JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот метод описывает простую и быструю стратегию определения характеристик и исследования протеоформы гистонов.

Аннотация

Гистоны подвергаются различным посттрансляционным модификациям (ПТМ), таким как метилирование, ацетилирование, фосфорилирование, ацилирование и убиквитинирование, которые контролируют динамику нуклеосом и определяют судьбу клетки. Нуклеосома, которая является функциональной единицей хроматина, состоит из ДНК, четырех пар гистонов (H3, H4, H2A и H2B), составляющих глобулярное ядро, и линкерного гистона H1, который стабилизирует структуру хроматина. Амино(N)-концевые хвосты гистонов выступают из доменов глобулярного ядра и подвергаются различным ПТМ, которые влияют на ландшафт хроматина. Некоторые данные свидетельствуют о том, что гомеостаз гистонов ПТМ имеет решающее значение для сохранения всей физиологической активности. Дерегуляция гистонных ПТМ является основной причиной аномальной клеточной пролиферации, инвазии и метастазирования. Поэтому разработка методов определения характеристик гистонов ПТМ имеет решающее значение. В этой статье мы описываем эффективный метод выделения и анализа изоформ гистонов. Метод, основанный на комбинации двух ортогональных разделений, позволяет проводить обогащение изоформ гистонов и последующую масс-спектрометрическую идентификацию. Метод, первоначально описанный Шехтером и др., сочетает в себе кислотно-мочевинные полиакриламидные гели (TAU-GEL), которые могут разделять основные гистоновые белки на основе размера и заряда, и додецилсульфат-полиакриламидные гели натрия (SDS-PAGE), которые могут разделять белки по молекулярной массе. Результатом является двумерная карта изоформ гистонов, пригодная для расщепления в геле с последующей идентификацией масс-спектрометрии и вестерн-блоттингом. В результате получается двумерная карта изоформ гистонов, пригодная как для расщепления в геле, так и для масс-спектрометрической идентификации и вестерн-блоттинга. Этот протеомный подход представляет собой надежный метод, который позволяет обогащать одну изоформу гистона и характеризовать новые гистонные ПТМ.

Введение

Возникновение, прогрессирование и химиорезистентность рака связаны с генетическими и эпигенетическими событиями, включая ПТМ гистонов. Гистоны подвергаются воздействию различных ПТМ, которые регулируют динамику хроматина и определяют судьбу клетки1.

Нуклеосома является функциональной единицей хроматина и представляет собой молекулярный комплекс ДНК и белков, который позволяет ДНК упаковываться в ядро. Он состоит из четырех пар гистонов (H3, H4, H2A и H2B), которые составляют ядро нуклеосомы, а также линкерного гистона H1, который помогает стабилизировать структуру хроматина. Амино(N)-концевые хвосты гистонов выступают из своих доменов глобулярного ядра и претерпевают специфические посттрансляционные модификации, которые влияют на ландшафт хроматина2.

На данный момент известно как минимум 23 класса гистонов ПТМ. Эти ПТМ представляют собой ковалентные модификации, которые в основном состоят из метилирования, ацетилирования, фосфорилирования, гликозилирования, убиквитилирования, SUMOylирования и АДФ-рибозилирования3. Кроме того, недавно была предложена тесная корреляция между гомеостазом эпигенома и метаболической перестройкой, что объясняет экспоненциальный рост возможного числа гистонов ПТМ 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Гистонные ПТМ, осаждения, стирания и трансдуцирования ферментами-модификаторами, называются соответственно записывающими, ластиками и считывающими. Они влияют на физические и химические свойства структуры хроматина, влияя на профиль экспрессии генов, в том числе на экспрессию генов-супрессоров опухолей и онкогенов 14,15,16.

Количество протеоформ гистонов увеличивается при включении в нуклеосому в виде вариантов гистонов. Эти варианты являются неаллельными изоформами канонических гистонов, и они добавляют сложности, изменяя химические и физические свойства хроматина. В отличие от канонических гистонов, варианты гистонов имеют функциональные домены, которые претерпевают уникальные посттрансляционные модификации или взаимодействуют со специфическими компонентами хроматина, влияя на динамику и стабильность нуклеосомы17.

В раковых клетках дерегуляция гистонов ПТМ и их вариантов влияет на профиль экспрессии генов, что приводит к аномальной клеточной пролиферации, инвазии, метастазированию и активации путей лекарственной устойчивости 3,18,19,20. Мутации в гистонах или комплексах ремоделирования хроматина могут изменять фенотип клеток, способствуя неопластической трансформации. Накопление эпигенетических изменений, таких как метилирование гистонов, является ключевым фактором в активации путей лекарственной устойчивости 21,22,23. Мутации в комплексе SWI/SNF, который состоит из 15 субъединиц, кодируемых 29 генами, влияют на более чем 20% раковых опухолей человека при многих типах опухолей. За последнее десятилетие были разработаны эпигенетические лекарственные стратегии (эпи-препараты), и многие препараты, нацеленные на рак с аномальными моделями модификации гистонов, были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA)23.

