Dévoilement des protéoformes d’histones à l’aide de l’électrophorèse sur gel 2D-TAU

Résumé

Cette méthode décrit une stratégie simple et rapide pour la caractérisation et l’investigation des protéoformes d’histones.

Résumé

Les histones subissent diverses modifications post-traductionnelles (PTM) telles que la méthylation, l’acétylation, la phosphorylation, l’acylation et l’ubiquitination, qui contrôlent la dynamique des nucléosomes et déterminent le destin cellulaire. Le nucléosome, qui est l’unité fonctionnelle de la chromatine, comprend l’ADN, quatre paires d’histones (H3, H4, H2A et H2B) constituant le noyau globulaire, et l’histone de liaison H1, qui stabilise la structure de la chromatine. Les queues amino-(N)-terminales des histones dépassent des domaines centraux globulaires et subissent des PTM distincts qui influencent le paysage chromatique. Certaines preuves suggèrent que l’homéostasie des histones PTM est cruciale pour préserver toutes les activités physiologiques. La dérégulation des PTM des histones est la principale cause de prolifération cellulaire anormale, d’invasion et de métastases. Par conséquent, le développement de méthodes pour caractériser les PTM d’histones est crucial. Ici, nous décrivons une technique efficace pour isoler et analyser les isoformes d’histones. La méthode, basée sur la combinaison de deux séparations orthogonales, permet l’enrichissement des isoformes d’histones et l’identification ultérieure par spectrométrie de masse. La technique, décrite à l’origine par Shechter et al., combine des gels de polyacrylamide acide-urée (TAU-GEL), qui peuvent séparer les protéines d’histones basiques en fonction de leur taille et de leur charge, et des gels de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE), qui peuvent séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Le résultat est une carte bidimensionnelle des isoformes d’histones, adaptée à la digestion dans le gel, suivie d’une identification par spectrométrie de masse et d’une analyse par transfert Western. Le résultat est une carte bidimensionnelle des isoformes d’histones, adaptée à la fois à la digestion en gel, suivie de l’identification par spectrométrie de masse et de l’analyse par transfert Western. Cette approche protéomique est une méthode robuste qui permet l’enrichissement d’une seule isoforme d’histones et la caractérisation de nouvelles PTM d’histones.

Introduction

L’apparition, la progression et la chimiorésistance du cancer sont liées à des événements génétiques et épigénétiques, y compris les PTM d’histones. Les histones subissent une variété de PTM qui régulent la dynamique de la chromatine et dictent le destin cellulaire¹.

Le nucléosome est l’unité fonctionnelle de la chromatine et est un complexe moléculaire d’ADN et de protéines qui permet à l’ADN d’être emballé dans le noyau. Il se compose de quatre paires d’histones (H3, H4, H2A et H2B) qui constituent le noyau du nucléosome, ainsi que de l’histone de liaison H1, qui aide à stabiliser la structure de la chromatine. Les queues amino-terminales des histones dépassent de leurs domaines centraux globulaires et subissent des modifications post-traductionnelles spécifiques qui affectent le paysage chromatinal².

Jusqu’à présent, au moins 23 classes de PTM d’histones sont connues. Ces PTM sont des modifications covalentes qui consistent principalement en la méthylation, l’acétylation, la phosphorylation, la glycosylation, l’ubiquitylation, la SUMOylation et l’ADP-ribosylation³. De plus, une corrélation étroite entre l’homéostasie de l’épigénome et le recâblage métabolique a récemment été proposée, ce qui explique la croissance exponentielle du nombre possible d’histones PTM 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Les PTM d’histones, déposées, effacées et transduites par des enzymes modificatrices, sont nommées respectivement écrivains, effaceurs et lecteurs. Ils affectent les propriétés physiques et chimiques de la structure de la chromatine, affectant le profil d’expression des gènes, y compris l’expression des gènes suppresseurs de tumeurs et des oncogènes 14,15,16.

Le nombre d’histones protéoformes augmente lorsqu’elles sont incorporées dans le nucléosome en tant que variantes d’histones. Ces variantes sont des isoformes non alléliques d’histones canoniques, et elles ajoutent de la complexité en modifiant les propriétés chimiques et physiques de la chromatine. Par rapport aux histones canoniques, les variants d’histones ont des domaines fonctionnels qui subissent des modifications post-traductionnelles uniques ou interagissent avec des composants spécifiques de la chromatine, ce qui a un impact sur la dynamique et la stabilité du nucléosome¹⁷.

