlich wie chemische Verletzungen, hat aber eine relativ langsame Wirkung13. Das Modell der Hornhautnaht kann eine stabile und langfristige Entzündungsreaktion induzieren, aber die Entzündungsreaktion ist relativ mild und kann keine LSCD verursachen.

Um die Rolle und die Mechanismen von Entzündungen bei der Entstehung der Hornhaut-LSCD zu untersuchen, wurde ein Tiermodell etabliert, das die Kürettage des zentralen Hornhautepithels mit Hornhautnähten kombiniert. Dieses Modell induziert eine anhaltende Entzündung des Hornhautepithels, ohne die limbalen Stammzellen direkt zu schädigen.

Protokoll

Alle Verfahren entsprachen den ARVO-Richtlinien für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung und wurden von der Tierethikkommission der Medizinischen Universität Guizhou genehmigt (Zulassung Nr. 2305192). Die Ratten wurden im Tierzentrum der Medizinischen Universität Guizhou untergebracht, wo die einschlägigen Tierschutzvorschriften eingehalten wurden.

1. Auswahl der Tiere

  1. Verwenden Sie weibliche Sprague-Dawley (SD) Ratten im Alter von 7-8 Wochen. Stellen Sie sicher, dass bei der Untersuchung mit der Spaltlampe keine Läsionen an der Augenoberfläche vorhanden sind.
  2. Sterilisieren Sie die Instrumente mit einem Schnellsterilisator. Zu den erforderlichen Instrumenten gehören ein Hornhautrostentfernungslöser, ein Hautprobenmarker mit einer Größe von 2 mm, Nadelhalter, Plattenschichtmesser, eine ophthalmologische chirurgische Schere und eine Pinzette.
  3. Betäuben Sie Ratten mit 1,25 % Tribromethanol durch intraperitoneale Injektion in einer Dosis von 0,3 ml pro 100 g Körpergewicht. Beurteilen Sie die Anästhesietiefe durch Zehenkneifen. Träufeln Sie einen Tropfen Tropicamid Augentropfen zur Pupillenerweiterung. Tragen Sie Bupivacainhydrochlorid-Augentropfen auf das Auge auf. Verwenden Sie Augenschmiersalbe auf dem kontralateralen Auge, um die Feuchtigkeit zu erhalten.
  4. Desinfizieren Sie die Haut und die Haare um die Augen mit Jodophor.
  5. Etablieren Sie das Entzündungsmodell.
    1. Bringen Sie die Ratte in die laterale Dekubitusposition. Den Augapfel unter einem Operationsmikroskop belichten.
    2. Die zentrale Hornhaut wurde mit einem 2 mm großen Hautprobenahmemarker markiert, und das markierte zentrale Hornhautepithel wurde mit einem Hornhautrostringentferner abgekratzt.
    3. Drei 120°-Hornhautnähte mit 10-0-Nylondraht, Nadelhalter und ophthalmochirurgischer Schere und Pinzette etwa 3 mm vom Limbus entfernt platzieren, nicht in die Hornhauteindringen 14,15.
  6. Tragen Sie am Ende des Eingriffs Ofloxacin-Augensalbe auf, um eine Infektion zu verhindern.
  7. Beobachten und fotografieren Sie die Hornhaut am 1., 3. und 7. Tag nach der Operation mit einer Spaltlampe mit 10-facher Vergrößerung. Notieren Sie die Symptome wie Heilung des Hornhautepithels, Bindehauthyperämie, Hornhautödem, limbale Hyperämie und Hornhautneovaskularisation.

