الكشف عن بروتيوفورمات هيستون باستخدام الرحلان الكهربائي للجل 2D-TAU

Summary

تصف هذه الطريقة استراتيجية بسيطة وسريعة لتوصيف البروتيون هيستون والتحقيق فيه.

Abstract

تخضع الهستونات لتعديلات ما بعد الترجمة المختلفة (PTMs) مثل المثيلة ، والأستيل ، والفسفرة ، والأسيلة ، والانتشار في كل مكان ، والتي تتحكم في ديناميكيات النيوكليوسوم وتحدد مصير الخلية. يتكون النيوكليوسوم ، وهو الوحدة الوظيفية للكروماتين ، من الحمض النووي ، وأربعة أزواج من الهستونات (H3 ، H4 ، H2A ، و H2B) التي تشكل اللب الكروي ، والرابط هيستون H1 ، الذي يعمل على استقرار بنية الكروماتين. تبرز ذيول الطرفية الأمينية (N) للهيستونات من المجالات الأساسية الكروية وتخضع لاختبارات PTMs مميزة تؤثر على مشهد الكروماتين. تشير بعض الأدلة إلى أن توازن هيستون PTM أمر بالغ الأهمية للحفاظ على جميع الأنشطة الفسيولوجية. يعد تحرير هيستون PTMs السبب الرئيسي للتكاثر الخلوي غير الطبيعي والغزو والورم الخبيث. لذلك ، يعد تطوير طرق لتوصيف PTMs من الهيستون أمرا بالغ الأهمية. هنا ، نصف تقنية فعالة لعزل وتحليل الأشكال الإسوية للهيستون. تسمح الطريقة ، التي تعتمد على الجمع بين فصلين متعامدين ، بإثراء الأشكال الإسوية للهيستون وتحديد قياس الطيف الكتلي التالي. تجمع هذه التقنية ، التي وصفها في الأصل Shechter et al. ، بين المواد الهلامية حمض اليوريا بولي أكريلاميد (TAU-GEL) ، والتي يمكنها فصل بروتينات الهيستون الأساسية بناء على الحجم والشحنة ، والمواد الهلامية دوديسيل كبريتات الصوديوم وبولي أكريلاميد (SDS-PAGE) ، والتي يمكنها فصل البروتينات حسب الوزن الجزيئي. والنتيجة هي خريطة ثنائية الأبعاد للأشكال الإسوية من الهيستون ، مناسبة للهضم داخل الهلام متبوعا بتحديد قياس الطيف الكتلي وتحليل اللطخة الغربية. والنتيجة هي خريطة ثنائية الأبعاد للأشكال الإسوية من الهيستون ، ومناسبة لكل من الهضم داخل الهلام متبوعا بتحديد قياس الطيف الكتلي وتحليل اللطخة الغربية. هذا النهج البروتيني هو طريقة قوية تسمح بإثراء شكل إسوي هيستون واحد وتوصيف PTMs هيستون الجديدة.

Introduction

يرتبط ظهور السرطان وتطوره ومقاومته الكيميائية بالأحداث الجينية والجينية ، بما في ذلك هيستون PTMs. تخضع الهستونات لمجموعة متنوعة من PTMs التي تنظم ديناميكيات الكروماتين وتملي مصير^{الخلية 1}.

النيوكليوسوم هو الوحدة الوظيفية للكروماتين وهو مركب جزيئي من الحمض النووي والبروتينات يسمح بتعبئة الحمض النووي في النواة. يتكون من أربعة أزواج من الهستونات (H3 و H4 و H2A و H2B) التي تشكل نواة النيوكليوسوم ، بالإضافة إلى الرابط هيستون H1 ، مما يساعد على استقرار بنية الكروماتين. تبرز ذيول الهيستونات الأمينية (N) الطرفية من مجالاتها الأساسية الكروية وتخضع لتعديلات محددة بعد الترجمة تؤثر على مشهد الكروماتين².

