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Resumen

Desarrollamos un modelo de rata de inflamación corneal severa a través de legrado de epitelio corneal combinado con suturas corneales. El estudio evaluó los patrones de inflamación de la córnea, la proliferación epitelial y los cambios en las células madre limbales en condiciones inflamatorias.

Resumen

La inflamación de la córnea, especialmente la inflamación grave de la córnea, desempeña un papel importante en el desarrollo de la disfunción de las células madre del limbo corneal. La construcción de modelos animales apropiados puede ayudarnos a centrarnos en los efectos de la inflamación grave en las células madre del limbo corneal. Se utilizó un removedor de óxido de 2 mm para eliminar el epitelio corneal central de las ratas Sprague Dawley (SD) para crear una lesión. Luego, el estroma central de la córnea se suturó con suturas de nailon para inducir una inflamación persistente. De esta manera, se construyó un modelo de inflamación corneal con abrasión del epitelio corneal central y sutura del estroma central, que indujo una inflamación corneal severa. Se observaron los cambios en la inflamación de la córnea y el estado de las células madre limbales a los 1, 3 y 7 días después del modelado. Altercer día después del modelado, el limbo corneal de las ratas estaba severamente edematoso, con neovascularización evidente e hiperplasia local, que son signos típicos de deficiencia de células madre limbales. Al7º día, el edema corneal empeoró gradualmente y la neovascularización continuó aumentando. A través de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-qPCR) y la tinción con inmunofluorescencia, encontramos que los factores inflamatorios del epitelio corneal estaban significativamente regulados, la diferenciación del epitelio corneal era anormal, las células madre del epitelio corneal estaban significativamente reducidas y la proliferación celular y la talla también habían disminuido. Por lo tanto, este modelo demuestra que la inflamación severa puede inducir daño a las células madre limbales sin dañar directamente las células madre limbales. El modelo es beneficioso para observar los efectos de la inflamación grave en los mecanismos biológicos de las células madre y proporciona una plataforma ideal para estudiar los mecanismos de la disfunción de las células madre epiteliales de la córnea inducida por la inflamación.

Introducción

La disfunción de las células madre limbales (LSCD) se caracteriza por defectos epiteliales persistentes, vascularización corneal, inflamación crónica, cicatrización y conjuntivalización de la córnea 1,2. Puede surgir del agotamiento o disfunción de las células madre limbales después de enfermedades graves de la superficie ocular, como quemaduras químicas, quemaduras térmicas, síndrome de Stevens-Johnson y lesiones iatrogénicas causadas por cirugías oculares 2,3,4. Los mecanismos patogénicos de la LSCD involucran principalmente alteraciones en las células madre y alteraciones en el microambiente de las células madre 5,6, lo que afecta la homeostasis del epitelio corneal 2,7. Hay dos tipos principales de cambios de destino en las células madre limbales en LSCD: 1) El potencial de diferenciación direccional de las células madre epiteliales de la córnea se vuelve anormal, lo que lleva a su diferenciación en células epiteliales de la piel. Esto se evidencia por una disminución en la expresión del factor de transcripción específico de células epiteliales corneales Pax6 y las queratinas específicas de la córnea Krt12 y Krt3, junto con un aumento significativo en la expresión de los marcadores de metaplasia epitelial escamosa relacionados con la piel Krt10, Krt1 y Sprr1b8; 2) La lesión de la superficie ocular destruye directamente las células madre del limbo corneal, lo que resulta en necrosis o apoptosis y, posteriormente, provoca la proliferación de tejido conjuntival que cubre la córnea9. Se ha informado que durante el desarrollo de LSCD, las células inflamatorias como los macrófagos, los neutrófilos y las células dendríticas aumentan significativamente en el microambiente de las células madre epiteliales de la córnea. En consecuencia, citocinas como el interferón-gamma (IFN)-γ, el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, la interleucina (IL)-1β y las proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP)-1α/β también muestran elevaciones significativas10.