Анализ белков гистонов является довольно сложной задачей, что делает его сложной областью исследований. В последнее время методы масс-спектрометрии стали предпочтительным способом определения характеристик и изучения протеоформ гистонов. Тем не менее, жесткие условия экстракции в сочетании с плохой растворимостью некоторых вариантов и высокой гомологией последовательностей затрудняют их анализ.

За последнее десятилетие было разработано несколько методов, основанных на масс-спектрометрии, для профилирования и исследования гистонов 24,25,26,27. В этом исследовании мы представляем экономически эффективный и надежный метод создания двумерной карты протеоформ гистонов, который может повысить шансы на обнаружение новых посттрансляционных модификаций.

Электрофорез 2D TAU сочетает в себе сепарацию в кислых условиях с SDS PAGE. В первом измерении кислотное состояние среды дает чистый положительный заряд основным белкам. Поскольку гистоны являются очень основными белками и имеют более высокую изоэлектрическую точку (pH) по сравнению со средой, они становятся положительно заряженными и мигрируют под действием электрического поля. Во втором измерении гистоны денатурируются с помощью SDS и разделяются на основе их молекулярной массы. Полученная 2D-карта может быть использована в качестве инструмента для обогащения специфических протеоформ с разрешением в одном пятне для масс-спектрометрического анализа и иммунологических исследований28,29. После электрофореза 2D пятна TAU могут быть очищены от пятен, расщеплены трипсином и проанализированы с помощью масс-спектрометрии. В качестве альтернативы, 2D карта TAU может быть нанесена на фильтр нитроцеллюлозы/PVDF и исследована путем иммуноокрашивания27.

В этом контексте методы могут быть стратегическими для улучшения идентификации и анализа новых посттрансляционных модификаций, коррелирующих с метаболической перестройкой30,31.

Мы еще больше улучшили оригинальный метод, включив в него этап ультразвуковой обработки, который полезен для деградации ДНК и улучшения растворимости белков. Кроме того, мы продлили стадию инкубации для экстракции гистонов, чтобы получить образец белка высокой чистоты. Более того, в нашем протоколе мы запускали первое измерение при низком напряжении в течение более длительного времени, чтобы достичь лучшего разрешения. Полученный гель был использован для исследования канонических гистонов ПТМ и характеристики новых модификаций, таких как гликация10,32.

В целом, мы разработали метод извлечения и очистки гистонов с последующим разрешением гистоновых протеоформ с помощью двумерной карты. Работа также включает в себя процедуру расщепления в геле для масс-спектрометрического анализа и этапы двумерного вестерн-блоттинга.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Экстракция гистонов

