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Resumo

Desenvolvemos um modelo de rato de inflamação grave da córnea por meio de curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea. O estudo avaliou os padrões de inflamação da córnea, proliferação epitelial e alterações nas células-tronco límbicas sob condições inflamatórias.

Resumo

A inflamação da córnea, especialmente a inflamação grave da córnea, desempenha um papel significativo no desenvolvimento da disfunção das células-tronco límbicas da córnea. A construção de modelos animais apropriados pode nos ajudar a focar nos efeitos da inflamação grave nas células-tronco límbicas da córnea. Um removedor de ferrugem de 2 mm foi usado para remover o epitélio central da córnea de ratos Sprague Dawley (SD) para criar uma lesão. Em seguida, o estroma central da córnea foi suturado com pontos de náilon para induzir inflamação persistente. Dessa forma, foi construído um modelo de inflamação da córnea com abrasão do epitélio central da córnea e sutura do estroma central, que induziu inflamação corneana grave. Foram observadas as alterações na inflamação da córnea e na condição das células-tronco límbicas em 1, 3 e 7 dias após a modelagem. No3º dia após a modelagem, o limbo corneano dos ratos estava severamente edemaciado, com evidente neovascularização e hiperplasia local, sinais típicos de deficiência de células-tronco límbicas. No7º dia, o edema da córnea piorou gradativamente e a neovascularização continuou a aumentar. Por meio da reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) e coloração por imunofluorescência, descobrimos que os fatores inflamatórios epiteliais da córnea foram significativamente regulados positivamente, a diferenciação epitelial da córnea foi anormal, as células-tronco epiteliais da córnea foram significativamente reduzidas e a proliferação celular e a estaminalidade também diminuíram. Portanto, este modelo demonstra que a inflamação grave pode induzir danos às células-tronco límbicas sem danificar diretamente as células-tronco límbicas. O modelo é benéfico para observar os efeitos da inflamação grave nos mecanismos biológicos das células-tronco e fornece uma plataforma ideal para estudar os mecanismos da disfunção das células-tronco epiteliais da córnea induzida pela inflamação.

Introdução

A disfunção das células-tronco límbicas (LSCD) é caracterizada por defeitos epiteliais persistentes, vascularização da córnea, inflamação crônica, cicatrização e conjuntivalização da córnea 1,2. Pode surgir da depleção ou disfunção das células-tronco límbicas após doenças graves da superfície ocular, como queimaduras químicas, queimaduras térmicas, síndrome de Stevens-Johnson e lesão iatrogênica causada por cirurgias oculares 2,3,4. Os mecanismos patogênicos do LSCD envolvem principalmente alterações nas células-tronco e distúrbios no microambiente das células-tronco 5,6, o que afeta a homeostase do epitélio da córnea 2,7. Existem dois tipos principais de mudanças de destino nas células-tronco límbicas no LSCD: 1) O potencial de diferenciação direcional das células-tronco epiteliais da córnea torna-se anormal, levando à sua diferenciação em células epiteliais da pele. Isso é evidenciado por uma diminuição na expressão do fator de transcrição específico das células epiteliais da córnea Pax6 e das queratinas específicas da córnea Krt12 e Krt3, juntamente com um aumento significativo na expressão dos marcadores de metaplasia epitelial escamosa relacionados à pele Krt10, Krt1 e Sprr1b8; 2) A lesão da superfície ocular destrói diretamente as células-tronco límbicas da córnea, resultando em necrose ou apoptose e, posteriormente, causando proliferação do tecido conjuntival que cobre a córnea9. Foi relatado que, durante o desenvolvimento do LSCD, as células inflamatórias, como macrófagos, neutrófilos e células dendríticas, aumentam significativamente no microambiente de células-tronco epiteliais da córnea. Da mesma forma, citocinas como interferon-gama (IFN)-γ, fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-1β e proteínas inflamatórias de macrófagos (MIP)-1α/β também apresentam elevações significativas10.

Vários modelos de LSCD foram estabelecidos, incluindo aqueles induzidos por suturas, lesões químicas e manchas de cloreto de benzalcônio11. Cada um desses modelos tem suas vantagens e desvantagens. Lesões químicas podem danificar toda a superfície ocular e destruir diretamente as células-tronco límbicas12. O cloreto de benzalcônio funciona de forma semelhante às lesões químicas, mas tem um efeito relativamente lento13. O modelo de sutura da córnea pode induzir uma resposta inflamatória estável e de longo prazo, mas a reação inflamatória é relativamente leve e não pode causar LSCD.

