2D-TAU 젤 전기영동을 이용한 히스톤 프로테오폼 공개

요약

이 방법은 히스톤 단백질형 특성화 및 조사를 위한 간단하고 빠른 전략을 설명합니다.

초록

히스톤은 메틸화(methylation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation), 아실화(acylation) 및 유비퀴틴화(ubiquitination)와 같은 다양한 번역 후 변형(PTM)을 거쳐 뉴클레오솜 역학을 제어하고 세포의 운명을 결정합니다. 염색질의 기능 단위인 뉴클레오솜은 DNA, 구상핵을 구성하는 4쌍의 히스톤(H3, H4, H2A, H2B), 염색질 구조를 안정화하는 링커 히스톤 H1으로 구성됩니다. 히스톤의 아미노(N) 말단 꼬리는 구상 코어 도메인에서 돌출되어 염색질 지형에 영향을 미치는 뚜렷한 PTM을 거칩니다. 일부 증거는 히스톤 PTM 항상성이 모든 생리적 활동을 보존하는 데 중요하다는 것을 시사합니다. 히스톤 PTM의 탈조절은 비정상적인 세포 증식, 침입 및 전이의 주요 원인입니다. 따라서 히스톤 PTM을 특성화하는 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 여기에서는 히스톤 동형을 분리하고 분석하기 위한 효과적인 기술에 대해 설명합니다. 두 개의 직교 분리의 조합을 기반으로 하는 이 방법은 히스톤 동형의 농축과 다음과 같은 질량 분석 식별을 가능하게 합니다. Shechter et al.이 원래 설명한 이 기술은 크기와 전하에 따라 염기성 히스톤 단백질을 분리할 수 있는 산-우레아 폴리아크릴아미드 겔(TAU-GEL)과 분자량에 따라 단백질을 분리할 수 있는 도데실나트륨 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE)을 결합합니다. 그 결과 히스톤 동형의 2차원 지도가 생성되었으며, 이는 인젤 분해에 적합하며 질량 분석법 식별 및 웨스턴 블롯 분석이 뒤따릅니다. 그 결과 히스톤 동형의 2차원 지도가 생성되었으며, 이는 겔 내 소화에 이어 질량 분광법 식별 및 웨스턴 블롯 분석에 적합합니다. 이 단백질체 접근법은 단일 히스톤 동형을 농축하고 새로운 히스톤 PTM을 특성화할 수 있는 강력한 방법입니다.

서문

암 발병, 진행 및 화학 저항성은 히스톤 PTM을 포함한 유전 및 후성 유전 학적 사건과 관련이 있습니다. 히스톤은 염색질 역학을 조절하고 세포의 운명을 지시하는 다양한 PTM을 겪습니다¹.

뉴클레오솜(nucleosome)은 염색질의 기능 단위이며 DNA가 핵으로 패키징될 수 있도록 하는 DNA와 단백질의 분자 복합체입니다. 뉴클레오솜 코어를 구성하는 4쌍의 히스톤(H3, H4, H2A, H2B)과 염색질 구조를 안정화하는 데 도움이 되는 링커 히스톤 H1으로 구성됩니다. 히스톤 아미노(N) 말단 꼬리는 구형 코어 도메인에서 돌출되어 염색질 조경에 영향을 미치는 특정 번역 후 변형을 겪습니다².

지금까지 적어도 23 종류의 히스톤 PTM이 알려져 있습니다. 이러한 PTM은 주로 메틸화, 아세틸화, 인산화, 글리코실화, 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화로 구성되는 공유 변형입니다³. 또한, 후성유전체 항상성과 대사 재배전 사이의 긴밀한 상관관계가 최근에 제안되었으며, 이는 가능한 히스톤 수 PTM의 기하급수적인 증가를 설명합니다 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 변형 효소에 의해 증착, 삭제 및 형질전환된 히스톤 PTM은 각각 writers, erasers 및 readers로 명명됩니다. 이는 염색질 구조의 물리적, 화학적 특성에 영향을 미치며, 종양 억제 유전자 및 종양 유전자 14,15,16의 발현을 포함한 유전자 발현 프로파일에 영향을 미칩니다.