Dans les cellules cancéreuses, la dérégulation des PTM et des variantes d’histones affecte le profil d’expression génique, entraînant une prolifération cellulaire anormale, une invasion, des métastases et l’activation des voies de résistance aux médicaments 3,18,19,20. Les mutations au sein des histones ou des complexes de remodelage de la chromatine peuvent modifier le phénotype cellulaire, contribuant ainsi à la transformation néoplasique. L’accumulation d’altérations épigénétiques, telles que la méthylation des histones, est un facteur clé dans l’activation des voies de résistance aux médicaments 21,22,23. Les mutations au sein du complexe SWI/SNF, qui se compose de 15 sous-unités codées par 29 gènes, ont un impact sur plus de 20 % des cancers humains dans de nombreux types de tumeurs. Au cours de la dernière décennie, des stratégies médicamenteuses basées sur l’épigénétique (epi-drugs) ont été développées, et de nombreux médicaments ciblant le cancer avec des modèles anormaux de modification des histones ont été approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) des ^{États-Unis23}.

L’analyse des protéines d’histones est assez difficile, ce qui en fait un domaine d’étude exigeant. Récemment, les méthodes de spectrométrie de masse sont devenues la méthode privilégiée pour caractériser et étudier les protéoformes d’histones. Cependant, les conditions d’extraction drastiques, combinées à la faible solubilité de certaines variantes et à l’homologie de séquence élevée, rendent leur analyse difficile.

Au cours de la dernière décennie, plusieurs méthodes basées sur la spectrométrie de masse ont été développées pour le profilage et l’investigation des histones 24,25,26,27. Dans cette étude, nous présentons une méthode rentable et fiable pour créer une carte bidimensionnelle des protéoformes d’histones, ce qui peut augmenter les chances de découvrir de nouvelles modifications post-traductionnelles.

L’électrophorèse TAU 2D combine la séparation dans des conditions acides avec SDS PAGE. Dans la première dimension, l’état acide du milieu donne une charge positive nette aux protéines basiques. Étant donné que les histones sont des protéines très basiques et ont un point isoélectrique (pH) plus élevé par rapport au milieu, elles deviennent chargées positivement et migrent sous un champ électrique. Dans la deuxième dimension, les histones sont dénaturées par SDS et séparées en fonction de leur poids moléculaire. La carte 2D résultante peut être utilisée comme un outil pour enrichir des protéoformes spécifiques à une résolution ponctuelle pour l’analyse par spectrométrie de masse et les études immunologiques^28,29. Après électrophorèse, les taches TAU 2D peuvent être décolorées, digérées par la trypsine et analysées par spectrométrie de masse. Alternativement, la carte TAU 2D peut être tamponnée sur un filtre nitrocellulose/PVDF et étudiée par immunocoloration²⁷.

Dans ce contexte, les méthodes pourraient être stratégiques pour améliorer l’identification et l’analyse de nouvelles modifications post-traductionnelles corrélées au recâblage métabolique^30,31.

Nous avons encore amélioré la méthode originale en incorporant une étape de sonication, ce qui est utile pour la dégradation de l’ADN et l’amélioration de la solubilité des protéines. De plus, nous avons prolongé l’étape d’incubation pour l’extraction des histones, afin d’obtenir un échantillon de protéines de haute pureté. De plus, dans notre protocole, nous avons exécuté la première dimension à basse tension pendant une durée plus longue pour obtenir une meilleure résolution. Le gel résultant a été utilisé pour étudier les histones canoniques PTM et caractériser de nouvelles modifications telles que la glycation^10,32.

Dans l’ensemble, nous avons développé une méthode d’extraction et de purification des histones, suivie de la résolution des protéoformes d’histones à l’aide d’une carte bidimensionnelle. Les travaux comprennent également une procédure de digestion en gel pour l’analyse par spectrométrie de masse et les étapes de l’analyse bidimensionnelle par transfert de Western.

