JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

我们通过角膜上皮刮除术联合角膜缝合开发了严重角膜炎症大鼠模型。该研究评估了炎症条件下角膜皮炎症模式、上皮增殖和角膜缘干细胞的变化。

摘要

角膜炎症，尤其是严重的角膜炎症，在角膜缘干细胞功能障碍的发展中起着重要作用。构建合适的动物模型可以帮助我们关注严重炎症对角膜缘干细胞的影响。使用 2 mm 除锈剂去除 Sprague Dawley （SD） 大鼠的中央角膜上皮以造成损伤。然后，用尼龙缝合线缝合角膜的中央基质以诱导持续性炎症。以这种方式构建了具有中央角膜上皮擦伤和中央基质缝合的角膜炎症模型，诱导了严重的角膜炎症。观察造模后 1 、 3 和 7 天角膜膜炎症的变化和角膜缘干细胞的状况。造模后第3 天， 大鼠角膜角膜缘严重水肿，伴有明显的新生血管和局部增生，是角膜缘干细胞缺乏的典型体征。到第 7 天，角膜水肿逐渐恶化，新生血管继续增加。通过定量逆转录聚合酶链反应 （RT-qPCR） 和免疫荧光染色，我们发现角膜上皮炎症因子显著上调，角膜上皮分化异常，角膜上皮干细胞显著减少，细胞增殖和干性也降低。因此，该模型表明，严重的炎症可以诱导角膜缘干细胞损伤，而不会直接损伤角膜缘干细胞。该模型有利于观察严重炎症对干细胞生物学机制的影响，为研究炎症诱导的角膜上皮干细胞功能障碍机制提供了理想的平台。

引言

角膜缘干细胞功能障碍 （LSCD） 的特征是持续性上皮缺损、角膜血管形成、慢性炎症、瘢痕形成和角膜结膜形成 1,2。它可能是由严重的眼表疾病后角膜缘干细胞耗竭或功能障碍引起的，例如化学烧伤、热烧伤、Stevens-Johnson 综合征和眼部手术引起的医源性损伤 2,3,4。LSCD 的致病机制主要涉及干细胞的改变和干细胞微环境的紊乱 5,6，这会影响角膜上皮的稳态 2,7。LSCD 中角膜缘干细胞的命运变化主要有两种类型：1） 角膜上皮干细胞的定向分化电位变得异常，导致它们分化为皮肤上皮细胞。角膜上皮细胞特异性转录因子 Pax6 和角膜特异性角蛋白 Krt12 和 Krt3 的表达降低，以及皮肤相关鳞状上皮化生标志物 Krt10、Krt1 和 Sprr1b 的表达显着增加证明了这一点8;2） 眼表损伤直接破坏角膜缘干细胞，导致坏死或细胞凋亡，进而引起覆盖角膜的结膜组织增生9.据报道，在 LSCD 的发育过程中，角膜上皮干细胞微环境中的巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等炎症细胞显着增加。相应地，干扰素-γ （IFN）-γ、肿瘤坏死因子 （TNF）-α、白细胞介素 （IL）-1β 和巨噬细胞炎症蛋白 （MIP）-1α/β 等细胞因子也显示出显著升高10。

已经建立了各种 LSCD 模型，包括由缝合、化学损伤和苯扎氯铵点样诱导的模型11。这些模型中的每一种都有其优点和缺点。化学损伤会损害整个眼表并直接破坏角膜缘干细胞12。苯扎氯铵的功能类似于化学损伤，但作用相对较慢13。角膜缝合模型可诱导稳定和长期的炎症反应，但炎症反应相对较轻，不能引起 LSCD。

为了研究炎症在角膜 LSCD 发展中的作用和机制，建立了一种将中央角膜上皮刮除术与角膜缝合相结合的动物模型。该模型诱导角膜上皮的持续炎症，而不会直接损伤角膜缘干细胞。