히스톤 프로테오폼의 수는 히스톤 변이체로 뉴클레오솜에 통합될 때 증가합니다. 이러한 변이체는 표준 히스톤의 비대립형질 이소형이며 염색질의 화학적, 물리적 특성을 변경하여 복잡성을 추가합니다. 표준 히스톤과 비교하여, 히스톤 변이체는 고유한 번역 후 변형을 겪거나 특정 염색질 성분과 상호 작용하는 기능적 도메인을 가지고 있어 뉴클레오솜¹⁷의 역학 및 안정성에 영향을 미칩니다.

암세포에서 히스톤 PTM 및 변이체의 탈조절은 유전자 발현 프로파일에 영향을 미쳐 비정상적인 세포 증식, 침입, 전이 및 약물 내성 경로의 활성화로 이어집니다 3,18,19,20. 히스톤 또는 염색질 리모델링 복합체 내의 돌연변이는 세포 표현형을 변화시켜 종양 변형에 기여할 수 있습니다. 히스톤 메틸화와 같은 후성유전학적 변형의 축적은 약물 내성 경로를 활성화하는 핵심 요인입니다 21,22,23. 29개의 유전자로 암호화된 15개의 소단위로 구성된 SWI/SNF 복합체 내의 돌연변이는 많은 종양 유형에 걸쳐 인간 암의 20% 이상에 영향을 미칩니다. 지난 10년 동안 후성유전학 기반 약물 전략(epi-drugs)이 개발되었으며, 비정상적인 히스톤 변형 패턴을 가진 암을 표적으로 하는 많은 약물이 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았습니다²³.

히스톤 단백질의 분석은 매우 까다롭기 때문에 까다로운 연구 분야입니다. 최근에는 질량 분석 방법이 히스톤 단백질형을 특성화하고 연구하는 데 선호되는 방법이 되었습니다. 그러나 일부 변이체의 낮은 용해도와 높은 염기서열 상동성과 함께 급격한 추출 조건으로 인해 분석이 까다로워집니다.

지난 10 년 동안 히스톤 프로파일 링 및 조사를 위해 여러 질량 분석 기반 방법이 개발되었습니다^{24 , 25 , 26 , 27} . 이 연구에서는 히스톤 단백질형의 2차원 지도를 만드는 비용 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 제시하여 새로운 번역 후 변형을 발견할 가능성을 높일 수 있습니다.

2D TAU 전기영동은 산성 조건에서의 분리와 SDS PAGE를 결합합니다. 첫 번째 차원에서 매질의 산성 조건은 염기성 단백질에 순 양전하를 제공합니다. 히스톤은 매우 기본적인 단백질이고 매질에 비해 등전점(pH)이 높기 때문에 양전하를 띠고 전기장 아래로 이동합니다. 두 번째 차원에서 히스톤은 SDS에 의해 변성되고 분자량에 따라 분리됩니다. 결과 2D 맵은 질량 분석 및 면역학 연구를 위해 단일 지점 해상도에서 특정 단백질형을 풍부하게 하는 도구로 사용할 수 있습니다^28,29. 전기영동 후 2D TAU 스폿을 염색하고 트립신을 분해하며 질량 분석법으로 분석할 수 있습니다. 또는 2D TAU 맵을 니트로셀룰로오스/PVDF 필터에 블롯팅하고 면역염색²⁷로 조사할 수 있습니다.

이러한 맥락에서, 이 방법은 대사 재배선과 관련된 새로운 번역 후 변형의 식별 및 분석을 개선하기 위해 전략적일 수 있습니다^30,31.