Se han establecido varios modelos de LSCD, incluyendo aquellos inducidos por suturas, lesiones químicas y manchas de cloruro de benzalconio11. Cada uno de estos modelos tiene sus ventajas y desventajas. Las lesiones químicas pueden dañar toda la superficie ocular y destruir directamente las células madre limbales12. El cloruro de benzalconio funciona de manera similar a las lesiones químicas, pero tiene un efecto relativamente lento13. El modelo de sutura corneal puede inducir una respuesta inflamatoria estable y a largo plazo, pero la reacción inflamatoria es relativamente leve y no puede causar LSCD.

Para investigar el papel y los mecanismos de la inflamación en el desarrollo de la LSCD corneal, se estableció un modelo animal que combina el legrado del epitelio corneal central con suturas corneales. Este modelo induce una inflamación persistente del epitelio corneal sin dañar directamente las células madre limbales.

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Protocolo

Todos los procedimientos se ajustaron a las directrices de ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Guizhou (Aprobación Nº 2305192). Las ratas se alojaron en el Centro de Animales de la Universidad Médica de Guizhou, cumpliendo con las normas de manejo de animales pertinentes.

1. Selección de animales

  1. Utilice ratas hembras Sprague-Dawley (SD) de 7-8 semanas de edad. Asegúrese de que no haya lesiones en la superficie ocular bajo el examen con lámpara de hendidura.
  2. Esterilice los instrumentos con un esterilizador rápido. Los instrumentos necesarios incluyen removedor de anillos de óxido corneal, marcador de muestreo de piel de 2 mm de tamaño, portaagujas, cuchillos para capas de placas, tijeras quirúrgicas oftálmicas y fórceps.
  3. Anestesiar ratas con tribromoetanol al 1,25% mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 0,3 mL por 100 g de peso corporal. Evalúe la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en los dedos de los pies. Instilar una gota de colirio de tropicamida para la dilatación de la pupila. Aplique gotas oftálmicas de clorhidrato de bupivacaína en el ojo. Use un ungüento lubricante ocular en el ojo contralateral para mantener la humedad.
  4. Desinfecte la piel y el vello alrededor de los ojos con yodóforo.
  5. Establecer el modelo de inflamación.
    1. Coloca a la rata en la posición de decúbito lateral. Exponga el globo ocular bajo un microscopio quirúrgico.
    2. La córnea central se marcó con un marcador de muestreo de piel de 2 mm de tamaño, y el epitelio corneal central marcado se raspó con un removedor de anillos de óxido corneal.
    3. Colocar tres suturas corneales de 120° con alambre de nylon 10-0, portaagujas y tijeras y pinzas quirúrgicas oftálmicas a unos 3 mm del limbo, no penetrar en la córnea 14,15.
  6. Aplique el ungüento ofláctico para los ojos al final del procedimiento para prevenir la infección.
  7. Observe y fotografíe la córnea en el1º,3º y7º día después de la operación utilizando una lente de 10x ampliada con lámpara de hendidura. Registre los síntomas, como la cicatrización del epitelio corneal, la hiperemia conjuntival, el edema corneal, la hiperemia limbal y la neovascularización corneal.

2. Cálculo del índice inflamatorio

  1. Calcular el índice inflamatorio de la superficie ocular después de establecer el modelo animal.
    1. Puntúe la congestión del cuerpo ciliar de la siguiente manera: sin congestión (0 puntos); la presencia de congestión inferior a 1 mm (1 punto); hiperemia entre 1 mm y 2 mm (2 puntos); Hiperemia entre 1 mm y 2 mm (3 puntos).
    2. Puntúe el edema corneal central de la siguiente manera: sin edema (0 puntos); edema con clara visibilidad del iris (1 punto); edema con visibilidad incierta del iris (2 puntos); Edema con el iris no visible (3 puntos).
    3. Puntúe el edema corneal paracentral de la siguiente manera: sin edema (0 puntos); edema con clara visibilidad del iris (1 punto); edema con visibilidad incierta del iris (2 puntos); Edema con el iris no visible (3 puntos).
    4. Calcula el índice de inflamación sumando todas las puntuaciones y dividiéndolo por 9.