研究方案

所有程序均符合 ARVO 关于将动物用于眼科和视觉研究的指南，并获得了贵州医科大学动物伦理委员会的批准（批准2305192号）。大鼠被安置在贵州医科大学动物中心，遵守相关动物管理规定。

1. 动物选择

  1. 使用 7-8 周龄的雌性 Sprague-Dawley （SD） 大鼠。确保在裂隙灯检查下没有眼表病变。
  2. 使用快速灭菌器对器械进行灭菌。所需的器械包括角膜除锈环器、2 毫米大小的皮肤采样标记、持针器、板层刀、眼科手术剪刀和镊子。
  3. 通过腹膜内注射用 1.25% 三溴乙醇麻醉大鼠，剂量为每 100 g 体重 0.3 mL。通过脚趾捏评估麻醉深度。滴入一滴托吡卡胺滴眼液以散瞳。将盐酸布比卡因滴眼液涂抹在眼睛上。在对侧眼睛上使用眼部润滑剂软膏以保持水分。
  4. 用碘伏消毒眼睛周围的皮肤和头发。
  5. 建立炎症模型。
    1. 将大鼠置于侧卧位。在手术显微镜下曝光眼球。
    2. 使用 2 毫米大小的皮肤取样标记中央角膜，并使用角膜锈环去除剂刮擦标记的中央角膜上皮。
    3. 使用 120-10 尼龙丝、持针器和眼科手术剪刀和镊子在距离角膜缘约 3 毫米处放置三条角膜缝合线，不要穿透角膜14,15。
  6. 在手术结束时涂抹氧氟沙星眼膏以防止感染。
  7. 在术后第 1天、第 3 天和第 7 天使用裂隙灯放大 10 倍镜头观察和拍摄角膜。记录角膜上皮愈合、结膜充血、角膜水肿、角膜缘充血和角膜新生血管形成等症状。

2. 炎症指数的计算

  1. 建立动物模型后计算眼表的炎症指数。
    1. 睫状体充血评分如下：无充血 （0 分）;充血小于 1 毫米 （1 分）;充血在 1 mm 和 2 mm 之间 （2 分）;充血在 1 mm 到 2 mm 之间 （3 分）。
    2. 中央角膜水肿评分如下：无水肿 （0 分）;水肿伴虹膜清晰可见 （1 分）;水肿伴虹膜可见度不清晰 （2 分）;水肿伴虹膜不可见 （3 分）。
    3. 中央旁角膜水肿评分如下：无水肿 （0 分）;水肿伴虹膜清晰可见 （1 分）;水肿伴虹膜可见度不清晰 （2 分）;水肿伴虹膜不可见 （3 分）。
    4. 将所有分数相加并除以 9 来计算炎症指数。

3. 角膜新生血管评估

  1. 用裂隙灯观察角膜新生血管。
    1. 使用裂隙灯图像处理软件分析和处理图像16.
    2. 记录每个观察时间点角膜新生血管的生长，测量朝向中央角膜的最长角膜新生血管，曲率最小。
    3. 按以下方式对它们进行分级：0 级：无血管;1 级：微型 （<1 mm）;2 级：轻度（1 mm 至 1.5 mm）;3 级：中度（>1.5 mm 至 2 mm）;4 级：重度 （>2 mm）。