우리는 DNA 분해 및 단백질 용해도 개선에 도움이 되는 초음파 처리 단계를 통합하여 원래 방법을 더욱 개선했습니다. 또한, 우리는 고순도의 단백질 샘플을 얻기 위해 히스톤 추출을 위한 배양 단계를 연장했습니다. 또한, 우리의 프로토콜에서는 더 나은 해상도를 달성하기 위해 더 오랜 시간 동안 저전압에서 1차원을 실행했습니다. 생성된 겔은 표준 히스톤 PTM을 조사하고 당화^10,32와 같은 새로운 변형을 특성화하는 데 사용되었습니다.

전반적으로, 우리는 히스톤을 추출하고 정제하는 방법을 개발했으며, 그 다음에는 2차원 지도를 사용하여 히스톤 단백질형을 분해했습니다. 이 작업에는 질량 분석 분석을 위한 인겔 분해 절차와 2차원 웨스턴 블롯 분석 단계도 포함됩니다.

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프로토콜

1. 히스톤 추출

1. 80% 융합된 최소 1 x 10⁶ 세포에서 히스톤 추출을 수행합니다. 이 실험에서는 ATCC의 MCF-10A 세포주를 사용했습니다. 도금 후 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS) 1x로 세포를 세 번 세척합니다. 얼음 위에서 모든 단계를 수행하십시오.
2. 10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM KCl 및 1.5mM MgCl₂를 포함하는 세포 용해 완충액을 준비합니다. 사용 직전에 1mM 디티오에리스리톨과 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제를 첨가하십시오.
3. 세포 함유 페트리 접시에 800μL의 세포 용해 완충액을 추가하고, 긁어내고, 1.5mL 튜브에 세포를 채취한 다음, 300rpm, 4°C의 회전체에서 1시간 동안 배양합니다.
4. 10,000 x g, 4 °C에서 1.5 mL 튜브용 로테이터가 있는 예냉각식 마이크로 원심분리기에서 10분 동안 원심분리합니다.
5. 400μL의 세포 용해 완충액과 원심분리기로 펠릿을 10,000 x g, 4°C에서 10분 동안 세척합니다. 상등액을 버리십시오. 세탁 단계를 3회 반복합니다.
   알림: 모든 단계에서 4ml 튜브용 로테이터가 있는 예냉식 미세 원심분리기(1.5°C)를 사용합니다. 재료 손실을 방지하기 위해 펠릿을 조심스럽게 다루십시오.
6. 펠릿을 0.2 M H₂SO₄ 의 640 μL에 재현탁시키고 300 rpm, 4 ° C, 16 시간 동안 회전체에서 배양합니다.
   주의 : 황산은 위험한 화학 물질입니다. 화학 흄 후드 아래에서 사용하십시오.
7. 16,000 x g, 4°C에서 10분 동안 원심분리기 상층액을 새 튜브에 옮기고 다음 단계까지 보관하십시오. 핵 파편을 버리십시오.
8. 212 μL의 트리클로로 아세트산을 한 방울 한 방울 첨가하여 히스톤을 침전시킵니다 (TCA의 최종 농도는 33 %). 튜브를 10번 뒤집어 용액을 혼합합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 16시간 동안 배양합니다.
   주의 : TCA는 유해 화학 물질입니다. 화학 흄 후드 아래에서 사용하십시오.
9. 4°C에서 10분 동안 16,000 x g 의 예냉각된 원심분리기에서 회전하여 히스톤을 펠릿화합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 200μL의 차가운 아세톤으로 3x 세척합니다.
10. 펠릿을 차가운 아세톤으로 재현탁시킨 다음 얼음 위에서 10분 동안 일시 중지하면서 30초 켜기/끄기의 3회 주기로 고출력을 2번 초음파 처리합니다.
    알림: 절차는 초음파기를 사용하여 수행되었습니다. 이 단계는 히스톤으로 감싼 DNA를 제거하는 데 필수적입니다.
11. 16,000 x g 에서 10분 동안 원심분리기를 하고 아세톤을 버리고 시료를 100μL의 이중 증류수에 재현탁합니다. 제조업체의 지침에 따라 Bradford 분석 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다³³.
    참고: 원심분리 후 펠릿이 때때로 흰색 또는 반투명하게 나타납니다. 흰색과 불투명한 침전물은 2D 분리를 손상시킬 수 있는 염 오염 물질의 존재를 나타낼 수 있습니다. 그렇다면 펠릿이 반투명해질 때까지 아세톤 세척 단계를 반복하십시오.
12. 제조업체의 지침에 따라 70μg의 히스톤을 동결 건조합니다. 동결 건조기를 30°C에서 60분 동안 설정합니다. 튜브 부피를 확인하고 샘플이 완전히 동결건조될 때까지 30°C에서 단계를 반복합니다(일반적으로 샘플을 완전히 동결건조하려면 90분이 필요함). 60분 후에는 프로세스가 샘플에 따라 다르므로 10분마다 부피를 확인합니다.
    참고 : 히스톤 단백질의 양이 적으면 2 x 10⁶ 세포에서 시작하십시오. 이 경우 1 x 10⁶ 세포에 사용된 것과 동일한 부피의 시약을 사용하십시오. 절차 중에 사용 된 모든 화학 물질의 순도를 확인하십시오. 모든 시약은 HPLC 등급이어야 합니다.