3. Valoración de la neovascularización corneal

  1. Observe la neovascularización de la córnea con una lámpara de hendidura.
    1. Analice y procese imágenes utilizando software de procesamiento de imágenes con lámpara de hendidura16.
    2. Registre el crecimiento de la neovascularización corneal en cada punto de tiempo de observación, midiendo la neovascularización corneal más larga hacia la córnea central con una curvatura mínima.
    3. Califique de la siguiente manera: Grado 0: Avascular; Grado 1: Micro (<1 mm); Grado 2: Leve (1 mm a 1,5 mm); Grado 3: Moderado (>1,5 mm a 2 mm); Grado 4: Severo (>2 mm).

4. Análisis de la biología del modelo

  1. Prepara muestras de ojos congeladas.
    1. Anestesiar a la rata con isoflurano al 4-5% y sacrificarla mediante luxación cervical.
    2. En la posición de decúbito lateral, levante el globo ocular de la rata hacia afuera con micropinzas y corte la conjuntiva a lo largo de la cúpula ocular superior e inferior con unas tijeras.
    3. Cortar el nervio óptico, prestando atención a mantener la integridad del epitelio corneal.
    4. Seque las manchas de sangre y el agua en la superficie del globo ocular con papel de filtro y colóquelas en la caja de inclusión con medio de inclusión de temperatura de corte óptima (OCT).
    5. Retire las burbujas de la caja de inclusión con una pipeta de 200 μL, congélela con nitrógeno líquido y, a continuación, guarde las muestras incrustadas en el frigorífico de temperatura ultrabaja.
  2. Prepara secciones congeladas de los globos oculares.
    1. Antes de preparar la sección congelada, preenfríe el criostato a unos -28 °C y el portamuestras a -26 °C.
    2. Retire las muestras congeladas del congelador frío y colóquelas en el criotomo durante aproximadamente 1 h.
    3. Preenfríe la muestra congelada en un criotomo durante 10 min. Marque el espécimen con un lápiz, fíjelo en la almohadilla de muestras con OCT y fíjelos juntos en la rejilla de sección después de enfriar.
    4. Ajuste la posición y la dirección de la muestra congelada y fíjela. Primero, corte secciones de 20 μm hasta ver la córnea central. A continuación, obtenga secciones de 6 μm mediante un corte continuo y recoja las secciones en los portaobjetos de adherencia preparados previamente.
    5. Marque el nombre, el material, el tiempo de la sección, el nombre y el número del tejido en el portaobjetos. Colócalo a temperatura ambiente (RT) durante unos 30 min.
    6. Después de secar las secciones, colóquelas en una caja y guárdelas en el refrigerador de temperatura ultrabaja para reservar.
  3. Realizar la tinción con hematoxilina y eosina.
    1. Retire las secciones congeladas preparadas previamente del refrigerador de temperatura ultrabaja y colóquelas en la campana extractora en RT para que se sequen.
    2. Fije las secciones con paraformaldehído al 4% durante 15 min en RT. Enjuague las muestras con 1x PBS durante 5 min.
    3. Coloque las secciones de muestra que contienen portaobjetos en un soporte para portaobjetos y sumérjalas en el cilindro de tinte con solución de colorante de hematoxilina a RT durante 5 min.
    4. Enjuague lentamente la muestra que contiene portaobjetos con agua del grifo para lavar el tinte flotante, colóquelos en el tanque de tinte con alcohol de ácido clorhídrico al 0,1% y retírelos rápidamente después de 1-2 s.
    5. Enjuague lentamente la muestra con agua del grifo durante 15 minutos.
    6. Retire la muestra del agua y sumerja los portaobjetos en el tanque de tinte de eosina; dejar en RT durante 3 min.