Protocole

1. Extraction d’histones

1. Effectuez l’extraction d’histones à partir d’au moins 1 x 10^{cellules 6} , qui sont confluentes à 80 %. Pour cette expérience, nous avons utilisé des lignées cellulaires MCF-10A de l’ATCC. Après le placage, laver les cellules trois fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x. Effectuez toutes les étapes sur de la glace.
2. Préparez un tampon de lyse cellulaire contenant 10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de KCl et 1,5 mM de MgCl₂. Ajouter 1 mM de dithioérythritol et d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase juste avant l’utilisation.
3. Ajoutez 800 μL de tampon de lyse cellulaire dans la boîte de Pétri contenant les cellules, grattez et recueillez les cellules dans un tube de 1,5 mL, puis incubez sur un rotateur à 300 tr/min, 4 °C pendant 1 h.
4. Centrifugation à 10 000 x g, 4 °C, pendant 10 min dans une microcentrifugeuse prérefroidie avec un rotateur pour tubes de 1,5 mL.
5. Laver la pastille avec 400 μL de tampon de lyse cellulaire et centrifuger à 10 000 x g, 4 °C, pendant 10 min. Jetez le surnageant. Répétez l’étape de lavage 3 fois.
   REMARQUE : Utilisez une microcentrifugeuse pré-refroidie (4 °C) avec un rotateur pour tubes de 1,5 ml pour toutes les étapes. Manipulez le granulé avec précaution pour éviter toute perte de matière.
6. Remettre la pastille en suspension dans 640 μL de 0,2 M H₂SO₄ et incuber sur un rotateur à 300 tr/min, à 4 °C, pendant 16 h.
   ATTENTION : L’acide sulfurique est un produit chimique dangereux ; Veuillez l’utiliser sous une hotte chimique.
7. Centrifugeuse à 16 000 x g, 4 °C, pendant 10 min. Transférez le surnageant dans un tube frais et conservez-le jusqu’aux étapes suivantes. Jetez les débris nucléaires.
8. Précipiter les histones en ajoutant 212 μL d’acide trichloracétique, goutte à goutte (la concentration finale de TCA est de 33 %). Mélangez la solution en inversant le tube 10x. Incuber sur glace, dans l’obscurité, pendant 16 h.
   ATTENTION : Le TCA est un produit chimique dangereux ; Utiliser sous une hotte chimique.
9. Histones à granulés par rotation dans une centrifugeuse prérefroidie à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirez délicatement le surnageant et lavez la pastille 3 fois avec 200 μL d’acétone froide.
10. Remettre le granulé en suspension avec de l’acétone froide, puis sonicer haute puissance 2x avec 3 cycles de 30 s on/off, en alternance avec une pause de 10 min sur glace.
    REMARQUE : La procédure a été effectuée à l’aide d’un ultrasonisateur. Cette étape est essentielle pour éliminer l’ADN enveloppé d’histones.
11. Centrifuger à 16 000 x g pendant 10 min, jeter l’acétone et remettre l’échantillon en suspension dans 100 μL d’eau doublement distillée. Déterminer la concentration en protéines à l’aide de la méthode d’analyse de Bradford, conformément aux instructions du fabricant³³.
    REMARQUE : Après centrifugation, la pastille apparaît parfois blanche ou translucide. Un précipité blanc et opaque pourrait indiquer la présence de contaminants salins qui pourraient nuire à la séparation 2D. Si c’est le cas, répétez les étapes de lavage à l’acétone jusqu’à ce que la pastille devienne translucide.
12. Lyophiliser 70 μg d’histones, selon les instructions du fabricant. Réglez le lyophilisant à 30 °C pendant 60 min. Vérifiez le volume du tube et répétez l’étape à 30 °C jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement lyophilisé (généralement, 90 min sont nécessaires pour lyophiliser complètement l’échantillon). Après 60 min, vérifiez le volume toutes les 10 min, car le processus dépend de l’échantillon.
    REMARQUE : Si la quantité de protéines d’histones est faible, commencez à partir de 2 x 10⁶ cellules. Dans ce cas, utilisez le même volume de réactifs que celui utilisé pour 1 x 10⁶ cellules. Vérifier la pureté de tous les produits chimiques utilisés au cours de la procédure ; tous les réactifs doivent être de qualité HPLC.