2. 미니 2D 젤 트리톤-산-우레아(TAU) 전기영동

1. 아래 설명된 대로 미니 수직 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 시스템을 위한 mini-TAU 겔을 준비합니다.
   1. 분리 젤 준비: 6M 요소, 15% 아크릴아미드/비스아크릴아미드(29:1), 5% 빙산 아세트산, 0.25% 트리톤 X-100(v/v), 0.4% TEMED(v/v), 0.1% APS(p/v). 용액을 준비하려면 아크릴아미드/비스에 요소를 녹이고 초순수 1mL를 실온에서 부드럽게 교반하여 용해시킵니다. 다른 구성 요소를 추가하고 볼륨을 조정합니다. 미니 TAU 젤의 경우 용액 10mL를 준비합니다. 미리 설정된 젤 플레이트에 용액을 채우고 상단에서 불과 1.5cm 떨어진 곳에 기포가 형성되지 않도록 합니다. 용액을 1mL의 이소프로판올로 덮어 젤의 수평을 만듭니다.
   2. 스태킹 젤 준비: 6M 요소, 6% 아크릴아미드/비스아크릴아미드(29:1), 5% 빙산 아세트산, 0.25% 트리톤 X-100(v/v), 0.4% TEMED(v/v), 0.1% APS(p/v). 용액을 준비하려면 아크릴아미드/비스와 초순수 1mL에 요소를 용해시킵니다. 다른 구성 요소를 추가하고 볼륨에 맞게 조정합니다. 젤 플레이트에 스태킹 용액을 채우고 플레이트 사이에 10웰 젤 빗을 놓고 젤 용액이 빗의 치아 중간까지 올라올 때까지 삽입합니다. 겔이 4°C에서 16시간 동안 중합되도록 합니다.
      알림: 우물이 규칙적으로 형성되도록 빗을 조심스럽게 삽입하십시오.
2. 6M 요소, 5% 빙산 아세트산 및 이중 증류수를 용해하여 100μL의 TAU 샘플 버퍼를 준비합니다. 준비된 동결건조된 시료를 30μL의 TAU 시료 완충액에 용해시킵니다.
3. 미니 카세트에 TAU 러닝 버퍼, 5% 아세트산 최종 농도를 채웁니다. 러닝 버퍼가 채워진 주사기로 TAU-gel의 웰을 헹구고 마이크로피펫을 사용하여 웰에 샘플을 로드합니다.
4. 전기 영동 챔버를 양극(빨간색) 전극이 바닥에 놓인 상태로 전원 공급 장치에 연결합니다. IP가 pH> 때 단백질은 양전하를 띠므로 양극에서 음극으로의 이동이 이루어집니다. 먼저 젤을 30V에서 70분 동안 실행한 다음 25V의 정전압에서 17시간 동안 실행합니다.
   알림: 이 시간 동안 때때로 전원 공급 장치를 끄고 일회용 주사기를 사용하여 젤 웰을 헹굽니다. 주사기를 사용하여 겔 바닥 표면에서 기포를 제거하는 데 주의하여 샘플이 손실되고 분해된 단백질에 번짐이 발생하지 않도록 하십시오.