2. Berechnung des Entzündungsindex

  1. Berechnen Sie den Entzündungsindex der Augenoberfläche nach der Etablierung des Tiermodells.
    1. Die Ziliarkörperstauung ist wie folgt zu bewerten: keine Stauung (0 Punkte); das Vorhandensein von Stauungen von weniger als 1 mm (1 Punkt); Hyperämie zwischen 1 mm und 2 mm (2 Punkte); Hyperämie zwischen 1 mm und 2 mm (3 Punkte).
    2. Bewerten Sie das zentrale Hornhautödem wie folgt: kein Ödem (0 Punkte); Ödeme mit klarer Sichtbarkeit der Iris (1 Punkt); Ödeme mit unklarer Sichtbarkeit der Iris (2 Punkte); Ödem, bei dem die Iris nicht sichtbar ist (3 Punkte).
    3. Bewerten Sie das parazentrale Hornhautödem wie folgt: kein Ödem (0 Punkte); Ödeme mit klarer Sichtbarkeit der Iris (1 Punkt); Ödeme mit unklarer Sichtbarkeit der Iris (2 Punkte); Ödem, bei dem die Iris nicht sichtbar ist (3 Punkte).
    4. Berechnen Sie den Entzündungsindex, indem Sie alle Punktzahlen addieren und durch 9 dividieren.

3. Beurteilung der Hornhautneovaskularisation

  1. Beobachten Sie die Neovaskularisation der Hornhaut mit einer Spaltlampe.
    1. Analysieren und Verarbeiten von Bildern mit Spaltlampen-Bildverarbeitungssoftware16.
    2. Zeichnen Sie das Wachstum der Hornhaut-Neovaskularisation zu jedem Beobachtungszeitpunkt auf, indem Sie die längste Hornhaut-Neovaskularisation in Richtung der zentralen Hornhaut mit minimaler Krümmung messen.
    3. Ordnen Sie sie wie folgt ein: Grad 0: Avaskulär; Klasse 1: Mikro (<1 mm); Grad 2: Mild (1 mm bis 1,5 mm); Grad 3: Mittel (>1,5 mm bis 2 mm); Grad 4: Schwer (>2 mm).