2. Mini électrophorèse 2D sur gel triton-acide-urée (TAU)

1. Préparez un mini-gel TAU pour un mini système d’électrophorèse vertical sur gel de polyacrylamide, comme décrit ci-dessous.
   1. Préparez le gel de séparation : 6 M d’urée, 15 % d’acrylamide/bisacrylamide (29:1), 5 % d’acide glacial acétique, 0,25 % de Triton X-100 (v/v), 0,4 % de TEMED (v/v), 0,1 % d’APS (p/v). Pour préparer la solution, dissoudre l’urée dans de l’acrylamide/bis et 1 mL d’eau ultrapure en agitant doucement à température ambiante ; Ajoutez les autres composants et réglez le volume. Pour un gel mini-TAU, préparer 10 mL de solution. Remplissez les plaques de gel prédéfinies avec la solution, en évitant la formation de bulles d’air à seulement 1,5 cm du haut. Recouvrez la solution de 1 mL d’isopropanol pour niveler le gel.
   2. Préparez le gel d’empilage : 6 M d’urée, 6 % d’acrylamide/bisacrylamide (29:1), 5 % d’acide glacial acétique, 0,25 % de Triton X-100 (v/v), 0,4 % de TEMED (v/v), 0,1 % d’APS (p/v). Pour préparer la solution, dissoudre l’urée dans de l’acrylamide/bis et 1 mL d’eau ultrapure ; Ajoutez les autres composants et ajustez au volume. Remplissez les plaques de gel avec une solution d’empilage, placez un peigne en gel à 10 puits entre les plaques et insérez-le jusqu’à ce que la solution de gel arrive à mi-hauteur des dents du peigne. Laisser polymériser le gel 16 h à 4 °C.
      REMARQUE : Insérez soigneusement le peigne pour assurer la formation régulière de puits.
2. Préparez 100 μL de tampon d’échantillon TAU en dissolvant 6 M d’urée, 5 % d’acide glaciaire acétique et de l’eau doublement distillée. Dissoudre l’échantillon lyophilisé préparé dans 30 μL de tampon d’échantillon TAU.
3. Remplissez la mini-cassette avec un tampon de coulage TAU, concentration finale d’acide acétique de 5 %. Rincez les puits du gel TAU à l’aide d’une seringue remplie de tampon courant et chargez l’échantillon dans le puits à l’aide d’une micropipette.
4. Connectez la chambre électrophorétique à l’alimentation, avec l’électrode positive (rouge) placée en bas. Faites attention, lorsque l’IP > pH, les protéines sont chargées positivement, de sorte que la migration se fait de l’électrode positive à l’électrode négative. Faites fonctionner le gel d’abord à 30 V pendant 70 min, puis à la tension constante de 25 V pendant 17 h.
   REMARQUE : Pendant ce temps, coupez de temps en temps l’alimentation électrique et rincez les puits de gel à l’aide d’une seringue jetable. Faites attention à éliminer toutes les bulles de la surface inférieure du gel à l’aide d’une seringue pour éviter la perte d’échantillon et la présence d’un étalement dans les protéines résolues.
5. Retirez le gel des plaques de gel et coupez la ligne d’intérêt avec un scalpel propre. Manipulez soigneusement le gel pour éviter la casse du gel. Comme la ligne d’intérêt est incolore, chargez l’échantillon dans le puits numéro 1 pour identifier et couper exactement la voie d’intérêt.
   REMARQUE : Pour vérifier la séparation sur le gel mini-TAU, préparez et analysez l’échantillon en double. L’un de ces gels peut être coloré à l’aide de Coomassie Brilliant Blue. Le schéma de séparation est illustré à la figure 1A.
6. Lavez la voie avec 15 ml de Tris-HCl 0,5 M pH 8,8 pendant 15 min.
7. Préparez 15 ml de tampon d’équilibrage 1 avec de l’urée 6 M, du Tris-HCl 0,5 M, un pH 6,8, 30 % de glycérol, 20 % de SDS et 2 % de dithioérythritol. Préparez 15 ml de tampon d’équilibrage 2, en utilisant 6 M d’urée, 0,5 M de Tris-HCl, un pH de 6,8, 30 % de glycérol, 20 % de SDS et 2 % d’iodoacétamide. Préparez les tampons d’équilibrage 1 et 2 juste avant utilisation ; Stockez le tampon d’équilibrage 2 dans l’obscurité.
8. Incuber la voie de gel, sous une légère agitation, dans 10 mL de tampon d’équilibrage 1 pendant 15 min, puis décanter. Incuber la voie de gel, sous une légère agitation, avec 10 mL de tampon d’équilibrage 2 pendant 15 min à l’obscurité, puis décanter.
9. Préparez un gel d’acrylamide SDS 15 % résolutif en suivant le tableau 1. Installez la plaque de gel et remplissez-la avec la solution de gel de résolution. Remplissez la solution jusqu’à ce qu’elle soit à 1,5 cm de l’extrémité de la longue plaque de gel. Mettez 1 mL d’isopropanol sur la surface pour niveler le gel et lui permettre de polymériser.
10. Après la polymérisation du gel, décantez l’isopropanol et séchez le puits avec du papier de chromatographie sur cellulose 3MM Chr. Insérez la voie résultante de l’étape 8 dans le puits de gel.
11. Scellez la voie au gel de résolution avec une solution d’étanchéité de 0,5 % d’agarose à bas point de fusion dans 1 tampon Tris/glycine/SDS et 5 μL de bleu de bromophénol à 0,003 %. Laisser polymériser le gel d’agarose pendant 30 min.
    REMARQUE : Évitez la formation de bulles d’air lors du scellement de l’agarose pour éviter les taches de gel.
12. Mettez les plaques de gel dans la cassette et remplissez-la de 1x tampon Tris/glycine/SDS. Faites couler le gel à 120 V jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol atteigne le fond. Retirez délicatement le gel des plaques, jetez l’excès d’agarose et colorez le gel à l’argent à l’aide d’une procédure compatible avec la spectrométrie de masse ou le transfert pour le dosage immunologique.