5. 젤 플레이트에서 젤을 제거하고 깨끗한 메스로 관심 라인을 자릅니다. 젤이 파손되지 않도록 젤을 조심스럽게 다루십시오. 관심 선은 무색이므로 관심 선을 정확하게 식별하고 절단하기 위해 샘플을 웰 번호 1에 로드합니다.
   참고: mini-TAU gel의 분리를 확인하려면 샘플을 복제하여 준비하고 실행합니다. 이 젤 중 하나는 Coomassie Brilliant Blue를 사용하여 염색할 수 있습니다. 분리 패턴은 그림 1A에 보고되어 있습니다.
6. 15분 동안 0.5M Tris-HCl pH 8.8 mL로 레인을 세척합니다.
7. 15M 요소, 6M Tris-HCl, pH 6.8, 30% 글리세롤, 20% SDS 및 2% 디티오에리스리톨을 사용하여 15mL의 평형 완충액 2을 준비합니다. 15M 요소, 6.5M Tris-HCl, pH 6.8, 30% 글리세롤, 20% SDS 및 2% 요오도아세트아미드를 사용하여 2mL의 평형 완충액 2를 준비합니다. 사용 직전에 평형 버퍼 1 및 2를 준비합니다. 평형 버퍼 2를 어두운 곳에 보관하십시오.
8. 겔 레인을 부드러운 교반 하에서 10mL의 평형 완충액 1에 15분 동안 배양한 다음 디캔트합니다. 부드러운 교반 하에서 10mL의 평형 완충액 2를 어두운 곳에서 15분 동안 배양한 다음 디캔팅합니다.
9. 표 1에 따라 분해능 SDS 15% 아크릴아미드 겔을 준비합니다. 겔 플레이트를 설치하고 분해 겔 용액으로 채웁니다. 긴 젤 플레이트 끝에서 1.5cm 떨어질 때까지 용액을 채웁니다. 표면에 이소프로판올 1mL를 넣어 젤의 수평을 맞추고 중합되도록 합니다.
10. 겔 중합 후 이소프로판올을 디캔팅하고 3MM Chr 셀룰로오스 크로마토그래피 종이로 웰을 건조시킵니다. 8단계의 결과 레인을 젤 웰에 삽입합니다.
11. 1x Tris/glycine/SDS 완충액에 0.5% 저융점 아가로스의 밀봉 용액과 0.003% 브로모페놀 블루 5μL의 밀봉 솔루션으로 분해 겔에 레인을 밀봉합니다. 아가로스 겔 중합을 30분 동안 기다립니다.
    참고: 젤 번짐을 방지하기 위해 아가로스 밀봉 중 기포 형성을 피하십시오.
12. 겔 플레이트를 카세트에 넣고 1x Tris/glycine/SDS buffer를 채웁니다. 브로모페놀 블루 염료가 바닥에 도달할 때까지 120V에서 젤을 실행합니다. 플레이트에서 젤을 부드럽게 제거하고 과도한 아가로스를 버리고 질량 분석법과 호환되는 절차를 사용하여 겔을 실버 염색하거나 면역 분석을 위한 블롯을 사용합니다.