Para investigar o papel e os mecanismos da inflamação no desenvolvimento do LSCD da córnea, foi estabelecido um modelo animal que combina curetagem do epitélio central da córnea com suturas da córnea. Este modelo induz inflamação persistente do epitélio da córnea sem danificar diretamente as células-tronco límbicas.

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Protocolo

Todos os procedimentos estavam em conformidade com as diretrizes da ARVO para o uso de animais em pesquisas oftalmológicas e visuais e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica de Guizhou (Aprovação nº 2305192). Os ratos foram alojados no Centro Animal da Universidade Médica de Guizhou, aderindo aos regulamentos relevantes de manejo animal.

1. Seleção de animais

  1. Use ratos Sprague-Dawley (SD) fêmeas com idade entre 7 e 8 semanas. Certifique-se de que não haja lesões na superfície ocular sob o exame com lâmpada de fenda.
  2. Esterilize os instrumentos usando um esterilizador rápido. Os instrumentos necessários incluem removedor de anel de ferrugem da córnea, marcador de amostragem de pele de tamanho de 2 mm, porta-agulhas, facas de camada de placa, tesoura cirúrgica oftálmica e fórceps.
  3. Anestesiar ratos com tribromoetanol a 1,25% por injeção intraperitoneal na dose de 0,3 mL por 100 g de peso corporal. Avalie a profundidade da anestesia por pinça do dedo do pé. Instilar uma gota de colírio de tropicamida para dilatação da pupila. Aplique colírio de cloridrato de bupivacaína no olho. Use pomada lubrificante ocular no olho contralateral para manter a umidade.
  4. Desinfete a pele e o cabelo ao redor dos olhos com iodóforo.
  5. Estabeleça o modelo de inflamação.
    1. Coloque o rato em decúbito lateral. Exponha o globo ocular sob um microscópio cirúrgico.
    2. A córnea central foi marcada usando um marcador de amostragem de pele de tamanho de 2 mm, e o epitélio corneano central marcado foi raspado usando um removedor de anel de ferrugem da córnea.
    3. Colocar três suturas corneanas de 120° com fio de náilon 10-0, porta-agulha e tesoura cirúrgica oftálmica e pinça a cerca de 3 mm do limbo, não penetrar na córnea14,15.
  6. Aplique pomada ocular Ofloxacina no final do procedimento para prevenir infecções.
  7. Observe e fotografe a córnea no1º, 3º e7º dia de pós-operatório usando uma lente ampliada de 10x com lâmpada de fenda. Registre os sintomas como cicatrização epitelial da córnea, hiperemia conjuntival, edema da córnea, hiperemia límbica e neovascularização da córnea.

2. Cálculo do índice inflamatório

  1. Calcule o índice inflamatório da superfície ocular após estabelecer o modelo animal.
    1. Pontue a congestão do corpo ciliar da seguinte forma: sem congestão (0 pontos); a presença de congestão inferior a 1 mm (1 ponto); hiperemia entre 1 mm e 2 mm (2 pontos); hiperemia entre 1 mm e 2 mm (3 pontos).
    2. Pontue o edema central da córnea da seguinte forma: sem edema (0 pontos); edema com visibilidade clara da íris (1 ponto); edema com visibilidade incerta da íris (2 pontos); edema com a íris não visível (3 pontos).
    3. Pontue o edema de córnea paracentral da seguinte forma: sem edema (0 pontos); edema com visibilidade clara da íris (1 ponto); edema com visibilidade incerta da íris (2 pontos); edema com a íris não visível (3 pontos).
    4. Calcule o índice de inflamação somando todas as pontuações e dividindo-o por 9.

3. Avaliação da neovascularização da córnea

  1. Observe a neovascularização da córnea com uma lâmpada de fenda.
    1. Analise e processe imagens usando o software de processamento de imagem de lâmpada de fenda16.
    2. Registre o crescimento da neovascularização da córnea em cada ponto de observação, medindo a neovascularização da córnea mais longa em direção à córnea central com curvatura mínima.
    3. Classifique-os da seguinte forma: Grau 0: Avascular; Grau 1: Micro (<1 mm); Grau 2: Leve (1 mm a 1,5 mm); Grau 3: Moderado (>1,5 mm a 2 mm); Grau 4: Grave (>2 mm).