4. Analyse der Biologie des Modells

  1. Bereiten Sie gefrorene Augenproben vor.
    1. Betäuben Sie die Ratte mit 4-5% Isofluran und euthanasieren Sie sie durch Zervixluxation.
    2. Hebe in der seitlichen Dekubitusstellung den Ratten-Augapfel mit einer Mikropinzette nach außen und schneide die Bindehaut entlang der oberen und unteren Augenkuppel mit einer Augenschere auf.
    3. Schneiden Sie den Sehnerv ab und achten Sie darauf, die Integrität des Hornhautepithels zu erhalten.
    4. Trocknen Sie die Blutflecken und das Wasser auf der Augapfeloberfläche mit Filterpapier ab und geben Sie sie in die Einbettbox mit optimalem Einbettmedium mit optimaler Schnitttemperatur (OCT).
    5. Entfernen Sie die Blasen in der Einbettbox mit einer 200-μl-Pipette, frieren Sie sie mit flüssigem Stickstoff ein und bewahren Sie die eingebetteten Proben dann im Kühlschrank bei extrem niedriger Temperatur auf.
  2. Bereiten Sie gefrorene Schnitte der Augäpfel vor.
    1. Vor der Vorbereitung des Gefrierschnitts wird der Kryostat auf ca. -28 °C und der Probenhalter auf -26 °C vorgekühlt.
    2. Nehmen Sie die gefrorenen Proben aus dem Kühlschrank und legen Sie sie für ca. 1 h in das Kryotom.
    3. Die gefrorene Probe in einem Kryotom 10 Minuten vorkühlen. Markieren Sie die Probe mit einem Bleistift, fixieren Sie sie mit OCT auf dem Probenblock und fixieren Sie sie nach dem Abkühlen zusammen auf dem Trenngestell.
    4. Stellen Sie die Position und Richtung der eingefrorenen Probe ein und fixieren Sie sie. Schneiden Sie zunächst 20 μm lange Abschnitte, bis die zentrale Hornhaut zu sehen ist. Anschließend erhalten Sie durch kontinuierliches Schneiden 6 μm-Schnitte und sammeln die Schnitte auf den vorbereiteten Adhäsionsobjektträgern.
    5. Markieren Sie den Namen, das Material, die Schnittzeit, den Namen und die Nummer des Gewebes auf dem Objektträger. Stellen Sie es für ca. 30 min bei Raumtemperatur (RT) auf.
    6. Nachdem Sie die Abschnitte getrocknet haben, legen Sie sie in eine Schachtel und bewahren Sie sie zur Reserve im Kühlschrank mit extrem niedriger Temperatur auf.
  3. Führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung durch.
    1. Nehmen Sie die vorbereiteten Tiefkühlteile aus dem Ultratiefkühlschrank und legen Sie sie zum Trocknen in den Abzug bei RT.
    2. Fixieren Sie die Schnitte mit 4% Paraformaldehyd für 15 min bei RT. Spülen Sie die Proben 5 min lang mit 1x PBS.
    3. Legen Sie die Probenabschnitte mit den Objektträgern auf einen Objektträgerhalter und tauchen Sie sie mit Hämatoxylin-Farbstofflösung bei RT für 5 min in den Färbezylinder.
    4. Spülen Sie die Probe mit den Objektträgern langsam mit Leitungswasser ab, um den schwimmenden Farbstoff abzuwaschen, geben Sie sie in den Färbetank mit 0,1%igem Salzsäurealkohol und entfernen Sie sie schnell nach 1-2 s.
    5. Spülen Sie die Probe 15 Minuten lang langsam mit Leitungswasser ab.
    6. Nehmen Sie die Probe aus dem Wasser und tauchen Sie die Objektträger in den Eosin-Farbstofftank; 3 Minuten bei RT stehen lassen.
    7. Spülen Sie die Probe langsam mit Leitungswasser ab, waschen Sie den überschüssigen Farbstoff ab und führen Sie eine Gradientendehydrierung mit 75 % Alkohol, 80 % Alkohol, 95 % Alkohol, 100 % Alkohol (eins) und 100 % Alkohol (zwei) durch. Immsere die Abschnitte in jeder Konzentration für 2 min.
    8. Machen Sie die Proben für 2 min in Xylol (1) bzw. Xylol (2) transparent.
    9. Trocknen Sie die Probe im Abzug, versiegeln Sie die Abschnitte mit einem Dichtmittel und achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen.
    10. Legen Sie die Objektträger in eine Objektträgerbox bei RT. Bilden Sie die Schnitte mit einem Mikroskop ab.