3. 실버 염색 ³²

1. 다음 시약을 준비하십시오 - 정착제 : 50 % 메탄올, 5 % 아세트산, 45 % 탈 이온수; 세척 용액 : 50 % 메탄올, 50 % 탈 이온수; 감작제 : 0.02 % Na₂S₂O₃ 5H₂O, 탈 이온수; 은 시약: 차가운(4°C) 탈이온수에 0.1% 질산은; 개발자 : 0.04 % 포르말린 및 2 % Na₂CO₃, 포름 알데히드 (37 %) (사용 직전 추가) 0.4 mL 탈 이온수 및 최대 1000 mL 충전; 정지 시약: 5% 아세트산; 겔 저장 용액 : 1 % 아세트산.
   알림: 염색에 사용되는 화학 물질은 위험하므로 화학 흄 후드 아래에서 모든 단계를 수행하십시오.
2. 다음 사항을 고려하여 표 2 의 절차를 따르십시오. 모든 배양을 부드러운 교반으로 수행합니다. 개발 단계를 시작하기 전에 정지 시약을 준비합니다. 이것은 적절한 강도로 젤 개발을 보장합니다. 현상 단계에서 반점은 배양이 끝나면 밝은 갈색으로 변하는 노란색 신호로 나타납니다. 다른 반점의 강도는 히스톤 단백질형의 양에 따라 달라집니다. 겔은 스팟 절제 및 겔 내 분해를 할 준비가 되었습니다(그림 1B)

4. 젤 내 소화

1. 다음 용액을 준비하십시오 : 50mM 중탄산 암모늄 (NH₄HCO3) / 50 % (v / v) 아세토 니트릴; 50 mM NH₄HCO₃ 중 10 mM 디티오트레이톨 (DTT); 50 mM NH에서 55 mM 요오드아세트아미드(IAA)4HCO3; 0.1% TFA; 50 mM NH₄HCO₃, pH 8; HPLC 등급 아세토니트릴; 1mL 실리콘 튜브.
   알림: 머리카락이나 피부로 인한 인체 각질 오염을 방지하려면 깨끗한 장갑을 사용하고 깨끗한 장소에서 작업하십시오.
2. 깨끗한 메스를 사용하여 염색된 젤에서 관심 히스톤 반점을 제거하고 새 실리콘 튜브(1.5mL)에 넣습니다. 동형 교차 오염을 방지하기 위해 단일 지점을 절제하고 단일 튜브에 넣도록 주의하십시오.
3. 각 겔 스폿에 250μL의 50mM NH₄HCO₃/50% 아세토니트릴을 첨가하고 실온의 열혼합기에서 부드럽게 교반하여 배양합니다. 용액을 디캔팅하고 이 단계를 3회 반복합니다. 젤 조각이 투명하게 나타납니다.
4. 아세토니트릴(200μL)을 첨가하여 겔 반점을 탈수합니다. 이 단계에서 젤 조각은 불투명한 흰색을 띱니다.
5. 아세토니트릴을 디캔팅하고 10분 동안 자연 건조시킵니다. 젤 조각은 튜브에서 건조된 것처럼 보일 것입니다. 환원 및 알킬화는 평형 단계에서 히스톤 단백질이 환원되고 알킬화되었기 때문에 필수적이지 않습니다.
6. 20μL의 트립신 용액(0.1mM HCl) 또는 겔 조각을 덮기에 충분한 부피로 겔 반점을 재수화합니다. 튜브를 써머 믹서에 넣고 37 °C에서 최소 4 시간에서 16 시간 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다.
7. 트립틱 펩타이드가 함유된 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 겔 조각에 추출 용액 50μL(60% 아세토니트릴, 1% TFA)를 추가하고 4°C에서 10분 동안 초음파 수조에서 2회 초음파 처리합니다.
8. 추가 트립틱 펩타이드를 함유한 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 동결 건조기를 사용하여 풀링된 추출된 펩타이드를 건조시킵니다. 동결 건조기를 30 °C로 설정하고 용액을 건조시킵니다. 동결건조된 펠릿이 튜브에 나타납니다.
   참고: 이 단계는 볼륨에 따라 다릅니다. 일반적으로 1 시간이면 충분하지만 샘플이 완전히 건조 될 때까지 10 분마다 부피를 확인하십시오.
9. 각 튜브에 15μL의 0.1% TFA를 추가하고 25°C의 써모믹서에서 부드럽게 배양합니다. LC-MS/MS 분석을 위해 상층액을 바이알로 옮깁니다.