حتى الآن ، ما لا يقل عن 23 فئة من PTMs هيستون. هذه PTMs عبارة عن تعديلات تساهمية تتكون بشكل أساسي من المثيلة ، الأستلة ، الفسفرة ، الارتباط بالجليكوزيل ، الكل في كل مكان ، SUMOylation ، و ADP-ribosylation³. بالإضافة إلى ذلك ، تم مؤخرا اقتراح علاقة وثيقة بين توازن epigenome وإعادة الأسلاك الأيضية ، وهو ما يفسر النمو المتسارع للعدد المحتمل من histones PTMs^{4،5،6،7،8،9،10،11،12،13}. يتم تسمية Histone PTMs ، المودعة والممسوحة والمحولة بواسطة إنزيمات المعدل ، على التوالي باسم الكتاب والممحاة والقراء. إنها تؤثر على الخصائص الفيزيائية والكيميائية لبنية الكروماتين ، مما يؤثر على ملف تعريف التعبير الجيني ، بما في ذلك التعبير عن الجينات المثبطة للورم والجينات المسرطنة^14،15،16.

يزداد عدد الأشكال البروتينية الهستونية عند دمجها في النيوكليوسوم كمتغيرات هيستون. هذه المتغيرات هي أشكال إسوية غير أليلية من الهستونات الكنسية ، وتضيف تعقيدا عن طريق تغيير الخصائص الكيميائية والفيزيائية للكروماتين. بالمقارنة مع الهستونات الكنسية ، فإن متغيرات الهيستون لها مجالات وظيفية تخضع لتعديلات فريدة بعد الترجمة أو تتفاعل مع مكونات كروماتين محددة ، مما يؤثر على ديناميكيات واستقرار النيوكليوسوم¹⁷.

في الخلايا السرطانية ، يؤثر تحرير هيستون PTMs والمتغيرات على ملف تعريف التعبير الجيني ، مما يؤدي إلى تكاثر خلوي غير طبيعي ، وغزو ، ورم خبيث ، وتنشيط مسارات مقاومة الأدوية^{3،18،19،20}. يمكن أن تؤدي الطفرات داخل مجمعات إعادة تشكيل الهيستونات أو الكروماتين إلى تغيير النمط الظاهري للخلية ، مما يساهم في تحول الأورام. يعد تراكم التغيرات اللاجينية ، مثل مثيلة الهيستون ، عاملا رئيسيا في تنشيط مسارات مقاومة الأدوية^21،22،23. تؤثر الطفرات داخل مجمع SWI / SNF ، الذي يتكون من 15 وحدة فرعية مشفرة بواسطة 29 جينا ، على أكثر من 20٪ من السرطانات البشرية عبر العديد من أنواع الأورام. في العقد الماضي ، تم تطوير استراتيجيات الأدوية القائمة على علم التراث (epi-drugs) ، وتمت الموافقة على العديد من الأدوية التي تستهدف السرطان بأنماط غير طبيعية لتعديل الهيستون من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) ²³.

يعد تحليل بروتينات الهيستون أمرا صعبا للغاية ، مما يجعله مجالا متطلبا للدراسة. في الآونة الأخيرة ، أصبحت طرق قياس الطيف الكتلي هي الطريقة المفضلة لتوصيف ودراسة الأشكال البروتينية الهيستونية. ومع ذلك ، فإن ظروف الاستخراج الصارمة ، جنبا إلى جنب مع ضعف قابلية الذوبان لبعض المتغيرات وتماثل التسلسل العالي ، تجعل تحليلها صعبا.

في العقد الماضي ، تم تطوير العديد من الطرق القائمة على قياس الطيف الكتلي لتنميط الهيستون والتحقيق^{فيه 24،25،26،27}. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة وموثوقة لإنشاء خريطة ثنائية الأبعاد للأشكال البروتينية الهيستونية ، والتي يمكن أن تعزز فرص اكتشاف تعديلات جديدة بعد الترجمة.

يجمع الرحلان الكهربائي 2D TAU بين الفصل في الظروف الحمضية مع SDS PAGE. في البعد الأول ، تعطي الحالة الحمضية للوسط شحنة موجبة صافية للبروتينات الأساسية. نظرا لأن الهستونات هي بروتينات أساسية للغاية ولها نقطة متساوية كهربية أعلى (pH) مقارنة بالوسط ، فإنها تصبح موجبة الشحنة وتهاجر تحت مجال كهربائي. في البعد الثاني ، يتم تغيير طبيعة الهستونات بواسطة SDS وفصلها بناء على وزنها الجزيئي. يمكن استخدام الخريطة ثنائية الأبعاد الناتجة كأداة لإثراء أشكال بروتينية محددة بدقة بقعة واحدة لتحليل قياس الطيف الكتلي والدراسات المناعية^28،29. بعد الرحلان الكهربائي ، يمكن إزالة بقع TAU ثنائية الأبعاد وهضمها بالتربسين وتحليلها عن طريق قياس الطيف الكتلي. بدلا من ذلك ، يمكن مسح خريطة 2D TAU على مرشح النيتروسليلوز / PVDF والتحقيق فيها عن طريق التلوين المناعي²⁷.