  4. Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung durch.
    1. Entfernen Sie die gefrorenen Abschnitte und legen Sie sie zum Trocknen in eine Box bei RT in den Abzug.
    2. Markieren Sie den Namen des zu färbenden Antikörpers im Objektträgerrohling der gefrorenen Probe.
    3. Fixieren Sie die Proben mit 4% Paraformaldehyd bei RT für 15 min. Eine kleine Menge Leitungswasser wurde in die Box gegeben, um ein Austrocknen der Probe zu verhindern.
    4. Entfernen Sie das Paraformaldehyd-Fixiermittel und waschen Sie die Probe dreimal mit 1x PBS-Puffer. Achten Sie darauf, die Probe nicht abzuspülen.
    5. Trocknen Sie die Flüssigkeit um den Gewebeschnitt herum, bedecken Sie die Probe mit Zellmembranlösung (0,2 % TritonX-100) und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei RT.
    6. Entfernen Sie die Zellmembranlösung und waschen Sie die Schnitte dreimal für jeweils 5 min mit 1x PBS-Puffer.
    7. Trocknen Sie die Gewebeschnitte, bedecken Sie die Probe mit Immunfluoreszenz-Blockierungslösung (2 % BSA) und inkubieren Sie sie 1 h lang bei RT.
    8. Bereiten Sie den Primärantikörper und das Verdünnungsmittel (1 % BSA) während der Inkubation gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
    9. Entfernen Sie die Sperrflüssigkeit und trocknen Sie die Probe mit einer Saugpumpe. Geben Sie den vorbereiteten Primärantikörper hinzu, decken Sie die Schachtel ab und inkubieren Sie ihn über Nacht in einem Kühlschrank bei 4 °C (ca. 12-16 h inkubieren) unter Lichtschutz stellen.
    10. Verwerfen Sie den Primärantikörper und waschen Sie die Probe viermal für jeweils 10 Minuten in PBS.
    11. Bereiten Sie während des Reinigungsschritts die Verdünnung des Sekundärantikörpers gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
    12. Entfernen Sie PBS, trocknen Sie die Probe und geben Sie den vorbereiteten Sekundärantikörper in die Probe. Decken Sie die Probe ab und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang bei RT unter Lichteinfall.
    13. Entfernen Sie den Sekundärantikörper, waschen Sie die Probe 4 Mal mit 1x PBS-Puffer für jeweils 10 min und bedecken Sie den gesamten Objektträger mit 1x PBS-Puffer.
    14. Entfernen Sie PBS, trocknen Sie die Probe und versiegeln Sie die Schnitte mit einem Einbettmedium, das DAPI enthält, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Wickeln Sie die Objektträger in Alufolie ein und halten Sie sie bei 4 °C Lichtschutz.
    15. Fotografieren Sie mit einem konfokalen Lasermikroskopsystem oder mit einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop-Kamerasystem (Scangeschwindigkeit: 4 μs/Pixel, Scanauflösung: 1024 x 1024).
  5. Einzelzellsuspensionspräparation des Hornhautepithels der Ratte
    1. Entfernen Sie nach der Euthanasie die Augäpfel mit einer Pinzette, die in 75% Alkohol getränkt ist, und legen Sie sie in die 1x Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS), die 10% fötales Rinderserum (FBS) und 10% Penicillin-Streptomycin enthält, die im Voraus zubereitet wurde.
    2. Reinigen Sie die Augäpfel und verwenden Sie 1x HBBS mit 10% FBS und 10% Penicillin-Streptomycin zweimal für jeweils 5 Minuten.
    3. Entfernen Sie die Bindehaut entlang des Skleralrandes; Lassen Sie den Skleralrand bei ca. 1 mm. Auch hier wird das Hornhautgewebe zweimal mit 1x HBBS gewaschen, das 10% FBS und 10% Penicillin-Streptomycin enthält.
    4. Übertragen Sie das saubere Hornhautgewebe in ein supplementiertes hormonelles epidermales Medium (SHEM), das 2 U/ml Dispase II enthält. Schließen Sie die Versiegelung und stellen Sie sie 14-16 h lang auf 4°C.