4. 分析模型的生物学特性

  1. 准备冷冻眼标本。
    1. 用 4-5% 异氟醚麻醉大鼠，并通过宫颈脱位对其实施安乐死。
    2. 在侧卧位，用微镊将大鼠眼球向外提起，用眼剪刀沿上下眼穹顶切开结膜。
    3. 切断视神经，注意保持角膜上皮的完整性。
    4. 用滤纸擦干眼球表面的血渍和水，放入具有最佳切割温度 （OCT） 包埋介质的包埋盒中。
    5. 用 200 μL 移液器去除包埋盒中的气泡，用液氮冷冻，然后将包埋的标本保存在超低温冰箱中。
  2. 准备眼球的冷冻切片。
    1. 在制备冷冻切片之前，将低温恒温器预冷至约 -28 °C，将样品架预冷至 -26 °C。
    2. 从冷冰箱中取出冷冻标本，并将其放入冻存机中约 1 小时。
    3. 将冷冻标本在冻存机中预冷 10 分钟。用铅笔标记标本，用OCT固定在标本垫上，冷却后一起固定在切片架上。
    4. 调整冷冻标本的位置和方向并固定。首先，切下 20 μm 的切片，直到看到中央角膜。然后，通过连续切片获得 6 μm 切片，并将切片收集在预先准备好的粘附载玻片上。
    5. 在载玻片上标记组织的名称、材料、切片时间、名称和编号。将其在室温 （RT） 下放置约 30 分钟。
    6. 切片晾干后，放入盒子中，放入超低温冰箱中备用。
  3. 进行苏木精和伊红染色。
    1. 从超低温冰箱中取出预先准备好的冷冻切片，放入室温通风橱中晾干。
    2. 在 RT 下使用 4% 多聚甲醛固定切片 15 分钟。用 1x PBS 冲洗标本 5 分钟。
    3. 将含有载玻片的标本切片放在载玻片架上，并在室温下用苏木精染料溶液将它们浸入染料筒中 5 分钟。
    4. 用自来水缓慢冲洗含有载玻片的标本，洗去漂浮的染料，放入含有 0.1% 盐酸醇的染料槽中，1-2 秒后迅速取出。
    5. 用自来水缓慢冲洗标本 15 分钟。
    6. 将标本从水中取出，将载玻片浸入伊红染料罐中;在 RT 下放置 3 分钟。
    7. 用自来水缓慢冲洗标本，洗去多余的染料，并使用 75% 酒精、80% 酒精、95% 酒精、100% 酒精（一种）和 100% 酒精（两种）进行梯度酒精脱水。将每种浓度的切片浸泡 2 分钟。
    8. 使样品分别在二甲苯 （1） 和二甲苯 （2） 中透明 2 分钟。
    9. 在通风橱中擦干样品，使用密封剂密封切片，注意不要产生气泡。
    10. 将载玻片放入 RT 的载玻片盒中。使用显微镜对切片进行成像。
  4. 进行免疫荧光染色。
    1. 取出冷冻切片，将它们放入通风橱中室温的盒子中晾干。
    2. 在冷冻标本的载玻片空白中标记要染色的抗体的名称。
    3. 在 RT 下用 4% 多聚甲醛固定标本 15 分钟。向盒子中加入少量自来水，以防止标本变干。
    4. 去除多聚甲醛固定剂，用 1x PBS 缓冲液洗涤样品 3 次。小心不要冲走标本。
    5. 干燥组织切片周围的液体，用细胞膜溶液 （0.2% TritonX-100） 覆盖标本，并在室温下孵育 20 分钟。
    6. 取出细胞膜溶液，用 1x PBS 缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    7. 干燥组织切片，用免疫荧光封闭溶液 （2% BSA） 覆盖标本，并在 RT 下孵育 1 小时。