في هذا السياق ، قد تكون الأساليب استراتيجية لتحسين تحديد وتحليل التعديلات الجديدة بعد الترجمة المرتبطة بإعادة الأسلاك الأيضية^30،31.

لقد قمنا بتحسين الطريقة الأصلية من خلال دمج خطوة صوتنة ، وهو أمر مفيد لتدهور الحمض النووي وتحسين قابلية ذوبان البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بإطالة خطوة الحضانة لاستخراج الهيستون ، من أجل الحصول على عينة بروتين عالية النقاء. علاوة على ذلك ، في بروتوكولنا ، قمنا بتشغيل البعد الأول بجهد منخفض لفترة أطول لتحقيق دقة أفضل. تم استخدام الجل الناتج للتحقيق في الهستونات الكنسية PTMs وتوصيف التعديلات الجديدة مثل الجليكيشن^10،32.

بشكل عام ، قمنا بتطوير طريقة لاستخراج وتنقية الهستونات ، متبوعة بتحليل الأشكال البروتينية الهيستونية باستخدام خريطة ثنائية الأبعاد. يتضمن العمل أيضا إجراء للهضم داخل الهلام لتحليل قياس الطيف الكتلي وخطوات تحليل اللطخة الغربية ثنائية الأبعاد.

Protocol

1. استخراج هيستون

1. قم بإجراء استخراج الهيستون من 1 × 10⁶ خلايا على الأقل ، والتي تتجمع بنسبة 80٪. في هذه التجربة ، استخدمنا خطوط خلايا MCF-10A من ATCC. بعد الطلاء ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1x. قم بتنفيذ جميع الخطوات على الجليد.
2. قم بإعداد مخزن مؤقت لتحلل الخلية يحتوي على 10 ملي مولار Tris-HCl pH 8.0 و 1 ملي مولار KCl و 1.5 ملي ملي MgCl₂. أضف 1 ملي مولار من ديثيوإريثريتول ومثبطات البروتياز والفوسفاتيز قبل الاستخدام مباشرة.
3. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية إلى طبق بتري المحتوي على الخلية ، واكشط الخلايا واجمعها في أنبوب 1.5 مل ، ثم احتضن على دوار عند 300 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة ساعة.
4. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا مع دوار لأنابيب 1.5 مل.
5. اغسل الحبيبات ب 400 ميكرولتر من عازلة تحلل الخلية وأجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية. كرر خطوة الغسيل 3x.
   ملاحظة: استخدم جهاز طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا (4 درجات مئوية) مع دوار لأنابيب سعة 1.5 مل لجميع الخطوات. تعامل مع الحبيبات بعناية لتجنب فقدان المواد.
6. أعد تعليق الحبيبات في 640 ميكرولتر من 0.2 م H₂SO₄ واحتضانها على دوار عند 300 دورة في الدقيقة ، عند 4 درجات مئوية ، لمدة 16 ساعة.
   تنبيه: حامض الكبريتيك مادة كيميائية خطرة. يرجى استخدامه تحت غطاء الدخان الكيميائي.
7. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وقم بتخزينها حتى الخطوات التالية. تخلص من الحطام النووي.
8. قم بترسيب الهستونات بإضافة 212 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك ، قطرة قطرة (التركيز النهائي ل TCA هو 33٪). امزج المحلول عن طريق قلب الأنبوب 10x. احتضن على الجليد ، في الظلام ، لمدة 16 ساعة.
   تنبيه: TCA مادة كيميائية خطرة. استخدم تحت غطاء الدخان الكيميائي.
9. هيستونات الحبيبات عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية واغسل الحبيبات 3x ب 200 ميكرولتر من الأسيتون البارد.
10. أعد تعليق الحبيبات مع الأسيتون البارد ، ثم صوتنة عالية الطاقة 2x مع 3 دورات من 30 ثانية تشغيل / إيقاف ، بالتناوب مع توقف لمدة 10 دقائق على الجليد.
    ملاحظة: تم إجراء العملية باستخدام الموجات فوق الصوتية. هذه الخطوة ضرورية للتخلص من الحمض النووي الملفوف بالهيستون.
11. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من الأسيتون ، وأعد تعليق العينة في 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. حدد تركيز البروتين باستخدام طريقة فحص برادفورد ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة³³.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، تبدو الحبيبات أحيانا بيضاء أو شفافة. يمكن أن يشير الراسب الأبيض وغير الشفاف إلى وجود ملوثات ملحية قد تضعف الفصل ثنائي الأبعاد. إذا كان الأمر كذلك ، كرر خطوات غسل الأسيتون حتى تصبح الحبيبات شفافة.
12. قم بتجميد 70 ميكروغرام من الهستونات ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اضبط المجفف على 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. تحقق من حجم الأنبوب وكرر الخطوة عند 30 درجة مئوية حتى يتم تجميد العينة بالكامل (بشكل عام ، 90 دقيقة ضرورية لتجميد العينة بالكامل). بعد 60 دقيقة ، تحقق من مستوى الصوت كل 10 دقائق لأن العملية تعتمد على العينة.
    ملاحظة: إذا كانت كمية بروتينات الهيستون منخفضة ، فابدأ من 2 × 10⁶ خلايا. في هذه الحالة ، استخدم نفس حجم الكواشف المستخدمة ل 1 × 10⁶ خلايا. تحقق من نقاء جميع المواد الكيميائية المستخدمة أثناء الإجراء ؛ يجب أن تكون جميع الكواشف من درجة HPLC.