    7. Enjuague lentamente la muestra con agua del grifo, lave el exceso de tinte y realice la deshidratación con alcohol de gradiente con 75 % de alcohol, 80 % de alcohol, 95 % de alcohol, 100 % de alcohol (uno) y 100 % de alcohol (dos). Mmsere las secciones en cada concentración durante 2 min.
    8. Hacer las muestras transparentes durante 2 min en xileno (1) y xileno (2) respectivamente.
    9. Seque la muestra en la campana extractora, selle las secciones con un agente sellador y tenga cuidado de no producir burbujas.
    10. Coloque las diapositivas en una caja de diapositivas en RT. Tome imágenes de las secciones con un microscopio.
  4. Realizar tinción de inmunofluorescencia.
    1. Retire las secciones congeladas y colóquelas en una caja en RT en la campana extractora para que se sequen.
    2. Marque el nombre del anticuerpo que se va a teñir en el portaobjetos de vidrio en blanco de la muestra congelada.
    3. Fije las muestras con paraformaldehído al 4% en RT durante 15 min. Se añadió una pequeña cantidad de agua del grifo a la caja para evitar que el espécimen se secara.
    4. Retire el fijador de paraformaldehído y lave la muestra tres veces con 1x tampón PBS. Tenga cuidado de no enjuagar la muestra.
    5. Seque el líquido alrededor de la sección de tejido, cubra la muestra con una solución de membrana celular (TritonX-100 al 0,2%) e incube a RT durante 20 minutos.
    6. Retire la solución de membrana celular y lave las secciones tres veces durante 5 minutos cada una con 1x tampón PBS.
    7. Secar las secciones de tejido, cubrir la muestra con una solución bloqueadora de inmunofluorescencia (BSA al 2%) e incubar en RT durante 1 h.
    8. Prepare el anticuerpo primario y el diluyente (1% BSA) durante la incubación según las instrucciones del fabricante.
    9. Retire el líquido de bloqueo y seque la muestra con una bomba de succión. Añadir el anticuerpo primario preparado, tapar la caja e incubar en un frigorífico a 4 °C durante la noche (incubar durante unas 12-16 h) protegido de la luz.
    10. Deseche el anticuerpo primario y lave la muestra cuatro veces durante 10 minutos cada una en PBS.
    11. Durante el paso de limpieza, prepare la dilución secundaria del anticuerpo según las instrucciones del fabricante.
    12. Retire el PBS, seque la muestra y agregue el anticuerpo secundario preparado a la muestra. Cubra el espécimen e incube a RT durante 1 h lejos de la luz.
    13. Retire el anticuerpo secundario, lave la muestra 4 veces con 1 tampón PBS durante 10 minutos cada una y cubra todo el portaobjetos con 1 tampón PBS.
    14. Retire el PBS, seque la muestra y selle las secciones con un medio de montaje que contenga DAPI, asegurándose de que no haya burbujas de aire. Envuelva los portaobjetos en papel de aluminio y manténgalos a 4 °C alejados de la luz.
    15. Tome fotos con un sistema de microscopio confocal láser o con un sistema de cámara de microscopio de fluorescencia vertical (velocidad de escaneo: 4 μs/píxel, resolución de escaneo: 1024 x 1024).
  5. Preparación en suspensión unicelular del epitelio corneal de rata
    1. Después de la eutanasia, retire los globos oculares con pinzas empapadas en alcohol al 75% y colóquelos en la solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks 1x que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 10% de penicilina-estreptomicina preparada de antemano.
    2. Limpie los globos oculares y use 1x HBBS que contenga 10% de FBS y 10% de penicilina-estreptomicina dos veces durante 5 minutos cada una.