3. Coloration à l’argent ³²

1. Préparez les réactifs suivants - Fixateur : 50 % de méthanol, 5 % d’acide acétique, 45 % d’eau désionisée ; Solution de lavage : 50 % de méthanol, 50 % d’eau déminéralisée ; Sensibilisant : 0,02 % Na₂S₂O₃ 5H₂O dans de l’eau désionisée ; Réactif d’argent : 0,1 % de nitrate d’argent dans de l’eau désionisée froide (4 °C) ; Révélateur : 0,04 % de formol et 2 % de Na₂CO₃, formaldéhyde (37 %) (ajouter juste avant l’utilisation) 0,4 mL d’eau désionisée et remplir jusqu’à 1000 mL ; Réactif stop : 5 % d’acide acétique ; Solution de stockage du gel : 1 % d’acide acétique.
   REMARQUE : Étant donné que les produits chimiques utilisés pour la coloration sont dangereux, effectuez toutes les étapes sous une hotte chimique.
2. Suivez la procédure décrite dans le Tableau 2 en tenant compte de ce qui suit. Effectuez toutes les incubations en agitant doucement. Préparez le réactif stop avant de commencer l’étape de développement ; Cela garantira le développement du gel avec l’intensité opportune. Au cours de l’étape de développement, les taches apparaîtront sous forme de signaux jaunes qui deviendront brun clair à la fin de l’incubation. L’intensité des différentes taches dépendra de la quantité d’histones protéoformes. Le gel est prêt pour l’excision localisée et la digestion dans le gel (Figure 1B)