2. الرحلان الكهربائي الكهربائي لمصغرة 2D هلام تريتون حمض اليوريا (TAU)

1. قم بإعداد جل صغير TAU لنظام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد العمودي المصغر كما هو موضح أدناه.
   1. تحضير جل الفصل: 6 م يوريا ، 15٪ أكريلاميد / بيساكريلاميد (29: 1) ، 5٪ حمض جليدي أسيتيك ، 0.25٪ تريتون X-100 (حجم / حجم) ، 0.4٪ TEMED (حجم / حجم) ، 0.1٪ APS (p / v). لتحضير المحلول ، قم بإذابة اليوريا في مادة الأكريلاميد / مكرر و 1 مل من الماء عالي النقاء مع تحريك لطيف في درجة حرارة الغرفة ؛ أضف المكونات الأخرى واضبط مستوى الصوت. للحصول على جل صغير TAU ، قم بإعداد 10 مل من المحلول. املأ ألواح الجل المحددة مسبقا بالمحلول ، وتجنب تكوين فقاعات الهواء على بعد 1.5 سم فقط من الأعلى. قم بتغطية المحلول ب 1 مل من الأيزوبروبانول لتسوية الجل.
   2. تحضير جل التكديس: 6 M Urea ، 6٪ أكريلاميد / بيساكريلاميد (29: 1) ، 5٪ حمض جليدي أسيتيك ، 0.25٪ Triton X-100 (حجم / حجم) ، 0.4٪ TEMED (حجم / حجم) ، 0.1٪ APS (p / v). لتحضير المحلول ، قم بإذابة اليوريا في مادة الأكريلاميد / مكرر و 1 مل من الماء عالي النقاء ؛ أضف المكونات الأخرى واضبطها على مستوى الصوت. املأ ألواح الجل بمحلول التكديس ، ضع مشطا جليا بسعة 10 آبار بين الألواح ، وأدخله حتى يأتي محلول الجل في منتصف أسنان المشط. اسمح للهلام بالبلمرة لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: أدخل المشط بعناية لضمان التكوين المنتظم للآبار.
2. قم بإعداد 100 ميكرولتر من عينة TAU عن طريق إذابة 6 M من اليوريا ، و 5٪ من الحمض الجليدي الخليك ، والماء المقطر المزدوج. قم بإذابة العينة المجففة بالتجميد المحضرة في 30 ميكرولتر من عينة TAU.
3. املأ الكاسيت الصغير بمخزن مؤقت يعمل TAU ، وتركيز نهائي لحمض الأسيتيك بنسبة 5٪. اشطف آبار TAU-gel بحقنة مملوءة بمحلول تشغيلي وقم بتحميل العينة في البئر باستخدام ماصة دقيقة.
4. قم بتوصيل الغرفة الكهربائية بمصدر الطاقة ، مع وضع القطب الموجب (الأحمر) في الأسفل. انتبه ، عندما يكون IP > درجة الحموضة ، تكون البروتينات موجبة الشحنة ، وبالتالي فإن الهجرة تكون من القطب الموجب إلى القطب السلبي. قم بتشغيل الجل أولا عند 30 فولت لمدة 70 دقيقة ، ثم بجهد ثابت يبلغ 25 فولت لمدة 17 ساعة.
   ملاحظة: خلال هذا الوقت ، قم أحيانا بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وشطف آبار الجل باستخدام حقنة يمكن التخلص منها. انتبه لإزالة أي فقاعات من السطح السفلي للهلام باستخدام حقنة لتجنب فقدان العينة ووجود تلطيخ في البروتينات التي تم حلها.