5. 2DTAU 웨스턴 블롯

1. 이중 증류수를 사용하여 전달 완충액, 250mM Tris 염기, 92mM 글리신 및 10% 메탄올을 준비합니다.
2. 니트로 셀룰로오스 멤브레인과 여과지를 겔의 치수로 자릅니다.
3. 겔을 평형을 이루고 멤브레인, 여과지 및 여과지를 전사 완충액에 15분 동안 담급니다. 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인을 사용하십시오. PVDF(폴리비닐리덴 디플루오라이드) 멤브레인을 사용하는 경우 100% MetOH에 담가 활성화하십시오.
4. 반건조 전사를 위해 카세트에 젤 샌드위치를 다음과 같이 준비합니다: 음극/필터지/젤/니트로셀룰로오스막/필터지/양극. 좋은 결과를 보장하기 위해 젤과 멤브레인 사이의 기포를 제거하십시오.
5. 카세트를 반건조 장치에 놓고 25V에서 30분 동안 블롯을 실행합니다. 마지막에는 블로팅 샌드위치를 분해하고 면역 분석을 위해 멤브레인을 보관합니다. Ponceau staining으로 전달 효율을 확인하십시오. 오른쪽 상단에 멤브레인을 표시하여 올바른 필터 방향을 유지합니다.
6. 실험에 따라 1차 및 2차 항체로 배양합니다(그림 2).

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결과

그림 1A에서는 히스톤 단백질이 1D 겔에서 어떻게 이동하는지 관찰할 수 있습니다. 이것은 1차원의 실행 시간을 이해하기 위한 중요한 예비 단계입니다. 적절한 분리 시간이 결정되면 2차원을 실행합니다. 히스톤 원형의 2D 지도는 독특한 지형 패턴을 보여줍니다(그림 1B). 그림 1B의 각 반점은 특정 히스톤 ?...