4. Analisando a biologia do modelo

  1. Prepare amostras de olhos congelados.
    1. Anestesiar o rato com isoflurano a 4-5% e sacrificá-lo por luxação cervical.
    2. Na posição de decúbito lateral, levante o globo ocular do rato para fora com uma micropinça e corte a conjuntiva aberta ao longo da cúpula do olho superior e inferior com uma tesoura para os olhos.
    3. Corte o nervo óptico, prestando atenção em manter a integridade do epitélio da córnea.
    4. Seque as manchas de sangue e água na superfície do globo ocular com papel de filtro e coloque-as na caixa de incorporação com meio de incorporação de temperatura de corte ideal (OCT).
    5. Remova as bolhas da caixa de embutir com uma pipeta de 200 μL, congele-a com nitrogênio líquido e guarde as amostras embutidas no refrigerador de temperatura ultrabaixa.
  2. Prepare seções congeladas dos globos oculares.
    1. Antes de preparar a secção congelada, pré-arrefecer o criostato a cerca de -28 °C e o suporte da amostra a -26 °C.
    2. Retire as amostras congeladas do congelador frio e coloque-as no criótomo durante cerca de 1 h.
    3. Pré-resfrie a amostra congelada em um criótomo por 10 min. Marque a amostra com um lápis, fixe-a na almofada da amostra com OCT e fixe-a na grelha de corte após o resfriamento.
    4. Ajuste a posição e a direção da amostra congelada e fixe-a. Primeiro, corte cortes de 20 μm até que a córnea central seja vista. Em seguida, obter cortes de 6 μm por corte contínuo e coletar os cortes nas lâminas de adesão pré-preparadas.
    5. Marque o nome, material, tempo de corte, nome e número do tecido na lâmina. Coloque-o em temperatura ambiente (RT) por cerca de 30 min.
    6. Depois de secar as seções, coloque-as em uma caixa e guarde-as na geladeira de temperatura ultrabaixa para reserva.
  3. Realize a coloração de hematoxilina e eosina.
    1. Retire as secções congeladas pré-preparadas do frigorífico de temperatura ultrabaixa e coloque-as na hotte à temperatura alta para secar.
    2. Fixe as seções usando paraformaldeído a 4% por 15 min em RT. Enxágue as amostras com 1x PBS por 5 min.
    3. Coloque as seções de amostra contendo lâminas em um suporte de lâminas e mergulhe-as no cilindro de corante com solução de corante de hematoxilina em RT por 5 min.
    4. Enxágue lentamente a amostra contendo lâminas com água da torneira para lavar o corante flutuante, coloque-as no tanque de corante com álcool de ácido clorídrico a 0,1% e remova-as rapidamente após 1-2 s.
    5. Enxágue lentamente a amostra com água da torneira por 15 min.
    6. Remova a amostra da água e mergulhe as lâminas no tanque de corante de eosina; deixe no RT por 3 min.
    7. Enxágue lentamente a amostra com água da torneira, lave o excesso de corante e execute a desidratação com álcool gradiente usando álcool 75%, álcool 80%, álcool 95%, álcool 100% (um) e álcool 100% (dois). Aplique as seções em cada concentração por 2 min.
    8. Tornar as amostras transparentes durante 2 min em xileno (1) e xileno (2), respectivamente.
    9. Seque a amostra na hotte, sele as secções com um agente de vedação e tenha cuidado para não produzir bolhas.
    10. Coloque as lâminas em uma caixa de lâminas no RT. Imagem das seções usando um microscópio.
  4. Realize a coloração por imunofluorescência.
    1. Retirar as secções congeladas e colocá-las numa caixa à RT na hotte para secar.
    2. Marque o nome do anticorpo a ser corado no branco da lâmina de vidro da amostra congelada.
    3. Fixe os espécimes com paraformaldeído a 4% em RT por 15 min. Uma pequena quantidade de água da torneira foi adicionada à caixa para evitar que a amostra seque.
    4. Remova o fixador de paraformaldeído e lave a amostra três vezes com 1x tampão PBS. Tenha cuidado para não lavar a amostra.
    5. Seque o líquido ao redor da seção de tecido, cubra a amostra com solução de membrana celular (0,2% TritonX-100) e incube em RT por 20 min.
    6. Remova a solução de membrana celular e lave as seções três vezes por 5 min cada com 1x tampão PBS.
