Etablissement d’un modèle d’inflammation cornéenne sévère chez le rat basé sur le curetage de l’épithélium cornéen combiné à des sutures cornéennes

Résumé

Nous avons développé un modèle chez le rat d’inflammation cornéenne sévère par curetage de l’épithélium cornéen combiné à des sutures cornéennes. L’étude a évalué les modèles d’inflammation cornéenne, la prolifération épithéliale et les changements dans les cellules souches limbiques dans des conditions inflammatoires.

Résumé

L’inflammation cornéenne, en particulier l’inflammation cornéenne sévère, joue un rôle important dans le développement du dysfonctionnement des cellules souches limbiques cornéennes. La construction de modèles animaux appropriés peut nous aider à nous concentrer sur les effets d’une inflammation sévère sur les cellules souches cornéennes et limbiques. Un décapant de 2 mm a été utilisé pour enlever l’épithélium cornéen central des rats Sprague Dawley (SD) afin de créer une blessure. Ensuite, le stroma central de la cornée a été suturé avec des sutures en nylon pour induire une inflammation persistante. De cette façon, un modèle d’inflammation cornéenne avec abrasion de l’épithélium cornéen central et suture du stroma central a été construit, ce qui a induit une inflammation cornéenne sévère. Les changements dans l’inflammation cornéenne et l’état des cellules souches limbiques à 1, 3 et 7 jours après la modélisation ont été observés. Le 3ème^{jour après} la modélisation, le limbe cornéen du rat était sévèrement œdémateux, avec une néovascularisation évidente et une hyperplasie locale, qui sont des signes typiques d’une déficience en cellules souches limbiques. Au 7^e jour, l’œdème cornéen s’est progressivement aggravé et la néovascularisation a continué à augmenter. Grâce à la réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse (RT-qPCR) et à la coloration par immunofluorescence, nous avons constaté que les facteurs inflammatoires de l’épithélium cornéen étaient significativement régulés à la hausse, que la différenciation de l’épithélium cornéen était anormale, que les cellules souches de l’épithélium cornéen étaient significativement réduites et que la prolifération cellulaire et la souche avaient également diminué. Par conséquent, ce modèle démontre qu’une inflammation sévère peut induire des dommages aux cellules souches limbiques sans endommager directement les cellules souches limbiques. Le modèle est bénéfique pour observer les effets de l’inflammation sévère sur les mécanismes biologiques des cellules souches et fournit une plate-forme idéale pour étudier les mécanismes du dysfonctionnement des cellules souches épithéliales cornéennes induit par l’inflammation.

Introduction

Le dysfonctionnement des cellules souches limbiques (LSCD) est caractérisé par des défauts épithéliaux persistants, une vascularisation cornéenne, une inflammation chronique, une cicatrisation et une conjonctivalisation de la cornée ^1,2. Il peut résulter de l’épuisement ou du dysfonctionnement des cellules souches limbiques après de graves maladies de la surface oculaire, telles que des brûlures chimiques, des brûlures thermiques, le syndrome de Stevens-Johnson et des lésions iatrogènes causées par des chirurgies oculaires ^2,3,4

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Protocole

Toutes les procédures étaient conformes aux directives de l’ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale du Guizhou (approbation n° 2305192). Les rats ont été hébergés au Centre animalier de l’Université de médecine du Guizhou, dans le respect des réglementations pertinentes en matière de gestion des animaux.

1. Sélection des animaux

1. Utiliser des rats Sprague-Dawley (SD) femelles âgés de 7 à 8 semaines. Assurez-vous qu’il n’y a pas de lésions de la surface oculaire lors ....

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Résultats

Comme le montre la figure 1A, grâce à l’observation avec une lampe à fente, nous avons constaté que la cicatrisation de l’épithélium cornéen était altérée. Dans des circonstances normales, l’épithélium cornéen central guérirait complètement dans les 24 à 48 heures suivant l’ablation, mais dans l’excision de l’épithélium central cornéen combinée à un modèle de suture, de nouveaux vaisseaux sanguins ont continué à exister. L.......

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Discussion

L’inflammation joue un rôle clé dans le développement de la déficience en cellules souches limbiques¹⁸, mais ses mécanismes et effets spécifiques nécessitent une exploration plus approfondie. Pour résoudre ce problème, nous avons induit le LSCD en grattant l’épithélium cornéen central et en suturant le stroma cornéen central pour provoquer une inflammation cornéenne sévère. Nous avons observé l’évolution de l’inflammation cornéenne et l?.......