4. Digestion dans le gel

1. Préparez les solutions suivantes : 50 mM de bicarbonate d’ammonium (NH₄HCO3)/50 % (v/v) d’acétonitrile ; 10 mM de dithiothréitol (DTT) dans 50 mM NH₄HCO₃ ; 55 mM d’iodoacétamide (AIA) dans 50 mM NH₄HCO₃ ; 0,1 % d’AGF ; 50 mM NH₄HCO₃, pH 8 ; Acétonitrile de qualité HPLC ; Tubes en silicone de 1 ml.
   REMARQUE : Pour éviter la contamination humaine par la kératine, par les cheveux ou la peau, utilisez des gants propres et travaillez dans un endroit propre.
2. Excisez les points d’intérêt des histones du gel coloré à l’aide d’un scalpel propre et placez-les dans un tube de silicium frais (1,5 ml). Prenez soin d’exciser un seul endroit et de le mettre dans un seul tube pour éviter la contamination croisée des isoformes.
3. Ajouter à chaque point de gel 250 μL de 50 mM de NH₄HCO₃/50 % d’acétonitrile et incuber sous agitation douce dans un thermomélangeur à température ambiante. Décantez la solution et répétez cette étape 3 fois. Les morceaux de gel apparaîtront transparents.
4. Déshydratez les taches de gel en ajoutant de l’acétonitrile (200 μL). À ce stade, les morceaux de gel prendront une couleur blanc opaque.
5. Décanter l’acétonitrile et laisser sécher à l’air libre pendant 10 min. Le morceau de gel apparaîtra sec dans le tube. La réduction et l’alkylation ne sont pas essentielles puisque les protéines d’histones ont été réduites et alkylées lors de l’étape d’équilibration.
6. Réhydratez les taches de gel dans 20 μL de solution de trypsine (0,1 mM HCl) ou un volume suffisant pour couvrir les morceaux de gel. Placez les tubes dans le thermomélangeur et incubez, sous une légère agitation, à 37 °C pendant au moins 4 h jusqu’à 16 h.
7. Transférez le surnageant contenant les peptides tryptiques dans un tube frais. Ajouter 50 μL de solution d’extraction (60 % d’acétonitrile, 1 % de TFA) aux morceaux de gel et sonicer 2 fois dans un bain-marie à ultrasons pendant 10 min à 4 °C.
8. Transférez le surnageant, contenant des peptides tryptiques supplémentaires, dans le tube frais. Utilisez un lyophilisateur pour sécher les peptides extraits en mélange. Réglez le lyophiliseur à 30 °C et séchez la solution ; Une pastille lyophilisée apparaîtra dans le tube.
   REMARQUE : Cette étape dépend du volume ; En général, 1 h suffit, mais vérifiez le volume toutes les 10 minutes jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement sec.
9. Ajouter 15 μL de TFA à 0,1 % dans chaque tube et incuber doucement dans un thermomélangeur à 25 °C. Transférez le surnageant dans le flacon pour l’analyse LC-MS/MS.

5. Transfert western 2DTAU

1. Préparez le tampon de transfert, 250 mM de base Tris, 92 mM de glycine et 10 % de méthanol à l’aide d’eau doublement distillée.
2. Coupez la membrane de nitrocellulose et le papier filtre aux dimensions du gel.
3. Équilibrez le gel et faites tremper la membrane, le papier filtre et les papiers filtres dans le tampon de transfert pendant 15 min. Utilisez des membranes en nitrocellulose ou en PVDF. Si vous utilisez des membranes PVDF (polyvinylidene difluorure), activez-les en les trempant dans 100 % de MetOH.
4. Préparez le sandwich de gel dans la cassette pour un transfert semi-sec comme suit : Électrode négative/Papier filtre/Gel/Membrane nitrocellulosique/Papier filtre/Électrode positive. Éliminez toutes les bulles d’air entre le gel et la membrane pour assurer de bons résultats.
5. Placez la cassette dans l’unité semi-sèche et faites fonctionner le transfert à 25 V pendant 30 min. À la fin, démontez le sandwich de transfert et stockez la membrane pour le test immunologique. Vérifiez l’efficacité du transfert avec la coloration Ponceau. Marquez la membrane avec un signe en haut à droite pour préserver la bonne orientation du filtre.
6. Incuber avec des anticorps primaires et secondaires selon l’expérience (Figure 2).

Résultats

Sur la figure 1A, il est possible d’observer comment les protéines d’histones migrent dans un gel 1D. Il s’agit d’une étape préliminaire importante pour comprendre le temps de fonctionnement de la première dimension. Une fois que le bon moment de séparation est déterminé, exécutez la deuxième dimension. La carte 2D des protéoformes d’histones montre un motif topographique distinctif (Figure 1B). Chaque point ...