    7. Seque as seções de tecido, cubra a amostra com solução de bloqueio de imunofluorescência (2% BSA) e incube em RT por 1 h.
    8. Prepare o anticorpo primário e o diluente (1% BSA) durante a incubação de acordo com as instruções do fabricante.
    9. Remova o fluido de bloqueio e seque a amostra com uma bomba de sucção. Adicione o anticorpo primário preparado, tampe a caixa e incube-o em uma geladeira a 4 ° C durante a noite (incube por cerca de 12-16 h) longe da luz.
    10. Descarte o anticorpo primário e lave a amostra quatro vezes por 10 minutos cada em PBS.
    11. Durante a etapa de limpeza, prepare a diluição do anticorpo secundário de acordo com as instruções do fabricante.
    12. Remova o PBS, seque a amostra e adicione o anticorpo secundário preparado à amostra. Cobrir o provete e incubar em RT durante 1 h de distância da luz.
    13. Remova o anticorpo secundário, lave a amostra 4 vezes com 1x tampão PBS por 10 min cada e cubra toda a lâmina com 1x tampão PBS.
    14. Remova o PBS, seque a amostra e sele as seções com um meio de montagem contendo DAPI, garantindo que não haja bolhas de ar. Embrulhe as lâminas em papel alumínio e mantenha-as a 4 °C longe da luz.
    15. Tire fotos com um sistema de microscópio confocal a laser ou com um sistema de câmera de microscópio de fluorescência vertical (velocidade de digitalização: 4 μs/pixel, resolução de digitalização: 1024 x 1024).
  5. Preparação de suspensão unicelular do epitélio da córnea de rato
    1. Após a eutanásia, retirar os globos oculares com uma pinça embebida em álcool 75% e colocá-los na solução salina balanceada 1x Hanks (HBSS) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de penicilina-estreptomicina preparada previamente.
    2. Limpe os globos oculares e use 1x HBBS contendo 10% de FBS e 10% de penicilina-estreptomicina duas vezes por 5 minutos cada.
    3. Remova a conjuntiva ao longo da margem escleral; deixar a margem escleral em cerca de 1 mm. Novamente, lave o tecido da córnea duas vezes com 1x HBBS contendo 10% de FBS e 10% de penicilina-estreptomicina.
    4. Transfira o tecido limpo da córnea para um meio epidérmico hormonal suplementado (SHEM) contendo 2U / mL de Dispase II. Feche a vedação e coloque-a a 4°C por 14-16 h.
    5. Tenha uma pinça, uma pinça desdentada, um dispositivo de recuperação de íris e um esterilizador cirúrgico prontos.
    6. Sob um microscópio cirúrgico, separe suavemente o epitélio da córnea ao longo da borda da córnea.
    7. Lave o epitélio da córnea com 1x HBSS contendo 10% de penicilina-estreptomicina por 5 min.
    8. Transfira o tecido epitelial da córnea para um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 200 mL de tripsina e incube em uma incubadora de CO2, 37 ° C a 5%. A cada 5 minutos, agite o tubo de centrífuga três vezes para digerir a folha epitelial da córnea em uma suspensão de célula única.
    9. Adicione uma quantidade igual de meio SHEM para interromper a ação da solução de digestão de tripsina e coloque-o em RT.
  6. Cultura de clones de células epiteliais da córnea
    1. Prepare as células trofoblásticas.
      1. Quando a densidade de crescimento das células de camundongo NIH 3T3 atingir 80-90%, descarte o meio de cultura celular. Adicione 10 mg / mL de meio de cultura de mitomicina NIH 3T3 pré-preparado e incube a 37 ° C por 2,5 h.
      2. Remova o meio, enxágue as células com 1x HBSS, substitua por um novo meio celular NIH 3T3 e continue a incubação em uma incubadora de CO2 (5% CO2, 37 ° C).
    2. Preparar a suspensão de células epiteliais da córnea e contar as células de acordo com a proporção necessária.
    3. Ao preparar a suspensão de células epiteliais da córnea, processe as células NIH 3T3 tratadas com mitomicina.
      1. Descarte o sobrenadante, enxágue as células com 1x HBSS, adicione 1 mL de solução de tripsina-EDTA e incube em RT por 2-3 min.