    5. Halten Sie eine Pinzette, eine zahnlose Pinzette, ein Iriswiederherstellungsgerät und einen chirurgischen Sterilisator bereit.
    6. Trennen Sie das Hornhautepithel vorsichtig unter einem Operationsmikroskop entlang des Hornhautrandes.
    7. Waschen Sie das Hornhautepithel mit 1x HBSS mit 10% Penicillin-Streptomycin für 5 min.
    8. Das Hornhautepithelgewebe wird in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 200 ml Trypsin überführt und in einem Inkubator mit 5 % CO2 und 37 °C inkubiert. Schütteln Sie das Zentrifugenröhrchen alle 5 Minuten dreimal, um das Hornhautepithelblatt zu einer einzelligen Suspension zu verdauen.
    9. Fügen Sie eine gleiche Menge SHEM-Medium hinzu, um die Wirkung der Trypsin-Aufschlusslösung zu stoppen, und geben Sie es bei RT.
  6. Klonkultur von Hornhautepithelzellen
    1. Bereiten Sie Trophoblastzellen vor.
      1. Wenn die Wachstumsdichte von NIH 3T3-Mauszellen 80-90 % erreicht, entsorgen Sie das Zellkulturmedium. Geben Sie vorgefertigtes 10 mg/ml NIH 3T3 Mitomycin-Kulturmedium hinzu und inkubieren Sie es 2,5 h lang bei 37 °C.
      2. Entfernen Sie das Medium, spülen Sie die Zellen mit 1x HBSS, ersetzen Sie es durch neues NIH 3T3-Zellmedium und setzen Sie die Inkubation in einem CO2 -Inkubator (5% CO2, 37 °C) fort.
    2. Bereiten Sie die Hornhautepithelzellsuspension vor und zählen Sie die Zellen im erforderlichen Verhältnis.
    3. Verarbeiten Sie bei der Vorbereitung der Hornhautepithelzellsuspension NIH 3T3-Zellen, die mit Mitomycin behandelt wurden.
      1. Entsorgen Sie den Überstand, spülen Sie die Zellen mit 1x HBSS, fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und inkubieren Sie 2-3 Minuten bei RT.
      2. Fügen Sie eine gleiche Menge an zusätzlichem hormonellem Epithelmedium hinzu (SHEM-Medium: DMEM/F12, 10 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor der Maus [EGF], 10 μg/ml Insulin-Transferrin-Selen [ITS], 5 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin, 0,5 % Dimethylsulfoxid [DMSO], 0,5 mg/ml Hydrocortison), pipettieren Sie vorsichtig, um eine Zellsuspension herzustellen, und zählen Sie die Zellen.
    4. Verwenden Sie eine 12-Well-Platte und geben Sie 0,5 ml SHEM-Medium in jede Vertiefung.
    5. Mischen Sie Hornhautepithelzellen mit NIH 3T3-Zellen in einer Dichte von 500 Hornhautepithelzellen/cm2 und 5 x 105 NIH 3T3 Zellen/cm2. Geben Sie 1 ml SHEM-Medium in jede Vertiefung.
    6. Geben Sie 1 ml der Zellmischung in jede Vertiefung und pipettieren Sie vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
    7. Inkubieren Sie in einem Inkubator (5 % CO2, 37 °C) und wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Kultur für 12-14 Tage.
  7. Kristallviolette Färbung
    1. Nach etwa 12 Tagen, wenn die Klone des Hornhautepithels kurz vor der Verschmelzung stehen, entfernen Sie das Kulturmedium und geben Sie 1 ml 4%ige Paraformaldehydlösung in jede Vertiefung, wodurch die Zellen vollständig bedeckt werden. Fixieren Sie die Zellen für 15 min bei RT.
    2. Entfernen Sie 4% Paraformaldehyd und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 1x PBS für jeweils 5 min.
    3. Entfernen Sie 1x PBS-Puffer und geben Sie 0,4% Kristallviolett-Farbstofflösung in jede Vertiefung. 30 min bei RT färben.
    4. Entfernen oder recyceln Sie die kristallviolette Farbstofflösung und waschen Sie sie dreimal mit 1x PBS für jeweils 10 min.
    5. Trocknen Sie die Vertiefungen bei RT an der Luft, bis sie gründlich getrocknet sind.
    6. Verwenden Sie ein normales aufrechtes Mikroskop-Fotosystem (Scangeschwindigkeit: 4 μs/Pixel, Scanauflösung: 1024 x 1024).
  8. Extraktion von Hornhaut-mRNA