    3. Extirpar la conjuntiva a lo largo del margen escleral; Deje el margen escleral en aproximadamente 1 mm. Nuevamente, lave el tejido corneal dos veces con 1x HBBS que contenga 10% de FBS y 10% de penicilina-estreptomicina.
    4. Transfiera el tejido corneal limpio a un medio epidérmico hormonal suplementado (SHEM) que contenga 2U/mL de Dispasa II. Cierre el precinto y colóquelo a 4°C durante 14-16 h.
    5. Tenga a mano un par de pinzas, pinzas desdentadas, un dispositivo de recuperación del iris y un esterilizador quirúrgico.
    6. Bajo un microscopio quirúrgico, separe suavemente el epitelio corneal a lo largo del borde de la córnea.
    7. Lave el epitelio corneal con 1x HBSS que contenga un 10% de penicilina-estreptomicina durante 5 min.
    8. Transfiera el tejido epitelial corneal a un tubo de centrífuga de 1,5 mL que contenga 200 mL de tripsina e incube en una incubadora de 5% de CO2, 37 °C. Cada 5 minutos, agite el tubo de centrífuga tres veces para digerir la lámina epitelial de la córnea en una suspensión unicelular.
    9. Agregue una cantidad igual de medio SHEM para detener la acción de la solución de digestión de tripsina y colóquela en RT.
  6. Cultivo de clones de células epiteliales corneales
    1. Preparar las células del trofoblasto.
      1. Cuando la densidad de crecimiento de las células de ratón NIH 3T3 alcance el 80-90%, deseche el medio de cultivo celular. Añadir 10 mg/ml de medio de cultivo de mitomicina NIH 3T3 preparado previamente e incubar a 37 °C durante 2,5 h.
      2. Retire el medio, enjuague las células con 1x HBSS, reemplácelas con un nuevo medio celular NIH 3T3 y continúe la incubación en una incubadora de CO2 (5% de CO2, 37 °C).
    2. Prepare la suspensión de células epiteliales corneales y cuente las células de acuerdo con la proporción requerida.
    3. Mientras prepara la suspensión de células epiteliales de la córnea, procese las células NIH 3T3 tratadas con mitomicina.
      1. Deseche el sobrenadante, enjuague las células con 1x HBSS, agregue 1 mL de solución de tripsina-EDTA e incube en RT durante 2-3 min.
      2. Agregue una cantidad igual de medio epitelial hormonal suplementario (medio SHEM: DMEM/F12, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico de ratón [EGF], 10 μg/mL de insulina-transferrina-selenio [ITS], 5% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 0,5% de dimetilsulfóxido [DMSO], 0,5 mg/mL de hidrocortisona), pipetea suavemente para hacer una suspensión celular y cuenta las células.
    4. Use una placa de 12 pocillos y agregue 0.5 mL de medio SHEM a cada pocillo.
    5. Mezcle células epiteliales de la córnea con células NIH 3T3 a una densidad de 500 células epiteliales corneales/cm2 y 5 x 105 células NIH 3T3/cm2. Agregue 1 mL de medio SHEM a cada pocillo.
    6. Agregue 1 ml de la mezcla de células a cada pocillo y pipetee suavemente para distribuir las células de manera uniforme.
    7. Incubar en una incubadora (5% CO2, 37 °C), cambiando el medio cada 2-3 días. Cultivo durante 12-14 días.
  7. Tinción de cristal violeta
    1. Después de aproximadamente 12 días, cuando los clones epiteliales corneales estén a punto de fusionarse, retire el medio de cultivo y agregue 1 mL de solución de paraformaldehído al 4% a cada pocillo, cubriendo las células por completo. Fije las celdas durante 15 minutos en RT.
    2. Retire el paraformaldehído al 4% y lave los pocillos tres veces con 1x PBS durante 5 minutos cada uno.