      2. Adicione uma quantidade igual de meio epitelial hormonal suplementar (meio SHEM: DMEM/F12, fator de crescimento epidérmico de camundongo 10 ng/mL [EGF], 10 μg/mL de insulina-transferrina-selênio [ITS], 5% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 0,5% de dimetilsulfóxido [DMSO], 0,5 mg/mL de hidrocortisona), pipete suavemente para fazer uma suspensão celular e conte as células.
    4. Use uma placa de 12 poços e adicione 0,5 mL de meio SHEM a cada poço.
    5. Misture as células epiteliais da córnea com células NIH 3T3 a uma densidade de 500 células epiteliais da córnea / cm2 e 5 x 105 células NIH 3T3 / cm2. Adicione 1 mL de meio SHEM a cada poço.
    6. Adicione 1 mL da mistura de células a cada poço e pipete suavemente para distribuir as células uniformemente.
    7. Incubar em incubadora (5% CO2, 37 °C), trocando o meio a cada 2-3 dias. Cultura por 12-14 dias.
  7. Coloração violeta de cristal
    1. Após aproximadamente 12 dias, quando os clones epiteliais da córnea estão prestes a se fundir, remova o meio de cultura e adicione 1 mL de solução de paraformaldeído a 4% em cada poço, cobrindo completamente as células. Fixe as células por 15 min em RT.
    2. Remova o paraformaldeído a 4% e lave os poços três vezes com 1x PBS por 5 min cada.
    3. Remova 1x tampão PBS e adicione solução de corante violeta a 0,4% a cada poço. Manchar por 30 min no RT.
    4. Remova ou recicle a solução de corante violeta cristal e lave-a três vezes com 1x PBS por 10 min cada.
    5. Seque os poços ao ar em RT até que estejam completamente secos.
    6. Use um sistema de fotografia de microscópio vertical regular (velocidade de varredura: 4 μs/pixel, resolução de varredura: 1024 x 1024).
  8. Extração de mRNA da córnea
    1. Reúna tesouras oftálmicas, tesouras de córnea, pinças dentadas, raspador epitelial elétrico da córnea, Trizol, tubos de centrífuga de 1,5 mL sem RNase e uma caixa de gelo.
    2. Aquisição epitelial
      1. Anestesiar o rato com isoflurano a 4-5% e sacrificá-lo após luxação cervical. Coloque o animal em posição lateral. Apare os bigodes do rato com uma tesoura para os olhos para evitar bloquear a visão.
      2. Coloque o rato sob um microscópio cirúrgico e ajuste-o a uma altura apropriada para focar no globo ocular. Use uma pinça dentada para empurrar e expor suavemente o globo ocular. Levante a conjuntiva do rato e use um raspador epitelial da córnea elétrico limpo para raspar a área central de 2 mm do epitélio da córnea.
      3. Colete o epitélio da córnea raspado com pinças dentadas limpas e borrifadas com álcool. Coloque o tecido coletado em um tubo de centrífuga contendo 1 mL de Trizol.
      4. Trabalhe o mais rápido possível para enxaguar o tecido coletado em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo água duplamente deionizada. Absorva o excesso de água com papel de filtro. Pulverize com álcool 75% e prossiga para a próxima etapa.
      5. Levante a conjuntiva do rato novamente usando uma pinça dentada. Use uma tesoura de córnea com o lado côncavo para cima para cortar a conjuntiva ao longo do limbo, deixando cerca de 0,5 mm de conjuntiva branca.
      6. Raspe o epitélio da córnea dentro de uma faixa de 2 mm no limbo da córnea usando o raspador elétrico. Colete o tecido conforme descrito anteriormente. Colete o epitélio central da córnea de três globos oculares e o epitélio límbico de três globos oculares.
      7. Coloque os tecidos coletados em tubos separados de 1 mL de reagente de extração de RNA Trizol. Realize toda a operação no gelo para preservar a integridade do RNA. Prossiga com as próximas etapas imediatamente ou armazene as amostras em um freezer de temperatura ultrabaixa a -80 °C para uso posterior.
    3. Descongele a amostra no gelo, use um homogeneizador de tecido ultrassônico para lisar as células. Defina a potência do homogeneizador ultrassônico para 25%, o tempo para 2 s por rajada, o tempo de intervalo para 5 s e o tempo total para 2 min. Deixe repousar no gelo por 10 min.