    1. Sammeln Sie eine Augenschere, eine Hornhautschere, eine Zahnzange, einen elektrischen Hornhautepithelschaber, Trizol, RNase-freie 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und eine Eisbox.
    2. Erwerb von Epithelien
      1. Betäuben Sie die Ratte mit 4-5% Isofluran und euthanasieren Sie sie nach einer Gebärmutterhalsluxation. Bringen Sie das Tier in eine seitliche Position. Schneiden Sie die Schnurrhaare der Maus mit einer Augenschere ab, um die Sicht nicht zu behindern.
      2. Legen Sie die Ratte unter ein Operationsmikroskop und stellen Sie es auf eine geeignete Höhe ein, um auf den Augapfel zu fokussieren. Drücke mit einer Zahnzange sanft auf den Augapfel und lege ihn frei. Heben Sie die Bindehaut der Ratte an und verwenden Sie einen sauberen elektrischen Hornhautepithelschaber, um den zentralen 2 mm großen Bereich des Hornhautepithels abzukratzen.
      3. Entnehmen Sie das abgeschabte Hornhautepithel mit einer sauberen, mit Alkohol besprühten Zange mit Zähnen. Geben Sie das gesammelte Gewebe in ein Zentrifugenröhrchen mit 1 ml Trizol.
      4. Arbeiten Sie so schnell wie möglich, um das gesammelte Gewebe in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit doppelt deionisiertem Wasser zu spülen. Überschüssiges Wasser mit Filterpapier aufsaugen. Mit 75% Alkohol besprühen und mit dem nächsten Schritt fortfahren.
      5. Heben Sie die Bindehaut der Ratte mit einer Zahnzange wieder an. Schneiden Sie die Bindehaut mit der konkaven Seite nach oben mit einer Hornhautschere entlang des Limbus ab und lassen Sie etwa 0,5 mm weiße Bindehaut übrig.
      6. Kratzen Sie das Hornhautepithel in einem Abstand von 2 mm am Hornhautlimbus mit dem elektrischen Schaber ab. Entnehmen Sie das Gewebe wie zuvor beschrieben. Entnehmen Sie das zentrale Hornhautepithel von drei Augäpfeln und das Limbusepithel von drei Augäpfeln.
      7. Legen Sie das gesammelte Gewebe in separate 1-ml-Trizol-RNA-Extraktionsreagenzröhrchen. Führen Sie den gesamten Vorgang auf Eis durch, um die RNA-Integrität zu erhalten. Fahren Sie sofort mit den nächsten Schritten fort oder lagern Sie die Proben für die spätere Verwendung in einem Ultratiefkühlschrank bei -80 °C.
    3. Tauen Sie die Probe auf Eis auf und verwenden Sie einen Ultraschall-Gewebehomogenisator, um die Zellen zu lysieren. Stellen Sie die Leistung des Ultraschall-Homogenisators auf 25 %, die Zeit auf 2 s pro Burst, die Intervallzeit auf 5 s und die Gesamtzeit auf 2 min ein. 10 min auf Eis ziehen lassen.
    4. Chloroform (1/5 des Gesamtvolumens, ca. 200 μl) zu jeder Probe geben, durch Invertieren für 30 s gründlich mischen und 10 min bei 4 °C bei 400 x g zentrifugieren.
    5. RNA-Präzipitation
      1. Nach der Zentrifugation wird die Flüssigkeit im Inneren des Zentrifugenröhrchens in drei Teile geschichtet. Die obere durchsichtige Schicht besteht aus RNA, die mittlere weiße trübe Schicht aus DNA und Proteinen und die untere Schicht aus Trizol. Pipettieren Sie vorsichtig etwa 500 μl der oberen klaren Schicht in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei Sie darauf achten, dass der weiße Niederschlag in der mittleren Schicht nicht abgesaugt wird. Bei versehentlichem Ansaugen ist das Zentrifugieren zu wiederholen, um die klare Schicht wieder zu sammeln.
      2. Geben Sie eine gleiche Menge vorgekühltes Isopropanol in das Zentrifugenröhrchen mit der klaren Schicht, ca. 500 μl, drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um es gründlich zu mischen, und stellen Sie es dann sofort für 20-30 Minuten in einen -80 °C Ultratiefkühlschrank. Dieser Schritt zielt darauf ab, die Ausfällung von RNA zu beschleunigen.