5. قم بإزالة الجل من ألواح الجل وقطع خط الاهتمام بمشرط نظيف. تعامل مع الجل بعناية لتجنب كسر الجل. نظرا لأن خط الاهتمام عديم اللون ، قم بتحميل العينة في البئر رقم 1 لتحديد مسار الاهتمام وقطعه بدقة.
   ملاحظة: للتحقق من الفصل على هلام MINI TAU ، قم بإعداد العينة وتشغيلها في نسختين. يمكن تلطيخ أحد هذه المواد الهلامية باستخدام Coomassie Brilliant Blue. تم الإبلاغ عن نمط الانفصال في الشكل 1 أ.
6. اغسل الممر ب 15 مل من 0.5 M Tris-HCl pH 8.8 لمدة 15 دقيقة.
7. تحضير 15 مل من المخزن المؤقت للتوازن 1 باستخدام 6 M Urea و 0.5 M Tris-HCl و pH 6.8 و 30٪ glycerol و 20٪ SDS و 2٪ Dithioerythritol. قم بإعداد 15 مل من المخزن المؤقت للتوازن 2 ، باستخدام 6 M Urea ، و 0.5 M Tris-HCl ، و pH 6.8 ، و 30٪ جلسرين ، و 20٪ SDS ، و 2٪ يودوأسيتاميد. تحضير المخزن المؤقت للتوازن 1 و 2 قبل الاستخدام مباشرة ؛ قم بتخزين المخزن المؤقت للتوازن 2 في الظلام.
8. احتضان حارة الجل ، تحت تحريض لطيف ، في 10 مل من عازلة التوازن 1 لمدة 15 دقيقة ، ثم صبها. احتضن حارة الجل ، تحت التحريك اللطيف ، مع 10 مل من المخزن المؤقت للتوازن 2 لمدة 15 دقيقة في الظلام ، ثم صبها.
9. قم بإعداد جل أكريلاميد SDS 15٪ باتباع الجدول 1. قم بإعداد لوحة الجل واملأها بمحلول الجل المحلل. املأ المحلول حتى يصبح على بعد 1.5 سم من نهاية صفيحة الهلام الطويلة. ضع 1 مل من الأيزوبروبانول على السطح لتسوية الجل والسماح له بالبلمرة.
10. بعد بلمرة الهلام ، صب الأيزوبروبانول وجفف البئر باستخدام ورق كروماتوغرافيا السليلوز 3 مم. أدخل الممر الناتج من الخطوة 8 في بئر الجل.
11. أغلق الممر إلى هلام المحلول القابل للحل بمحلول مانع للتسرب من 0.5٪ من نقطة انصهار منخفضة في 1x Tris / glycine / SDS و 5 ميكرولتر من 0.003٪ بروموفينول أزرق. اسمح ببلمرة هلام الاغاروز لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: تجنب تكوين فقاعات الهواء أثناء ختم الاغاروز لمنع تلطيخ الجل.
12. ضع ألواح الجل في الكاسيت واملأها بمخزن مؤقت 1x Tris / glycine / SDS. مرري الجل على حرارة 120 فولت حتى تصل الصبغة الزرقاء البروموفينول إلى القاع. قم بإزالة الجل برفق من الألواح ، وتخلص من فائض الاغاروز ، وصمة عار الجل الفضي باستخدام إجراء متوافق مع قياس الطيف الكتلي أو لطخة للفحص المناعي.