    8. 在孵育过程中，按照制造商的说明准备一抗和稀释剂 （1% BSA）。
    9. 去除阻塞液并用抽吸泵干燥标本。加入制备好的一抗，盖上盒子，并在 4 °C 冰箱中避光孵育过夜（孵育约 12-16 小时）。
    10. 弃去一抗，在 PBS 中洗涤标本 4 次，每次 10 分钟。
    11. 在清洁步骤中，按照制造商的说明准备二抗稀释液。
    12. 去除 PBS，干燥样本，然后将制备好的二抗添加到样本中。盖上标本并在 RT 下避光孵育 1 小时。
    13. 取出二抗，用 1x PBS 缓冲液洗涤标本 4 次，每次 10 分钟，然后用 1x PBS 缓冲液覆盖整个玻片。
    14. 去除 PBS，干燥样品，并用含有 DAPI 的封固剂密封切片，确保没有气泡。将载玻片包裹在锡箔中，并保持在 4 °C 避光。
    15. 使用激光共聚焦显微镜系统或正置荧光显微镜相机系统拍摄照片（扫描速度：4 μs/像素，扫描分辨率：1024 x 1024）。
  5. 大鼠角膜上皮的单细胞悬液制备
    1. 安乐死后，用浸泡在 75% 酒精中的镊子取出眼球，并将其放入含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 10% 青霉素 - 链霉素的 1x Hanks' 平衡盐溶液 （HBSS） 中预先制备。
    2. 清洁眼球并使用含有 10% FBS 和 10% 青霉素 - 链霉素的 1x HBBS 两次，每次 5 分钟。
    3. 沿巩膜边缘切除结膜;将巩膜边缘保持在约 1 毫米处。再次，用含有10%FBS和10%青霉素 - 链霉素的1x HBBS洗涤角膜组织两次。
    4. 将干净的角膜组织转移到含有 2U/mL Dispase II 的补充激素表皮培养基 （SHEM） 中。关闭密封并将其在 4°C 下放置 14-16 小时。
    5. 准备好一把镊子、无齿镊子、一个虹膜恢复装置和一个手术消毒器。
    6. 在手术显微镜下，沿角膜边缘轻轻分离角膜上皮。
    7. 用含有 10% 青霉素 - 链霉素的 1x HBSS 洗涤角膜上皮 5 分钟。
    8. 将角膜上皮组织转移到含有 200 mL 胰蛋白酶的 1.5 mL 离心管中，并在 5% CO2、37 °C 培养箱中孵育。每 5 分钟摇动离心管 3 次，将角膜上皮片消化成单细胞悬液。
    9. 加入等量的 SHEM 培养基以停止胰蛋白酶消化溶液的作用，并将其置于 RT 中。
  6. 角膜上皮细胞的克隆培养
    1. 准备滋养层细胞。
      1. 当 NIH 3T3 小鼠细胞的生长密度达到 80-90% 时，丢弃细胞培养基。加入预先制备的 10 mg/mL NIH 3T3 丝裂霉素培养基，并在 37 °C 下孵育 2.5 小时。
      2. 取出培养基，用 1x HBSS 冲洗细胞，用新的 NIH 3T3 细胞培养基替换，并继续在 CO2 培养箱（5% CO2,37°C）中孵育。
    2. 准备角膜上皮细胞悬液并根据所需比例计数细胞。
    3. 在制备角膜上皮细胞悬液时，处理用丝裂霉素处理的 NIH 3T3 细胞。
      1. 弃去上清液，用 1x HBSS 冲洗细胞，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，并在 RT 下孵育 2-3 分钟。