    3. Retire 1 tampón PBS y agregue una solución de tinte violeta cristalino al 0,4% a cada pocillo. Manchar durante 30 min en RT.
    4. Retira o recicla la solución de tinte violeta cristalino y lávala tres veces con 1x PBS durante 10 minutos cada una.
    5. Seque al aire los pozos en RT hasta que estén completamente secos.
    6. Utilice un sistema de fotografía de microscopio vertical normal (velocidad de escaneo: 4 μs/píxel, resolución de escaneo: 1024 x 1024).
  8. Extracción de ARNm corneal
    1. Reúna tijeras oftálmicas, tijeras corneales, pinzas dentadas, raspador epitelial corneal eléctrico, Trizol, tubos de centrífuga de 1,5 ml sin ARNasa y una caja de hielo.
    2. Adquisición epitelial
      1. Anestesiar a la rata con isoflurano al 4-5% y practicarle la eutanasia después de la luxación cervical. Coloque al animal en posición lateral. Recorta los bigotes del ratón con unas tijeras para evitar bloquear la vista.
      2. Coloque a la rata bajo un microscopio quirúrgico y ajústelo a una altura adecuada para enfocar el globo ocular. Use pinzas dentadas para empujar y exponer suavemente el globo ocular. Levante la conjuntiva de la rata y use un raspador epitelial corneal eléctrico limpio para raspar el área central de 2 mm del epitelio corneal.
      3. Recoja el epitelio corneal raspado con pinzas limpias y dentadas rociadas con alcohol. Coloque el tejido recolectado en un tubo de centrífuga que contenga 1 mL de Trizol.
      4. Trabaje lo más rápido posible para enjuagar el tejido recolectado en un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga agua desionizada doble. Absorbe el exceso de agua con papel de filtro. Rocíe con alcohol al 75% y continúe con el siguiente paso.
      5. Vuelve a levantar la conjuntiva de la rata con unas pinzas dentadas. Use tijeras córneas con el lado cóncavo hacia arriba para cortar la conjuntiva a lo largo del limbo, dejando aproximadamente 0,5 mm de conjuntiva blanca.
      6. Raspe el epitelio corneal dentro de un rango de 2 mm en el limbo corneal con el raspador eléctrico. Recoja el tejido como se describió anteriormente. Recoja el epitelio corneal central de tres globos oculares y el epitelio limbal de tres globos oculares.
      7. Coloque los tejidos recolectados en tubos de reactivos de extracción de ARN de Trizol de 1 mL separados. Realice toda la operación en hielo para preservar la integridad del ARN. Continúe con los siguientes pasos inmediatamente o almacene las muestras en un congelador de temperatura ultrabaja a -80 °C para su uso posterior.
    3. Descongele la muestra en hielo, use un homogeneizador de tejido ultrasónico para lisar las células. Ajuste la potencia del homogeneizador ultrasónico al 25%, el tiempo a 2 s por ráfaga, el tiempo del intervalo a 5 s y el tiempo total a 2 min. Déjalo reposar sobre hielo durante 10 min.
    4. Añadir cloroformo (1/5 del volumen total, aproximadamente 200 μL) a cada muestra, mezclar bien invirtiendo durante 30 s y centrifugar a 400 x g durante 10 min a 4 °C.
    5. Precipitación de ARN
      1. Después de la centrifugación, el líquido dentro del tubo de centrífuga se superpone en tres partes. La capa transparente superior es ARN, la capa nublada blanca central es ADN y proteínas, y la capa inferior es Trizol. Pipetear con cuidado unos 500 μL de la capa transparente superior en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mL, con cuidado de no aspirar el precipitado blanco en la capa intermedia. Si se aspira inadvertidamente, repita la centrifugación para recoger la capa transparente nuevamente.