3. تلطيخ الفضة ³²

1. تحضير الكواشف التالية - التثبيت: 50٪ ميثانول ، 5٪ حمض الأسيتيك ، 45٪ ماء منزوع الأيونات ؛ محلول الغسيل: 50٪ ميثانول ، 50٪ ماء منزوع الأيونات ؛ المحسس: 0.02٪ Na₂S₂O₃ 5H₂O في الماء منزوع الأيونات ؛ كاشف الفضة: 0.1٪ نترات الفضة في الماء البارد (4 درجات مئوية) منزوع الأيونات ؛ المطور: 0.04٪ فورمالين و 2٪ Na₂CO₃ ، الفورمالديهايد (37٪) (أضف قبل الاستخدام مباشرة) 0.4 مل ماء منزوع الأيونات وملء ما يصل إلى 1000 مل ؛ كاشف التوقف: 5٪ حمض الخليك. محلول تخزين الجل: 1٪ حمض الأسيتيك.
   ملاحظة: نظرا لأن المواد الكيميائية المستخدمة في التلوين خطرة ، فقم بتنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء الدخان الكيميائي.
2. اتبع الإجراء الوارد في الجدول 2 مع مراعاة ما يلي. أداء جميع الحضانات مع التحريض اللطيف. تحضير كاشف التوقف قبل البدء في خطوة التطوير ؛ سيضمن ذلك تطوير الجل بكثافة مناسبة. خلال خطوة التطوير ، ستظهر البقع على شكل إشارات صفراء ستصبح بنية فاتحة في نهاية الحضانة. تعتمد شدة البقع المختلفة على كمية الأشكال البروتينية هيستون. الجل جاهز لاستئصال البقع والهضم داخل الهلام (الشكل 1 ب)

4. الهضم في الهلام

1. تحضير الحلول التالية: 50 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم (NH₄HCO3) / 50٪ (v / v) أسيتونيتريل ؛ 10 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) في 50 ملي NH₄HCO₃ ؛ 55 ملي مولار يودوأسيتاميد (IAA) في 50 ملي NH₄HCO₃ ؛ 0.1٪ TFA ؛ 50 ملي نيو هامش₄HCO₃ ، درجة الحموضة 8 ؛ HPLC الصف الأسيتونيتريل ؛ 1 مل أنابيب السيليكون.
   ملاحظة: للتحايل على تلوث الكيراتين البشري ، من الشعر أو الجلد ، استخدم قفازات نظيفة واعمل في منطقة نظيفة.
2. استئصال بقع الهيستون ذات الأهمية من الجل الملون باستخدام مشرط نظيف وضعها في أنبوب سيليكون جديد (1.5 مل). احرص على استئصال بقعة واحدة ووضعها في أنبوب واحد لتجنب التلوث المتساوي الشكل.
3. أضف إلى كل بقعة هلامية 250 ميكرولتر من 50 ملي مولار NH₄HCO₃/50٪ أسيتونيتريل واحتضنه تحت التحريك اللطيف في خلاط حراري في درجة حرارة الغرفة. صب المحلول وكرر هذه الخطوة 3x. ستظهر قطع الجل شفافة.
4. تجفيف بقع الجل عن طريق إضافة الأسيتونيتريل (200 ميكرولتر). في هذه المرحلة ، ستأخذ قطع الجل لونا أبيض معتما.
5. صب الأسيتونيتريل واتركه يجف في الهواء لمدة 10 دقائق. ستظهر قطعة الجل جافة في الأنبوب. الاختزال والألكلة ليسا ضروريين حيث تم تقليل بروتينات الهيستون وتؤلكل خلال خطوة التوازن.
6. أعد ترطيب بقع الجل في 20 ميكرولتر من محلول التربسين (0.1 ملي حمض الهيدروكلوريك) أو حجم كاف لتغطية قطع الجل. ضع الأنابيب في الخلاط الحراري واحتضانها ، تحت تحريض لطيف ، عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل حتى 16 ساعة.
7. انقل المادة الطافية التي تحتوي على الببتيدات التربتية إلى أنبوب جديد. أضف 50 ميكرولتر من محلول الاستخراج (60٪ أسيتونيتريل ، 1٪ TFA) إلى قطع الجل وصوتنة 2x في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
8. انقل المادة الطافية ، التي تحتوي على ببتيدات تربتيك إضافية ، إلى الأنبوب الجديد. استخدم مجفف التجفيد لتجفيف الببتيدات المستخرجة المجمعة. اضبط المجفف بالتجميد على 30 درجة مئوية وجفف المحلول ؛ ستظهر حبيبات مجففة بالتجميد في الأنبوب.
   ملاحظة: تعتمد هذه الخطوة على مستوى الصوت. بشكل عام ، 1 ساعة كافية ، لكن تحقق من الحجم كل 10 دقائق حتى تجف العينة تماما.
9. أضف 15 ميكرولتر من 0.1٪ TFA إلى كل أنبوب واحتضانه برفق في خلاط حراري عند 25 درجة مئوية. انقل المادة الطافية إلى القارورة لتحليل LC-MS / MS.