      2. 加入等量的补充激素上皮培养基（SHEM 培养基：DMEM/F12、10 ng/mL 小鼠表皮生长因子 [EGF]、10 μg/mL 胰岛素-转铁蛋白-硒 [ITS]、5% FBS、1% 青霉素-链霉素、0.5% 二甲基亚砜 [DMSO]、0.5 mg/mL 氢化可的松），轻轻移液制成细胞悬液，并对细胞进行计数。
    4. 使用 12 孔板，向每个孔中加入 0.5 mL SHEM 培养基。
    5. 将角膜上皮细胞与 NIH 3T3 细胞混合，密度为 500 个角膜上皮细胞/cm2 和 5 x 105 个 NIH 3T3 细胞/cm2。向每个孔中加入 1 mL SHEM 培养基。
    6. 向每个孔中加入 1 mL 细胞混合物，轻轻移液以均匀分布细胞。
    7. 在培养箱（5% CO 2,37 °C）中孵育，每 2-3 天更换一次培养基。培养 12-14 天。
  7. 结晶紫染色
    1. 大约 12 天后，当角膜上皮克隆即将融合时，去除培养基并向每个孔中加入 1 mL 4% 多聚甲醛溶液，完全覆盖细胞。在 RT 下将细胞固定 15 分钟。
    2. 去除 4% 多聚甲醛，用 1x PBS 洗涤孔 3 次，每次 5 分钟。
    3. 取出 1x PBS 缓冲液，并向每个孔中加入 0.4% 结晶紫染料溶液。在 RT 下染色 30 分钟。
    4. 取出或回收结晶紫染料溶液，并用 1x PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
    5. 在 RT 下风干孔直至彻底干燥。
    6. 使用常规的正置显微镜摄影系统（扫描速度：4 μs/像素，扫描分辨率：1024 x 1024）。
  8. 角膜 mRNA 的提取
    1. 收集眼科剪刀、角膜剪刀、齿形镊子、电动角膜上皮刮刀、Trizol、无 RNase 的 1.5 mL 离心管和一个冰盒。
    2. 上皮获得
      1. 用 4-5% 异氟醚麻醉大鼠，并在宫颈脱位后对其进行安乐死。将动物置于侧卧位。用眼睛剪刀修剪鼠标的胡须，以避免挡住视线。
      2. 将大鼠置于手术显微镜下，并将其调整到适当的高度以聚焦在眼球上。使用带齿的镊子轻轻推动并露出眼球。提起大鼠的结膜，使用干净的电动角膜上皮刮刀刮擦角膜上皮的中央 2 毫米区域。
      3. 用喷洒酒精的干净齿形镊子收集刮过的角膜上皮。将收集的组织放入含有 1 mL Trizol 的离心管中。
      4. 尽快在含有双去离子水的 50 mL 离心管中冲洗收集的组织。用滤纸吸收多余的水。喷洒 75% 酒精，然后进行下一步。
      5. 使用带齿的镊子再次提起大鼠的结膜。使用角膜剪刀，凹面朝上，沿角膜缘剪断结膜，留下约 0.5 毫米的白色结膜。
      6. 使用电动刮刀在角膜缘处刮擦 2 毫米范围内的角膜上皮。如前所述收集组织。从三个眼球中收集中央角膜上皮，从三个眼球中收集角膜缘上皮。
      7. 将收集的组织放入单独的 1 mL Trizol RNA 提取试剂管中。在冰上执行整个作以保持 RNA 完整性。立即进行下一步或将样品储存在 -80 °C 的超低温冰箱中以备后用。