    4. Adicionar clorofórmio (1/5 do volume total, cerca de 200 μl) a cada amostra, misturar bem invertendo durante 30 segundos e centrifugar a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C.
    5. Precipitação de RNA
      1. Após a centrifugação, o líquido dentro do tubo da centrífuga é dividido em três partes. A camada superior clara é o RNA, a camada branca turva do meio é o DNA e as proteínas e a camada inferior é o Trizol. Pipetar cuidadosamente cerca de 500 μL da camada transparente superior para um novo tubo de centrifugação de 1,5 ml, com cuidado para não aspirar o precipitado branco na camada intermédia. Se aspirado inadvertidamente, repita a centrifugação para coletar a camada transparente novamente.
      2. Adicione uma quantidade igual de isopropanol pré-resfriado ao tubo de centrífuga contendo a camada transparente, aproximadamente 500 μL, inverta o tubo várias vezes para misturar bem e, em seguida, coloque-o imediatamente em um freezer de temperatura ultrabaixa a -80 °C por 20-30 min. Esta etapa visa acelerar a precipitação de RNA.
    6. Retirar a amostra e centrifugar imediatamente a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Uma pequena quantidade de precipitado branco e escamoso é vista na parte inferior do tubo da centrífuga; descarte o sobrenadante.
    7. Adicione etanol 70% pré-preparado e resfriado com gelo a cada tubo. Centrifugar imediatamente a 4 °C numa centrifugadora refrigerada a 400 x g durante cerca de 10 min; Repita as etapas acima uma vez para lavar bem o precipitado. Nesta etapa, pré-esterilize a hotte com luz UV por 15 min.
    8. Depois de remover os tubos da centrífuga e descartar o sobrenadante, centrifugue novamente a 4 °C a aproximadamente 250 x g por 2 min. Use uma ponta de pipeta de 200 μL para aspirar cuidadosamente o excesso de álcool do lado oposto ao precipitado, secando o mais completamente possível. Coloque em uma hotte pré-esterilizada por UV para secar, seque o precipitado ao ar por cerca de 15 min.
    9. Prepare a solução adicionando 1 mL de inibidor de RNase a 40 mL de água de dietilpirocarbonato (DEPC). Adicione uma quantidade adequada de mistura de água / inibidor de RNase DEPC, cerca de 20-30 μL, para dissolver a amostra. Se houver muito precipitado, adicione 30-50 μL. Proceda imediatamente com a PCR de transcrição reversa.
  9. PCR de transcrição reversa
    1. Certifique-se de que estes itens estejam presentes: máquina de PCR, tubos de centrífuga de 1.5 mL sem RNase, tubos de PCR de 0.2 mL, banho de gelo ou caixa de gelo, pipeta e pontas sem RNase.
    2. Medir a concentração de RNA utilizando o espectrofotómetro de microvolume. Para cada amostra, certifique-se de que 1 μg de RNA seja adicionado ao sistema de reação.
    3. O sistema de transcrição reversa tem um volume total de 20 μL. Calcule a quantidade total de reagentes necessários com base no número de amostras. Misture de acordo com a proporção especificada nas instruções.
    4. Prepare o sistema de reação no gelo, vórtice-o e centrifugue-o brevemente. Incubar a 42 °C durante 15 min e a 90 °C durante 30 s.
    5. Use o cDNA obtido do processo de transcrição reversa diretamente para análise de PCR quantitativa em tempo real ou armazene em uma geladeira a -80 °C.
  10. Reação de PCR quantitativa em tempo real
    1. Use um kit de reagentes de PCR quantitativo em tempo real17 com um sistema de reação de 10 μL. Use as sequências de primer mostradas na Tabela 1.
    2. Adicione o sistema de reação descrito acima em uma placa de 96 poços ou em um tubo de oito tiras especificamente para RT-PCR. Certifique-se de que as amostras estejam bem misturadas. Verifique se há bolhas nos tubos antes de colocá-los na máquina de PCR.
    3. Amplificar o gene utilizando o ciclo de PCR (95 °C durante 5 min), 40 ciclos (95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s) e completar os dados para calcular o valor de 2-ΔΔ Ct. Processe, analise e plote os dados usando o software de análise de dados apropriado.