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토론

지난 10년 동안 암 환자 치료법은 암 발병과 진행을 주도하는 다양한 분자 변화를 확인함으로써 혁명을 일으켰습니다. 현대 종양학에서 가장 중요한 발전은 포괄적인 분자 분석을 기반으로 한 치료법의 개발입니다. 유전체학 및 단백질체학의 기술 발전은 조기 발견, 감시, 예후 및 약물 모니터링을 위한 특정 바이오마커를 프로파일링하는 데 중요한 역할을 했습니다. 단?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	SIGMA- ALDRICH	D8255	Reagent for maintaining −SH groups in the reduced state; quantitatively reduces disulfides.
1,5 M Tris-HCL buffer, pH 8.8	BIO-RAD	161-0798	Resolving Gel Buffer
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD	1610772	Use this premixed 10x Tris/glycine/SDS running buffer to separate protein samples by SDS-PAGE.
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	33539	2-Propanol (Isopropanol) is a secondary alcohol. It has been tested as a substitute to fuel for use in various fuel cells. CuO powder dissolved in 2-propanol has been used for the laser ablation assisted synthesis of Cu colloids. Suspension of 2-propanol with Zn(NO3)2 has been employed for the fabrication of titanium dioxide-coated stainless steel (P25-TiO2/SS) photoanode coated with uniformly thick layer of P25-TiO2.This photoanode was used for the electrochemical photocatalytic (ECPC) degradation process.
30% Acrylamide/Bis Solution	BIO-RAD	1610158	2.6% Crosslinker. Electrophoresis purity reagent
Acetic Acid Glacial	Carlo Erba Reagennts	401392	Acetic acid is an important chemical reagent with many industrial applicatios.
Acetone	Panreac Applichem	211007.1214	Acetone is a solvent, renowned for its versatility in various laboratory, manufacturing, and cleaning applications.
Acetonitile	VWR	83640320	for HPLC   LC-MS grade
Agarose	Invitrogen	15510-027	Agarose is a heteropolysaccharide  frequently used in molecular biology.
Ammonium bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	A6141	minimum 99,0%
Ammonium persulfate	SIGMA-ALDRICH	A3678	For molecular Biology, For electrophoresis, ≥98%
Bioruptor plus	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	sonicator
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	Reducing agent used to reduce disulfide bonds in proteins.
Dodeca Silver Stain Kit	BIO-RAD	161-0480	The Dodeca silver stain kit is easy-to-use for the detection of nonagram levels of proteins in polyacrylamide gels.
Glycerol	GE - Healthcare Life Sciences	171325010L	Glycerol is a simple triol compound, it is involved to aid in casting gradient gels, protein stabilizer and storage buffer component.
Halt Phosphatase Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail preserves the phosphorylation state of proteins during and after cell lysis or tissue protein extraction  Single- Use Cocktail (100X).
Halt Protease Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) are ready-to-use concentrated stock solutions of protease inhibitors for addition to samples to prevent proteolytic degradation during cell lysis and protein extraction. Single- Use Cocktail (100X).
Hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReagent, for molecular biology
Iodoacetamide	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥99% (NMR), crystalline
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	Potassium chloride, KCl, is generally used in laboratory routines. Its use as a storage buffer for pH electrodes and as a reference solution for conductivity measurements is well established.
MCF10 cell line	atcc	CRL-10317	epithelial cell line that was isolated in 1984 from the mammary gland of a White, 36-year-old female with fibrocystic breasts. This cell line was deposited by the Michigan Cancer Foundation.
MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	Magnesium chloride is a colorless crystalline solid.
N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamine	SIGMA-ALDRICH	T9281	For Electrophoresis, approx. 99%
Phosphate saline buffer 1X	Corning	15373631	1 X PBS (phosphate buffered saline) is a buffered balanced salt solution used for a variety biological and cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Potassium hexacyanoferrate	SIGMA-ALDRICH	60299	Electron acceptor, employed in systems involving electron transport,
SDS Solution 20% (w/v)	BIO-RAD	161-0418	Sodium dodecyl sulfate. Electrophoresis purity reagent
Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%	SIGMA- ALDRICH	21,726-3	Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%
Sulfuric acid	SIGMA-ALDRICH	339741	Sulfuric Acid, Reagent, is an extremely corrosive acid that comes as yellowy slightly viscous liquid. It is soluble in water and is a diprotic acid. It has very strong corrosive, dehydrating and oxidizing properties as well as being hygroscopic.
Trichloroacetic acid	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	Trichloroacetic acid (TCA) is used as a reagent for the precipitation of proteins1,2 and nucleic acids3.
Trifluoroacetic acid	Riedel-de Haën	34957	Trifluoroacetic acid
Triton X-100	SIGMA- ALDRICH	T9284-1L	Triton X-100 is a nonionic polyoxyethylene surfactant that is most frequently used to extract and solubilize proteins.
Trypsin from porcine pancreas	SIGMA-ALDRICH	T6567	Proteomics Grade, BioReagent, Dimethylated
UREA	SIGMA-ALDRICH	33247	Urea is a chaotropic agent and is used for protein denaturation. It disturbs the hydrogen bonds in the secondary, tertiary and quaternary structure of proteins. It can also disturb hydrogen bonding present in DNA secondary structure