5. 2DTAU لطخة الغربية

1. قم بإعداد المخزن المؤقت للنقل ، 250 ملي مولار قاعدة تريس ، 92 ملي مولار جلايسين ، و 10٪ ميثانول باستخدام الماء المقطر المزدوج.
2. قطع غشاء النيتروسليلوز وورق الترشيح إلى أبعاد الجل.
3. قم بموازنة الجل وانقع الغشاء وورق الترشيح وأوراق الترشيح في مخزن النقل المؤقت لمدة 15 دقيقة. استخدم إما أغشية النيتروسليلوز أو PVDF. في حالة استخدام أغشية PVDF (ثنائي فلوريد البولي فينيلدين) ، قم بتنشيطها عن طريق النقع في 100٪ MetOH.
4. قم بإعداد شطيرة الجل في الكاسيت لنقل شبه جاف على النحو التالي: قطب كهربائي سالب / ورق ترشيح / جل / غشاء نيتروسليلوز / ورق ترشيح / قطب موجب. قم بإزالة أي فقاعات هواء بين الجل والغشاء لضمان نتائج جيدة.
5. ضع الكاسيت في وحدة شبه جافة وقم بتشغيل اللطخة عند 25 فولت لمدة 30 دقيقة. في النهاية ، قم بتفكيك شطيرة النشاف وتخزين الغشاء للفحص المناعي. تحقق من كفاءة النقل باستخدام تلطيخ بونسو. ضع علامة على الغشاء بعلامة في أعلى اليمين للحفاظ على اتجاه المرشح الصحيح.
6. احتضان الأجسام المضادة الأولية والثانوية اعتمادا على التجربة (الشكل 2).

النتائج

في الشكل 1 أ ، من الممكن ملاحظة كيفية هجرة بروتينات هيستون في هلام 1D. هذه خطوة أولية مهمة لفهم وقت تشغيل البعد الأول. بمجرد تحديد الوقت المناسب للفصل ، قم بتشغيل البعد الثاني. تظهر الخريطة ثنائية الأبعاد للأشكال البروتينية الهيستونية نمطا طبوغرافيا مميزا ...