      2. Agregue una cantidad igual de isopropanol preenfriado al tubo de centrífuga que contiene la capa transparente, aproximadamente 500 μL, invierta el tubo varias veces para mezclar bien, luego colóquelo inmediatamente en un congelador de temperatura ultrabaja a -80 °C durante 20-30 min. Este paso tiene como objetivo acelerar la precipitación del ARN.
    6. Extraiga la muestra y centrifuga inmediatamente a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Se ve una pequeña cantidad de precipitado blanco y escamoso en el fondo del tubo de centrífuga; Deseche el sobrenadante.
    7. Agregue etanol al 70% preparado previamente y enfriado por hielo a cada tubo. Centrifugar inmediatamente a 4 °C en una centrífuga refrigerada a 400 x g durante unos 10 min; Repita los pasos anteriores una vez para lavar a fondo el precipitado. En este paso, preesterilice la campana extractora con luz ultravioleta durante 15 minutos.
    8. Después de retirar los tubos de centrífuga y desechar el sobrenadante, vuelva a centrifugar a 4 °C a aproximadamente 250 x g durante 2 min. Utilice una punta de pipeta de 200 μL para aspirar cuidadosamente el exceso de alcohol desde el lado opuesto al precipitado, secando lo más a fondo posible. Coloque en una campana extractora previamente esterilizada con rayos UV para que se seque, seque al aire el precipitado durante unos 15 minutos.
    9. Prepare la solución añadiendo 1 mL de inhibidor de RNasa a 40 mL de agua de pirocarbonato de dietilo (DEPC). Añada una cantidad adecuada de mezcla de agua DEPC/inhibidor de ARNasa, aproximadamente 20-30 μL, para disolver la muestra. Si hay mucho precipitado, agregue 30-50 μL. Proceda inmediatamente con la PCR con transcripción inversa.
  9. PCR de transcripción inversa
    1. Asegúrese de que estos elementos estén presentes: máquina de PCR, tubos de centrífuga de 1,5 mL sin RNasa, tubos de PCR de 0,2 mL, baño de hielo o caja de hielo, pipeta y puntas sin RNasa.
    2. Mida la concentración de ARN con el espectrofotómetro de microvolúmenes. Para cada muestra, asegúrese de que se agregue 1 μg de ARN al sistema de reacción.
    3. El sistema de transcripción inversa tiene un volumen total de 20 μL. Calcule la cantidad total de reactivos necesarios en función del número de muestras. Mezcle de acuerdo con la proporción especificada en las instrucciones.
    4. Prepare el sistema de reacción en hielo, vértice y centrifugue brevemente. Incubar a 42 °C durante 15 min y a 90 °C durante 30 s.
    5. Utilice el ADNc obtenido del proceso de transcripción inversa, ya sea directamente para el análisis de PCR cuantitativo en tiempo real o almacene en un refrigerador de -80 °C.
  10. Reacción de PCR cuantitativa en tiempo real
    1. Utilice un kit de reactivos de PCR cuantitativa en tiempo real17 con un sistema de reacción de 10 μL. Utilice las secuencias de cebadores que se muestran en la Tabla 1.
    2. Agregue el sistema de reacción descrito anteriormente en una placa de 96 pocillos o en un tubo de ocho tiras específicamente para RT-PCR. Asegúrese de que las muestras estén bien mezcladas. Compruebe si hay burbujas en los tubos antes de colocarlos en la máquina de PCR.
    3. Amplifique el gen utilizando el ciclo de PCR (95 °C durante 5 min), 40 ciclos (95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s) y complete los datos para calcular el valor de 2-ΔΔ Ct. Procese, analice y trace los datos utilizando el software de análisis de datos adecuado.