    3. 在冰上解冻标本，使用超声组织匀浆器裂解细胞。将超声波均质器的功率设置为 25%，每次脉冲时间为 2 秒，间隔时间为 5 秒，总时间为 2 分钟。让它在冰上静置 10 分钟。
    4. 向每个样品中加入氯仿（总体积的 1/5，约 200 μL），倒置 30 秒充分混合，然后在 4 °C 下以 400 x g 离心 10 分钟。
    5. RNA 沉淀
      1. 离心后，离心管内的液体分为三部分。顶部透明层是 RNA，中间白色浑浊层是 DNA 和蛋白质，底层是 Trizol。小心地将约 500 μL 的顶部透明层移液到新的 1.5 mL 离心管中，小心不要吸出中间层的白色沉淀物。如果不小心误吸，请重复离心以再次收集透明层。
      2. 在含有透明层的离心管中加入等量的预冷异丙醇，约 500 μL，将试管倒置数次以充分混合，然后立即将其置于 -80 °C 超低温冰箱中 20-30 分钟。此步骤旨在加速 RNA 的沉淀。
    6. 取出样品，立即在 4 °C 下以 400 x g 离心 10 分钟。 在离心管底部看到少量白色片状沉淀物;弃去上清液。
    7. 向每个试管中加入预先制备并冰冷的 70% 乙醇。立即在 4 °C 下在 400 x g 的冷冻离心机中离心约 10 分钟;重复上述步骤一次，彻底清洗沉淀物。在此步骤中，用紫外线对通风橱进行预灭菌 15 分钟。
    8. 取出离心管并弃去上清液后，再次在 4 °C 下以约 250 x g 的速度离心 2 分钟。使用 200 μL 移液器吸头从沉淀物对面的一侧小心吸出多余的酒精，并尽可能彻底干燥。置于预紫外线消毒的通风橱中干燥，将沉淀物风干约 15 分钟。
    9. 将 1 mL RNase 抑制剂添加到 40 mL 焦碳酸二乙酯 （DEPC） 水中，制备溶液。加入适量的 DEPC 水/RNase 抑制剂混合物，约 20-30 μL，以溶解样品。如果沉淀物很多，则添加 30-50 μL。立即进行逆转录 PCR。
  9. 逆转录 PCR
    1. 确保提供以下物品：PCR 机、不含 RNase 的 1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR 管、冰浴或冰盒、移液器和不含 RNase 的吸头。
    2. 使用超微量分光光度计测量 RNA 浓度。对于每个样品，确保向反应系统中加入 1 μg RNA。
    3. 逆转录系统的总体积为 20 μL。根据样品数量计算所需的试剂总量。根据说明中指定的比例混合。
    4. 在冰上准备反应系统，涡旋，然后短暂离心。在 42 °C 下孵育 15 分钟，在 90 °C 下孵育 30 秒。
    5. 将从逆转录过程中获得的 cDNA 直接用于实时定量 PCR 分析，或储存在 -80 °C 冰箱中。
  10. 实时定量 PCR 反应
    1. 将实时荧光定量 PCR 试剂盒17 与 10 μL 反应系统配合使用。使用 表 1 中所示的引物序列。
    2. 将上述反应系统加入专门用于 RT-PCR 的 96 孔板或 8 联管中。确保样品充分混合。在将试管放在 PCR 机上之前，请检查试管中是否有气泡。
    3. 使用 PCR 循环 （95 °C 5 分钟）、40 个循环 （95 °C 10 秒，60 °C 30 秒） 扩增基因，并完成数据以计算 2-ΔΔ Ct 值。使用适当的数据分析软件处理、分析和绘制数据。