Discussion

في العقد الماضي ، حدث ثورة في علاج مرضى السرطان من خلال تحديد التغيرات الجزيئية المختلفة التي تدفع تطور السرطان وتطوره. أهم تقدم في علم الأورام الحديث هو تطوير العلاج القائم على التحليل الجزيئي الشامل. لعبت التطورات التكنولوجية في علم الجينوم والبروتينات دورا حاسما في ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	SIGMA- ALDRICH	D8255	Reagent for maintaining −SH groups in the reduced state; quantitatively reduces disulfides.
1,5 M Tris-HCL buffer, pH 8.8	BIO-RAD	161-0798	Resolving Gel Buffer
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD	1610772	Use this premixed 10x Tris/glycine/SDS running buffer to separate protein samples by SDS-PAGE.
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	33539	2-Propanol (Isopropanol) is a secondary alcohol. It has been tested as a substitute to fuel for use in various fuel cells. CuO powder dissolved in 2-propanol has been used for the laser ablation assisted synthesis of Cu colloids. Suspension of 2-propanol with Zn(NO3)2 has been employed for the fabrication of titanium dioxide-coated stainless steel (P25-TiO2/SS) photoanode coated with uniformly thick layer of P25-TiO2.This photoanode was used for the electrochemical photocatalytic (ECPC) degradation process.
30% Acrylamide/Bis Solution	BIO-RAD	1610158	2.6% Crosslinker. Electrophoresis purity reagent
Acetic Acid Glacial	Carlo Erba Reagennts	401392	Acetic acid is an important chemical reagent with many industrial applicatios.
Acetone	Panreac Applichem	211007.1214	Acetone is a solvent, renowned for its versatility in various laboratory, manufacturing, and cleaning applications.
Acetonitile	VWR	83640320	for HPLC   LC-MS grade
Agarose	Invitrogen	15510-027	Agarose is a heteropolysaccharide  frequently used in molecular biology.
Ammonium bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	A6141	minimum 99,0%
Ammonium persulfate	SIGMA-ALDRICH	A3678	For molecular Biology, For electrophoresis, ≥98%
Bioruptor plus	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	sonicator
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	Reducing agent used to reduce disulfide bonds in proteins.
Dodeca Silver Stain Kit	BIO-RAD	161-0480	The Dodeca silver stain kit is easy-to-use for the detection of nonagram levels of proteins in polyacrylamide gels.
Glycerol	GE - Healthcare Life Sciences	171325010L	Glycerol is a simple triol compound, it is involved to aid in casting gradient gels, protein stabilizer and storage buffer component.
Halt Phosphatase Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail preserves the phosphorylation state of proteins during and after cell lysis or tissue protein extraction  Single- Use Cocktail (100X).
Halt Protease Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) are ready-to-use concentrated stock solutions of protease inhibitors for addition to samples to prevent proteolytic degradation during cell lysis and protein extraction. Single- Use Cocktail (100X).
Hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReagent, for molecular biology
Iodoacetamide	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥99% (NMR), crystalline
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	Potassium chloride, KCl, is generally used in laboratory routines. Its use as a storage buffer for pH electrodes and as a reference solution for conductivity measurements is well established.
MCF10 cell line	atcc	CRL-10317	epithelial cell line that was isolated in 1984 from the mammary gland of a White, 36-year-old female with fibrocystic breasts. This cell line was deposited by the Michigan Cancer Foundation.
MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	Magnesium chloride is a colorless crystalline solid.
N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamine	SIGMA-ALDRICH	T9281	For Electrophoresis, approx. 99%
Phosphate saline buffer 1X	Corning	15373631	1 X PBS (phosphate buffered saline) is a buffered balanced salt solution used for a variety biological and cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Potassium hexacyanoferrate	SIGMA-ALDRICH	60299	Electron acceptor, employed in systems involving electron transport,
SDS Solution 20% (w/v)	BIO-RAD	161-0418	Sodium dodecyl sulfate. Electrophoresis purity reagent
Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%	SIGMA- ALDRICH	21,726-3	Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%
Sulfuric acid	SIGMA-ALDRICH	339741	Sulfuric Acid, Reagent, is an extremely corrosive acid that comes as yellowy slightly viscous liquid. It is soluble in water and is a diprotic acid. It has very strong corrosive, dehydrating and oxidizing properties as well as being hygroscopic.
Trichloroacetic acid	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	Trichloroacetic acid (TCA) is used as a reagent for the precipitation of proteins1,2 and nucleic acids3.
Trifluoroacetic acid	Riedel-de Haën	34957	Trifluoroacetic acid
Triton X-100	SIGMA- ALDRICH	T9284-1L	Triton X-100 is a nonionic polyoxyethylene surfactant that is most frequently used to extract and solubilize proteins.
Trypsin from porcine pancreas	SIGMA-ALDRICH	T6567	Proteomics Grade, BioReagent, Dimethylated
UREA	SIGMA-ALDRICH	33247	Urea is a chaotropic agent and is used for protein denaturation. It disturbs the hydrogen bonds in the secondary, tertiary and quaternary structure of proteins. It can also disturb hydrogen bonding present in DNA secondary structure