    6. Die Probe wird entnommen und sofort bei 400 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Eine kleine Menge weißen, flockigen Niederschlags ist am Boden des Zentrifugenröhrchens zu sehen; Entsorgen Sie den Überstand.
    7. Geben Sie vorgefertigtes und eisgekühltes 70%iges Ethanol in jedes Röhrchen. Sofort bei 4 °C in einer gekühlten Zentrifuge bei 400 x g für ca. 10 min zentrifugieren; Wiederholen Sie die obigen Schritte einmal, um den Niederschlag gründlich zu waschen. In diesem Schritt wird der Abzug 15 Minuten lang mit UV-Licht vorsterilisiert.
    8. Nach Entnahme der Zentrifugenröhrchen und Entsorgen des Überstands erneut bei 4 °C bei ca. 250 x g für 2 min zentrifugieren. Verwenden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze, um den überschüssigen Alkohol vorsichtig von der dem Niederschlag gegenüberliegenden Seite abzusaugen und so gründlich wie möglich zu trocknen. Zum Trocknen in einen vor-UV-sterilisierten Abzug legen und den Niederschlag ca. 15 Minuten an der Luft trocknen lassen.
    9. Bereiten Sie die Lösung vor, indem Sie 1 ml RNase-Inhibitor zu 40 ml Diethylpyrocarbonat (DEPC)-Wasser hinzufügen. Fügen Sie eine angemessene Menge DEPC-Wasser/RNase-Inhibitor-Mischung, etwa 20-30 μl, hinzu, um die Probe aufzulösen. Wenn viel Niederschlag vorhanden ist, fügen Sie 30-50 μl hinzu. Fahren Sie sofort mit der reversen Transkriptions-PCR fort.
  9. Reverse Transkriptions-PCR
    1. Stellen Sie sicher, dass diese Gegenstände vorhanden sind: PCR-Gerät, RNase-freie 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, 0,2-ml-PCR-Röhrchen, Eisbad oder Eisbox, Pipette und RNase-freie Spitzen.
    2. Messen Sie die RNA-Konzentration mit dem Mikrovolumen-Spektrophotometer. Stellen Sie sicher, dass für jede Probe 1 μg RNA in das Reaktionssystem gegeben wird.
    3. Das reverse Transkriptionssystem hat ein Gesamtvolumen von 20 μl. Berechnen Sie die Gesamtmenge der benötigten Reagenzien basierend auf der Anzahl der Proben. Mischen Sie nach dem in der Anleitung angegebenen Verhältnis.
    4. Bereiten Sie das Reaktionssystem auf Eis vor, wirbeln Sie es vor und zentrifugieren Sie es kurz. Inkubieren Sie 15 min lang bei 42 °C und 30 s lang bei 90 °C.
    5. Verwenden Sie die aus dem reversen Transkriptionsprozess gewonnene cDNA entweder direkt für die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse oder lagern Sie sie in einem Kühlschrank bei -80 °C.
  10. Quantitative PCR-Reaktion in Echtzeit
    1. Verwenden Sie ein quantitatives Echtzeit-PCR-Reagenzkit17 mit einem 10-μl-Reaktionssystem. Verwenden Sie die in Tabelle 1 gezeigten Primersequenzen.
    2. Geben Sie das oben beschriebene Reaktionssystem in eine 96-Well-Platte oder ein Acht-Streifen-Röhrchen speziell für die RT-PCR. Stellen Sie sicher, dass die Proben gut gemischt sind. Überprüfen Sie, ob sich in den Röhrchen Blasen befinden, bevor Sie sie auf das PCR-Gerät legen.
    3. Amplifizieren Sie das Gen mit dem PCR-Zyklus (95 °C für 5 Minuten), 40 Zyklen (95 °C für 10 s, 60 °C für 30 s) und vervollständigen Sie die Daten, um den 2-ΔΔ Ct-Wert zu berechnen. Verarbeiten, analysieren und plotten Sie die Daten mit geeigneter Datenanalysesoftware.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 1A gezeigt, stellten wir durch Beobachtung mit einer Spaltlampe fest, dass die Heilung des Hornhautepithels beeinträchtigt war. Unter normalen Umständen würde das zentrale Hornhautepithel innerhalb von 24-48 h nach der Entnahme vollständig abheilen, aber bei der Exzision des zentralen Hornhautepithels in Kombination mit einem Nahtmodell blieben weiterhin neue Blutgefäße vorhanden. Am dritten Tag nach der Etablierung des Modells wurden ...