结果

如图 1A 所示，通过裂隙灯观察，我们发现角膜上皮的愈合受损。正常情况下，角膜中央上皮会在切除后 24-48 h 内完全愈合，但在角膜中央上皮切除结合缝合模型中，新血管继续存在。在模型建立后的第 3 天，观察到明显的角膜角膜缘水肿和新生血管形成，局部出现角膜角膜缘干细胞缺乏的典型体征。随着时间的推移，到第 7 天，愈合仍然没...

讨论

炎症在角膜缘干细胞缺陷症的发展中起着关键作用18，但其具体机制和影响需要进一步探索。为了解决这个问题，我们通过刮擦中央角膜上皮并缝合中央角膜基质来诱导 LSCD 以引起严重的角膜炎症。我们在建模后第 1 天、第 3 天和第 7 天观察了角膜炎症的演变和角膜缘干细胞的状态。造模后第 3 天，观察到大鼠角膜缘明显水肿、明显新生血管形成和局部?...

披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

本研究得到了贵州省科技专项 （QKHJC-ZK[2024]ZD043）、福建省杰出青年科学基金 （2023J06053 [to S.O]）;中国自然科学基金 （No.82101084 [to S.O.] 和国家留学基金委 （CSC， 202306310049 [to Y.W.]）。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
10-0 suture lineAlcon, Inc., USA8065698001
2 mm corneal trephineSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, 1 mL pipette gun heads, cell culture plate culture plates, centrifuge tubesGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chinahttps://www.jetbiofil.com/index.html
-20/-80 °C fridgeQingdao Haier Company, Chinahttps://www.haier.com/cn/
A 10-mL syringe Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chinahttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Adhere to the slideShiTai Company188105
Amylene alcoholShanghai. Macklin Biochemical, Chinahttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, United Kingdomab76318
Anti-Keratin 12 antibody EPR17882Abcam, United Kingdomab185627
Anti-PAX6 antibodyAbcam, United Kingdomab195045
Anti-stripping slides, cover slipsJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd., Chinahttps://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, Japanhttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Chinahttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
CO2 Oven incubator, ultrasonic crusher, centrifugeThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Confocal microscopeShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chinahttps://www.clinx.cn/about
Corneal epithelial forcepsSuzhou XVI Vision Company, China53418D
DAPIVector. Inc., USAH-1000
DEPC water Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
Dicuro eye cream (ofloxacin eye cream)Santian Pharmaceutical Corporation, Japanhttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, culture medium, double antibody, and PBSThermo Fisher Scientific, Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, United Kingdom MCA341GA
Electronic balanceShanghai Ohaus Biotechnology Company, Chinahttp://shbio.com/company
Enclosure of the membraneParafilm, Inc., USAhttps://www.sigmaaldrich.cn
Fluorescein sodium test strip was used in ophthalmologyTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinahttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Fluorescent inverted phase-contrast micrographic systemTE-2000U, Nikon, Japanhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Frozen table-top centrifugeEppendorf, Germanyhttps://www.eppendorf.sh.cn 
Glass sheet frameXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://www.tagene.net/
H-1200 with DAPI sealagentXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Chinahttps://www.bosonbio.com.cn/
HE staining kitAuragene, Chinahttp://jushengwu.com/a048/
Hematoxylin-eosin dye solution kitAURAGEN, United StatesP032IH
High and low precision electronic balanceSdolis, Germanyhttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinahttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67 antibodyAbcam, United Kingdomab16667
liquid nitrogenXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chinahttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Microhand holderSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Multiformaldehyde powderSigm, Americahttps://www.sigmaaldrich.cn
Normal temperature centrifuge 46Eppendorf, Germanyhttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China4583
Ordinary biological micrographic systemEclipse 50i, Nikon, Japanhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChinaSH30256.01
PCR, and the reactor apparatusBiometra Thermocycler, Germanyhttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipettes of various specificationsEppendorf Company, Germanyhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers for Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaine hydrochloride 0.5% eye dropsAlcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Rat PMN antibodyFitzgerald, United States20R-PR020
Real time fluorescence quantitative PCRApplied Biosystems, United Stateshttps://www.thermofisher.cn
Reverse transcription kitTAKARA, Japanhttps://www.takarabiomed.com.cn/
Slit lampTOPCON, Japanhttps://topconchina.cn/
Smooth forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://chuangdianbio.com/
Superclean benchNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singaporehttps://www.hi-p.com/
Toothed forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Toppicamide eye drops (Medol)Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Trace nucleic acid protein concentration testerThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen The United Stateshttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, with a surgical microscopeCarl ZEIS, Germanyhttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html