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Resultados

Como se muestra en la Figura 1A, a través de la observación con una lámpara de hendidura, encontramos que la cicatrización del epitelio corneal estaba deteriorada. En circunstancias normales, el epitelio central de la córnea se curaría completamente dentro de las 24-48 horas posteriores a la extracción, pero en la extirpación del epitelio central de la córnea combinada con un modelo de sutura, continuaron existiendo nuevos vasos sanguíneos. Al terc...

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Discusión

La inflamación desempeña un papel clave en el desarrollo de la deficiencia de células madre limbales18, pero sus mecanismos y efectos específicos requieren una mayor exploración. Para abordar este problema, indujimos LSCD raspando el epitelio corneal central y suturando el estroma corneal central para causar una inflamación corneal grave. Observamos la evolución de la inflamación corneal y el estado de las células madre limbales en los días 1, 3 y 7 post...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado en parte por los Proyectos Provinciales de Ciencia y Tecnología de Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043), el Fondo Provincial de Ciencia de Fujian para Jóvenes Académicos Distinguidos (2023J06053 [a S.O]); la Fundación de Ciencias Naturales de China (No.82101084 [a S.O.] y el Consejo de Becas de China (CSC, 202306310049 [a Y.W.]).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
10-0 suture lineAlcon, Inc., USA8065698001
2 mm corneal trephineSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, 1 mL pipette gun heads, cell culture plate culture plates, centrifuge tubesGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chinahttps://www.jetbiofil.com/index.html
-20/-80 °C fridgeQingdao Haier Company, Chinahttps://www.haier.com/cn/
A 10-mL syringe Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chinahttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Adhere to the slideShiTai Company188105
Amylene alcoholShanghai. Macklin Biochemical, Chinahttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, United Kingdomab76318
Anti-Keratin 12 antibody EPR17882Abcam, United Kingdomab185627
Anti-PAX6 antibodyAbcam, United Kingdomab195045
Anti-stripping slides, cover slipsJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd., Chinahttps://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, Japanhttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Chinahttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
CO2 Oven incubator, ultrasonic crusher, centrifugeThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Confocal microscopeShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chinahttps://www.clinx.cn/about
Corneal epithelial forcepsSuzhou XVI Vision Company, China53418D
DAPIVector. Inc., USAH-1000
DEPC water Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
Dicuro eye cream (ofloxacin eye cream)Santian Pharmaceutical Corporation, Japanhttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, culture medium, double antibody, and PBSThermo Fisher Scientific, Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, United Kingdom MCA341GA
Electronic balanceShanghai Ohaus Biotechnology Company, Chinahttp://shbio.com/company
Enclosure of the membraneParafilm, Inc., USAhttps://www.sigmaaldrich.cn
Fluorescein sodium test strip was used in ophthalmologyTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinahttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Fluorescent inverted phase-contrast micrographic systemTE-2000U, Nikon, Japanhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Frozen table-top centrifugeEppendorf, Germanyhttps://www.eppendorf.sh.cn 
Glass sheet frameXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://www.tagene.net/
H-1200 with DAPI sealagentXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Chinahttps://www.bosonbio.com.cn/
HE staining kitAuragene, Chinahttp://jushengwu.com/a048/
Hematoxylin-eosin dye solution kitAURAGEN, United StatesP032IH
High and low precision electronic balanceSdolis, Germanyhttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinahttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67 antibodyAbcam, United Kingdomab16667
liquid nitrogenXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chinahttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Microhand holderSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Multiformaldehyde powderSigm, Americahttps://www.sigmaaldrich.cn
Normal temperature centrifuge 46Eppendorf, Germanyhttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China4583
Ordinary biological micrographic systemEclipse 50i, Nikon, Japanhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChinaSH30256.01
PCR, and the reactor apparatusBiometra Thermocycler, Germanyhttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipettes of various specificationsEppendorf Company, Germanyhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers for Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaine hydrochloride 0.5% eye dropsAlcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Rat PMN antibodyFitzgerald, United States20R-PR020
Real time fluorescence quantitative PCRApplied Biosystems, United Stateshttps://www.thermofisher.cn
Reverse transcription kitTAKARA, Japanhttps://www.takarabiomed.com.cn/
Slit lampTOPCON, Japanhttps://topconchina.cn/
Smooth forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://chuangdianbio.com/
Superclean benchNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singaporehttps://www.hi-p.com/
Toothed forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Toppicamide eye drops (Medol)Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Trace nucleic acid protein concentration testerThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen The United Stateshttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, with a surgical microscopeCarl ZEIS, Germanyhttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html

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