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 suture line	Alcon, Inc., USA	8065698001
2 mm corneal trephine	Suzhou XVI Vision Company, China	http://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, 1 mL pipette gun heads, cell culture plate culture plates, centrifuge tubes	Guangzhou Jiete Biological Co., Ltd., China	https://www.jetbiofil.com/index.html
-20/-80 °C fridge	Qingdao Haier Company, China	https://www.haier.com/cn/
A 10-mL syringe	Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., China	https://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Adhere to the slide	ShiTai Company	188105
Amylene alcohol	Shanghai. Macklin Biochemical, China	http://www.macklin.cn/products/
Anti-Cytokertin	Abcam, United Kingdom	ab76318
Anti-Keratin 12 antibody EPR17882	Abcam, United Kingdom	ab185627
Anti-PAX6 antibody	Abcam, United Kingdom	ab195045
Anti-stripping slides, cover slips	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd., China	https://cn.citotest.com/
Autoclave	Hirayama, Japan	https://hirayama.com.cn/about/
Avertin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology, China	https://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
Chloroform	Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., China	https://www.siobp.com/web
CO2 Oven incubator, ultrasonic crusher, centrifuge	Thermo Fisher Technologies Inc., USA	https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Confocal microscope	Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., China	https://www.clinx.cn/about
Corneal epithelial forceps	Suzhou XVI Vision Company, China	53418D
DAPI	Vector. Inc., USA	H-1000
DEPC water	Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., China	https://www.siobp.com/web
Dicuro eye cream (ofloxacin eye cream)	Santian Pharmaceutical Corporation, Japan	https://www.santen.com/asia
D-KSFM, culture medium, double antibody, and PBS	Thermo Fisher Scientific, Inc., USA	https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1	AbD Serote c, United Kingdom	MCA341GA
Electronic balance	Shanghai Ohaus Biotechnology Company, China	http://shbio.com/company
Enclosure of the membrane	Parafilm, Inc., USA	https://www.sigmaaldrich.cn
Fluorescein sodium test strip was used in ophthalmology	Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., China	https://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Fluorescent inverted phase-contrast micrographic system	TE-2000U, Nikon, Japan	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Frozen table-top centrifuge	Eppendorf, Germany	https://www.eppendorf.sh.cn
Glass sheet frame	Xiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., China	http://www.tagene.net/
H-1200 with DAPI sealagent	Xiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., China	https://www.bosonbio.com.cn/
HE staining kit	Auragene, China	http://jushengwu.com/a048/
Hematoxylin-eosin dye solution kit	AURAGEN, United States	P032IH
High and low precision electronic balance	Sdolis, Germany	https://www.solisinverters.com/global
Isopropanol	Shanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., China	https://en.reagent.com.cn/
Ki-67 antibody	Abcam, United Kingdom	ab16667
liquid nitrogen	Xiamen Yidong Gas Co., Ltd., China	https://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Microhand holder	Suzhou XVI Vision Company, China	http://www.66vision.com/
Multiformaldehyde powder	Sigm, America	https://www.sigmaaldrich.cn
Normal temperature centrifuge 46	Eppendorf, Germany	https://www.thermofisher.cn
OCT	Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China	4583
Ordinary biological micrographic system	Eclipse 50i, Nikon, Japan	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBS	Shanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, China	SH30256.01
PCR, and the reactor apparatus	Biometra Thermocycler, Germany	https://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipettes of various specifications	Eppendorf Company, Germany	https://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers for Rt-PCR	Shanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaine hydrochloride 0.5% eye drops	Alcon, Inc., USA	https://www.alcon.com/about-us
Rat PMN antibody	Fitzgerald, United States	20R-PR020
Real time fluorescence quantitative PCR	Applied Biosystems, United States	https://www.thermofisher.cn
Reverse transcription kit	TAKARA, Japan	https://www.takarabiomed.com.cn/
Slit lamp	TOPCON, Japan	https://topconchina.cn/
Smooth forceps	Suzhou XVI Vision Company, China	http://www.66vision.com/
Specimen-box	Lambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., China	http://chuangdianbio.com/
Superclean bench	New Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singapore	https://www.hi-p.com/
Toothed forceps	Suzhou XVI Vision Company, China	http://www.66vision.com/
Toppicamide eye drops (Medol)	Alcon, Inc., USA	https://www.alcon.com/about-us
Trace nucleic acid protein concentration tester	Thermo Fisher Technologies Inc., USA	https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Trizol	Invitrogen The United States	https://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, with a surgical microscope	Carl ZEIS, Germany	https://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html