Diskussion

Entzündungen spielen eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung eines Mangels an limbalen Stammzellen18, aber ihre spezifischen Mechanismen und Wirkungen bedürfen weiterer Forschung. Um dieses Problem zu lösen, induzierten wir LSCD, indem wir das zentrale Hornhautepithel abkratzten und das zentrale Hornhautstroma nähten, um eine schwere Hornhautentzündung zu verursachen. Wir beobachteten die Entwicklung der Hornhautentzündung und den Status der limbalen Stammz...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde teilweise unterstützt von den Wissenschafts- und Technologieprojekten der Provinz Guizhou (QKHJC-ZK [2024] ZD043), dem Wissenschaftsfonds der Provinz Fujian für herausragende junge Gelehrte (2023J06053 [an S.O]); die Natural Science Foundation of China (Nr. 82101084 [an S.O.] und der China Scholarship Council (CSC, 202306310049 [an Y.W.]).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10-0 suture lineAlcon, Inc., USA8065698001
2 mm corneal trephineSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, 1 mL pipette gun heads, cell culture plate culture plates, centrifuge tubesGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chinahttps://www.jetbiofil.com/index.html
-20/-80 °C fridgeQingdao Haier Company, Chinahttps://www.haier.com/cn/
A 10-mL syringe Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chinahttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Adhere to the slideShiTai Company188105
Amylene alcoholShanghai. Macklin Biochemical, Chinahttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, United Kingdomab76318
Anti-Keratin 12 antibody EPR17882Abcam, United Kingdomab185627
Anti-PAX6 antibodyAbcam, United Kingdomab195045
Anti-stripping slides, cover slipsJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd., Chinahttps://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, Japanhttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Chinahttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
CO2 Oven incubator, ultrasonic crusher, centrifugeThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Confocal microscopeShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chinahttps://www.clinx.cn/about
Corneal epithelial forcepsSuzhou XVI Vision Company, China53418D
DAPIVector. Inc., USAH-1000
DEPC water Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
Dicuro eye cream (ofloxacin eye cream)Santian Pharmaceutical Corporation, Japanhttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, culture medium, double antibody, and PBSThermo Fisher Scientific, Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, United Kingdom MCA341GA
Electronic balanceShanghai Ohaus Biotechnology Company, Chinahttp://shbio.com/company
Enclosure of the membraneParafilm, Inc., USAhttps://www.sigmaaldrich.cn
Fluorescein sodium test strip was used in ophthalmologyTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinahttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Fluorescent inverted phase-contrast micrographic systemTE-2000U, Nikon, Japanhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Frozen table-top centrifugeEppendorf, Germanyhttps://www.eppendorf.sh.cn 
Glass sheet frameXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://www.tagene.net/
H-1200 with DAPI sealagentXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Chinahttps://www.bosonbio.com.cn/
HE staining kitAuragene, Chinahttp://jushengwu.com/a048/
Hematoxylin-eosin dye solution kitAURAGEN, United StatesP032IH
High and low precision electronic balanceSdolis, Germanyhttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinahttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67 antibodyAbcam, United Kingdomab16667
liquid nitrogenXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chinahttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Microhand holderSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Multiformaldehyde powderSigm, Americahttps://www.sigmaaldrich.cn
Normal temperature centrifuge 46Eppendorf, Germanyhttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China4583
Ordinary biological micrographic systemEclipse 50i, Nikon, Japanhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChinaSH30256.01
PCR, and the reactor apparatusBiometra Thermocycler, Germanyhttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipettes of various specificationsEppendorf Company, Germanyhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers for Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaine hydrochloride 0.5% eye dropsAlcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Rat PMN antibodyFitzgerald, United States20R-PR020
Real time fluorescence quantitative PCRApplied Biosystems, United Stateshttps://www.thermofisher.cn
Reverse transcription kitTAKARA, Japanhttps://www.takarabiomed.com.cn/
Slit lampTOPCON, Japanhttps://topconchina.cn/
Smooth forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://chuangdianbio.com/
Superclean benchNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singaporehttps://www.hi-p.com/
Toothed forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Toppicamide eye drops (Medol)Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Trace nucleic acid protein concentration testerThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen The United Stateshttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, with a surgical microscopeCarl ZEIS, Germanyhttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html

Referenzen

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