Discussion

Au cours de la dernière décennie, le traitement des patients atteints de cancer a été révolutionné par l’identification de diverses altérations moléculaires qui stimulent le développement et la progression du cancer. L’avancée la plus significative en oncologie moderne est le développement d’une thérapie basée sur une analyse moléculaire complète. Les progrès technologiques en génomique et en protéomique ont joué un rôle crucial dans le profilage de biomarqueurs...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	SIGMA- ALDRICH	D8255	Reagent for maintaining −SH groups in the reduced state; quantitatively reduces disulfides.
1,5 M Tris-HCL buffer, pH 8.8	BIO-RAD	161-0798	Resolving Gel Buffer
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD	1610772	Use this premixed 10x Tris/glycine/SDS running buffer to separate protein samples by SDS-PAGE.
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	33539	2-Propanol (Isopropanol) is a secondary alcohol. It has been tested as a substitute to fuel for use in various fuel cells. CuO powder dissolved in 2-propanol has been used for the laser ablation assisted synthesis of Cu colloids. Suspension of 2-propanol with Zn(NO3)2 has been employed for the fabrication of titanium dioxide-coated stainless steel (P25-TiO2/SS) photoanode coated with uniformly thick layer of P25-TiO2.This photoanode was used for the electrochemical photocatalytic (ECPC) degradation process.
30% Acrylamide/Bis Solution	BIO-RAD	1610158	2.6% Crosslinker. Electrophoresis purity reagent
Acetic Acid Glacial	Carlo Erba Reagennts	401392	Acetic acid is an important chemical reagent with many industrial applicatios.
Acetone	Panreac Applichem	211007.1214	Acetone is a solvent, renowned for its versatility in various laboratory, manufacturing, and cleaning applications.
Acetonitile	VWR	83640320	for HPLC   LC-MS grade
Agarose	Invitrogen	15510-027	Agarose is a heteropolysaccharide  frequently used in molecular biology.
Ammonium bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	A6141	minimum 99,0%
Ammonium persulfate	SIGMA-ALDRICH	A3678	For molecular Biology, For electrophoresis, ≥98%
Bioruptor plus	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	sonicator
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	Reducing agent used to reduce disulfide bonds in proteins.
Dodeca Silver Stain Kit	BIO-RAD	161-0480	The Dodeca silver stain kit is easy-to-use for the detection of nonagram levels of proteins in polyacrylamide gels.
Glycerol	GE - Healthcare Life Sciences	171325010L	Glycerol is a simple triol compound, it is involved to aid in casting gradient gels, protein stabilizer and storage buffer component.
Halt Phosphatase Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail preserves the phosphorylation state of proteins during and after cell lysis or tissue protein extraction  Single- Use Cocktail (100X).
Halt Protease Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) are ready-to-use concentrated stock solutions of protease inhibitors for addition to samples to prevent proteolytic degradation during cell lysis and protein extraction. Single- Use Cocktail (100X).
Hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReagent, for molecular biology
Iodoacetamide	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥99% (NMR), crystalline
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	Potassium chloride, KCl, is generally used in laboratory routines. Its use as a storage buffer for pH electrodes and as a reference solution for conductivity measurements is well established.
MCF10 cell line	atcc	CRL-10317	epithelial cell line that was isolated in 1984 from the mammary gland of a White, 36-year-old female with fibrocystic breasts. This cell line was deposited by the Michigan Cancer Foundation.
MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	Magnesium chloride is a colorless crystalline solid.
N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamine	SIGMA-ALDRICH	T9281	For Electrophoresis, approx. 99%
Phosphate saline buffer 1X	Corning	15373631	1 X PBS (phosphate buffered saline) is a buffered balanced salt solution used for a variety biological and cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Potassium hexacyanoferrate	SIGMA-ALDRICH	60299	Electron acceptor, employed in systems involving electron transport,
SDS Solution 20% (w/v)	BIO-RAD	161-0418	Sodium dodecyl sulfate. Electrophoresis purity reagent
Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%	SIGMA- ALDRICH	21,726-3	Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%
Sulfuric acid	SIGMA-ALDRICH	339741	Sulfuric Acid, Reagent, is an extremely corrosive acid that comes as yellowy slightly viscous liquid. It is soluble in water and is a diprotic acid. It has very strong corrosive, dehydrating and oxidizing properties as well as being hygroscopic.
Trichloroacetic acid	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	Trichloroacetic acid (TCA) is used as a reagent for the precipitation of proteins1,2 and nucleic acids3.
Trifluoroacetic acid	Riedel-de Haën	34957	Trifluoroacetic acid
Triton X-100	SIGMA- ALDRICH	T9284-1L	Triton X-100 is a nonionic polyoxyethylene surfactant that is most frequently used to extract and solubilize proteins.
Trypsin from porcine pancreas	SIGMA-ALDRICH	T6567	Proteomics Grade, BioReagent, Dimethylated
UREA	SIGMA-ALDRICH	33247	Urea is a chaotropic agent and is used for protein denaturation. It disturbs the hydrogen bonds in the secondary, tertiary and quaternary structure of proteins. It can also disturb hydrogen bonding present in DNA secondary structure