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Resultados

Conforme mostrado na Figura 1A, por meio da observação com uma lâmpada de fenda, verificamos que a cicatrização do epitélio da córnea estava prejudicada. Em circunstâncias normais, o epitélio central da córnea cicatrizaria completamente dentro de 24-48 horas após a remoção, mas na excisão do epitélio central da córnea combinada com um modelo de sutura, novos vasos sanguíneos continuaram a existir. No terceiro dia após o estabelecimento do m...

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Discussão

A inflamação desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da deficiência de células-tronco límbicas18, mas seus mecanismos e efeitos específicos requerem mais exploração. Para resolver esse problema, induzimos LSCD raspando o epitélio central da córnea e suturando o estroma central da córnea para causar inflamação grave da córnea. Observamos a evolução da inflamação da córnea e o estado das células-tronco límbicas nos dias 1, 3 e 7 pós-...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado em parte pelos Projetos Provinciais de Ciência e Tecnologia de Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043), Fundo Científico da Província de Fujian para Jovens Acadêmicos Distintos (2023J06053 [para S.O]); a Fundação de Ciências Naturais da China (No.82101084 [para S.O.] e o Conselho de Bolsas de Estudo da China (CSC, 202306310049 [para Y.W.]).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
10-0 suture lineAlcon, Inc., USA8065698001
2 mm corneal trephineSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, 1 mL pipette gun heads, cell culture plate culture plates, centrifuge tubesGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chinahttps://www.jetbiofil.com/index.html
-20/-80 °C fridgeQingdao Haier Company, Chinahttps://www.haier.com/cn/
A 10-mL syringe Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chinahttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Adhere to the slideShiTai Company188105
Amylene alcoholShanghai. Macklin Biochemical, Chinahttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, United Kingdomab76318
Anti-Keratin 12 antibody EPR17882Abcam, United Kingdomab185627
Anti-PAX6 antibodyAbcam, United Kingdomab195045
Anti-stripping slides, cover slipsJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd., Chinahttps://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, Japanhttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Chinahttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
CO2 Oven incubator, ultrasonic crusher, centrifugeThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Confocal microscopeShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chinahttps://www.clinx.cn/about
Corneal epithelial forcepsSuzhou XVI Vision Company, China53418D
DAPIVector. Inc., USAH-1000
DEPC water Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinahttps://www.siobp.com/web
Dicuro eye cream (ofloxacin eye cream)Santian Pharmaceutical Corporation, Japanhttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, culture medium, double antibody, and PBSThermo Fisher Scientific, Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, United Kingdom MCA341GA
Electronic balanceShanghai Ohaus Biotechnology Company, Chinahttp://shbio.com/company
Enclosure of the membraneParafilm, Inc., USAhttps://www.sigmaaldrich.cn
Fluorescein sodium test strip was used in ophthalmologyTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinahttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Fluorescent inverted phase-contrast micrographic systemTE-2000U, Nikon, Japanhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Frozen table-top centrifugeEppendorf, Germanyhttps://www.eppendorf.sh.cn 
Glass sheet frameXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://www.tagene.net/
H-1200 with DAPI sealagentXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Chinahttps://www.bosonbio.com.cn/
HE staining kitAuragene, Chinahttp://jushengwu.com/a048/
Hematoxylin-eosin dye solution kitAURAGEN, United StatesP032IH
High and low precision electronic balanceSdolis, Germanyhttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinahttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67 antibodyAbcam, United Kingdomab16667
liquid nitrogenXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chinahttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Microhand holderSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Multiformaldehyde powderSigm, Americahttps://www.sigmaaldrich.cn
Normal temperature centrifuge 46Eppendorf, Germanyhttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China4583
Ordinary biological micrographic systemEclipse 50i, Nikon, Japanhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChinaSH30256.01
PCR, and the reactor apparatusBiometra Thermocycler, Germanyhttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipettes of various specificationsEppendorf Company, Germanyhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers for Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaine hydrochloride 0.5% eye dropsAlcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Rat PMN antibodyFitzgerald, United States20R-PR020
Real time fluorescence quantitative PCRApplied Biosystems, United Stateshttps://www.thermofisher.cn
Reverse transcription kitTAKARA, Japanhttps://www.takarabiomed.com.cn/
Slit lampTOPCON, Japanhttps://topconchina.cn/
Smooth forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinahttp://chuangdianbio.com/
Superclean benchNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singaporehttps://www.hi-p.com/
Toothed forcepsSuzhou XVI Vision Company, Chinahttp://www.66vision.com/
Toppicamide eye drops (Medol)Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Trace nucleic acid protein concentration testerThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen The United Stateshttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, with a surgical microscopeCarl ZEIS, Germanyhttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html

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