参考文献

  1. Ang, L. P., Tan, D. T. Ocular surface stem cells and disease: Current concepts and clinical applications. Ann Acad Med Singap. 33 (5), 576-580 (2004).
  2. Mao, Y., et al. Downregulation of p38 MAPK signaling pathway ameliorates tissue-engineered corneal epithelium. Tissue Eng Part A. 28 (23-24), 977-989 (2022).
  3. Sprogyte, L., Park, M., Di Girolamo, N. Pathogenesis of alkali injury-induced limbal stem cell deficiency: A literature survey of animal models. Cells. 12 (9), 1294 (2023).
  4. He, X., et al. Lacrimal gland microenvironment changes after obstruction of lacrimal gland ducts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (3), 15 (2022).
  5. Le, Q., Chauhan, T., Deng, S. X. Diagnostic criteria for limbal stem cell deficiency before surgical intervention- A systematic literature review and analysis. Surv Ophthalmol. 65 (1), 32-40 (2020).
  6. Li, W., Hayashida, Y., Chen, Y. T., Tseng, S. C. Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus. Cell Res. 17 (1), 26-36 (2007).
  7. Ou, S. K., et al. The role of ectodysplasin a on the ocular surface homeostasis. Int J Mol Sci. 23 (24), 12 (2022).
  8. Lin, S., et al. Limbal stem cell dysfunction induced by severe dry eye via activation of the p38 MAPK signaling pathway. Am J Pathol. 193 (11), 1863-1878 (2023).
  9. Jiang, G. J., Li, B. B., Fan, T. J. Timolol induces necroptosis, apoptosis and senescence concentration-dependently in rabbit limbal stem cells in vitro. Life Sci. 277, 119453 (2021).
  10. Castro-Munozledo, F. Review: Corneal epithelial stem cells, their niche and wound healing. Mol Vis. 19, 1600-1613 (2013).
  11. Atalay, E., et al. Animal models for limbal stem cell deficiency: A critical narrative literature review. Ophthalmol Ther. 13 (3), 671-696 (2024).
  12. Delic, N. C., Cai, J. R., Watson, S. L., Downie, L. E., Di Girolamo, N. Evaluating the clinical translational relevance of animal models for limbal stem cell deficiency: A systematic review. Ocul Surf. 23, 169-183 (2022).
  13. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  14. Ye, J., et al. Biomimetic nanocomplex based corneal neovascularization theranostics. J Control Release. 374, 50-60 (2024).
  15. Zhu, H. M., et al. A synergistic therapy with antioxidant and anti-VEGF: Toward its safe and effective elimination for corneal neovascularization. Adv Healthc Mater. 13 (5), 10 (2024).
  16. Yu, J. W., et al. In vivo assembly drug delivery strategy based on ultra-small nanoparticles: Toward high drug permeation and accumulation for CNV treatment. Chem Eng J. 450, 137968 (2022).
  17. Wu, H., et al. A SU6668 pure nanoparticle-based eyedrops: Toward its high drug accumulation and long-time treatment for corneal neovascularization. J Nanobiotechnol. 22 (1), 290 (2024).
  18. Long, Q., et al. A novel tissue-engineered corneal epithelium based on ultra-thin amniotic membrane and mesenchymal stem cells. Sci Rep. 14 (1), 17407 (2024).
  19. Giroux, V., Rustgi, A. K. Metaplasia: Tissue injury adaptation and a precursor to the dysplasia-cancer sequence. Nat Rev Cancer. 17 (10), 594-604 (2017).
  20. Herfs, M., Hubert, P., Delvenne, P. Epithelial metaplasia: Adult stem cell reprogramming and (pre)neoplastic transformation mediated by inflammation. Trends Mol Med. 15 (6), 245-253 (2009).
  21. Slack, J. M. Metaplasia and transdifferentiation: From pure biology to the clinic. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 369-378 (2007).
  22. Slack, J. M., Tosh, D. Transdifferentiation and metaplasia--switching cell types. Curr Opin Genet Dev. 11 (5), 581-586 (2001).
  23. Wang, S., et al. Impact of chronic smoking on meibomian gland dysfunction. PLoS One. 11 (12), e0168763 (2016).
  24. Wu, Y., et al. Evolution of therapeutic strategy based on oxidant-antioxidant balance for fuchs endothelial corneal dystrophy. Ocul Surf. 34, 247-261 (2024).
  25. Li, Y., et al. Meibomian gland alteration in patients with systemic lupus erythematosus. Lupus. 31 (4), 407-414 (2022).
  26. Zhang, Y., et al. Histopathology-based diagnosis of Mooren's ulcer concealed beneath the pterygium on eye. J Histotechnol. 45 (4), 195-201 (2022).
  27. Tseng, S. C., Hatchell, D., Tierney, N., Huang, A. J., Sun, T. T. Expression of specific keratin markers by rabbit corneal, conjunctival, and esophageal epithelia during vitamin A deficiency. J Cell Biol. 99 (6), 2279-2286 (1984).
  28. Espana, E. M., et al. Characterization of corneal pannus removed from patients with total limbal stem cell deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9), 2961-2966 (2004).
  29. Li, W., et al. Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (1), 154-162 (2008).
  30. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Exp Eye Res. 161, 101-105 (2017).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

213 Sprague Dawley

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。