  1. Проводите экстракцию гистонов не менее чем из 1 x 106 клеток, которые на 80% сливаются. Для этого эксперимента мы использовали клеточные линии MCF-10A из ATCC. После нанесения покрытия промойте клетки трижды 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) 1x. Выполняйте все действия на льду.
  2. Приготовьте буфер для лизиса клеток, содержащий 10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ KCl и 1,5 мМ MgCl2. Добавьте 1 мМ дитиоэритритол и ингибиторы протеазы и фосфатазы непосредственно перед применением.
  3. Добавьте 800 мкл буфера для лизиса клеток в клетку, содержащую чашку Петри, соскребите и соберите клетки в пробирку объемом 1,5 мл, затем инкубируйте на ротаторе при 300 об/мин, 4 °C в течение 1 ч.
  4. Центрифугировать при 10 000 x g, 4 °C, в течение 10 мин в предварительно охлажденной микроцентрифуге с вращателем для пробирок объемом 1,5 мл.
  5. Промойте гранулу 400 μл буфера для лизиса клеток и центрифугируйте при 10 000 x g, 4 °C, в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторите шаг стирки 3 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте предварительно охлаждаемую микроцентрифугу (4 °C) с вращателем для пробирок объемом 1,5 мл для всех этапов. Обращайтесь с гранулами осторожно, чтобы избежать потери материала.
  6. Повторно суспендируйте гранулу в 640 мкл 0,2 М Н2SO4 и инкубируйте на ротаторе при 300 об/мин, при 4 °С, в течение 16 ч.
    ВНИМАНИЕ: Серная кислота является опасным химическим веществом; Пожалуйста, используйте его под вытяжным шкафом для химикатов.
  7. Центрифуга при 16 000 x g, 4 °C, в течение 10 минут. Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и храните ее до выполнения следующих действий. Выбросьте ядерный мусор.
  8. Осаждение гистонов путем добавления 212 мкл трихлоруксусной кислоты, капля за каплей (конечная концентрация ТСА составляет 33%). Перемешайте раствор, перевернув трубку в 10 раз. Инкубировать на льду, в темноте, в течение 16 ч.
    ВНИМАНИЕ: ТСА является опасным химическим веществом; Используйте под вытяжным шкафом для химикатов.
  9. Гранулы гистонов вращают в предварительно охлажденной центрифуге при 16 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость и промойте гранулу 3 раза 200 мкл холодного ацетона.
  10. Повторно суспендируйте гранулу холодным ацетоном, затем обработайте ультразвуком 2 раза с 3 циклами по 30 с, вкл/выкл, чередуя с 10-минутной паузой на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура проводилась с помощью ультразвукового аппарата. Этот шаг необходим для устранения ДНК, обернутой в гистону.
  11. Центрифугируйте при давлении 16 000 x g в течение 10 минут, выбросьте ацетон и повторно суспендируйте образец в 100 μл дважды дистиллированной воды. Определяют концентрацию белка с помощью метода анализа Брэдфорда, согласно инструкции производителя33.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования гранула иногда кажется белой или полупрозрачной. Белый и непрозрачный осадок может указывать на присутствие солевых загрязнителей, которые могут нарушить двухмерное разделение. Если это так, повторяйте шаги промывки ацетоном, пока гранула не станет прозрачной.
  12. Лиофилизируйте 70 μг гистонов, согласно инструкциям производителя. Установите лиофилизатор на 30 °C на 60 минут. Проверьте объем пробирки и повторите шаг при 30 °C до тех пор, пока образец полностью не лиофилизируется (как правило, для полной лиофилизации образца требуется 90 минут). Через 60 минут проверяйте объем каждые 10 минут, так как процесс зависит от образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество белков гистонов невелико, начните с 2 х 106 клеток. В этом случае используйте тот же объем реактивов, который используется для 1 х10 6 ячеек. Проверьте чистоту всех химических веществ, используемых во время процедуры; все реагенты должны быть класса ВЭЖХ.

2. Мини 2D гель тритон-кислота-мочевина (ТАУ) электрофорез

  1. Приготовьте мини-ТАУ-гель для мини-вертикальной системы электрофореза полиакриламидным гелем, как описано ниже.
    1. Приготовьте разделительный гель: 6 М мочевины, 15% акриламида/бисакриламида (29:1), 5% уксусной ледяной кислоты, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (v/v). Для приготовления раствора мочевину растворить в акриламиде/бисе и 1 мл сверхчистой воды при щадящем перемешивании при комнатной температуре; Добавьте остальные компоненты и отрегулируйте громкость. Для геля mini-TAU приготовьте 10 мл раствора. Заполните раствором заранее установленные гелевые пластины, не допуская образования пузырьков воздуха всего в 1,5 см от верха. Залейте раствор 1 мл изопропанола, чтобы разровнять гель.
    2. Приготовьте стекирующий гель: 6 М мочевины, 6% акриламида/бисакриламида (29:1), 5% уксусной ледяной кислоты, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (v/v). Для приготовления раствора растворить мочевину в акриламиде/бисе и 1 мл сверхчистой воды; Добавьте остальные компоненты и отрегулируйте громкость. Заполните гелевые пластины укладывающим раствором, поместите 10-луночный гелевый гребень между пластинами и вставляйте его до тех пор, пока гелевый раствор не достигнет половины зубьев гребня. Дайте гелю полимеризоваться 16 часов при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно вставьте гребень, чтобы обеспечить регулярное образование лунок.
  2. Приготовьте 100 мкл буфера для проб TAU, растворив 6 М мочевины, 5% уксусной ледяной кислоты и дважды дистиллированной водой. Приготовленный лиофилизированный образец растворить в 30 мкл буфера для образцов TAU.
  3. Заполните мини-кассету рабочим буфером TAU, конечная концентрация уксусной кислоты 5%. Промойте лунки ТАУ-геля шприцем, наполненным проточным буфером, и загрузите образец в лунку с помощью микропипетки.
  4. Подключите электрофоретическую камеру к источнику питания, положительным (красным) электродом расположите его внизу. Обратите внимание, когда IP > pH, белки заряжены положительно, поэтому миграция происходит с положительного на отрицательный электрод. Запустите гель сначала при напряжении 30 В в течение 70 мин, затем при постоянном напряжении 25 В в течение 17 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени время от времени выключайте электропитание и промывайте гелевые лунки с помощью одноразового шприца. Обратите внимание на удаление любых пузырьков с нижней поверхности геля с помощью шприца, чтобы избежать потери образца и наличия смазывания в растворенных белках.
  5. Снимите гель с гелевых пластин и разрежьте интересующую линию чистым скальпелем. Обращайтесь с гелем осторожно, чтобы избежать его поломки. Поскольку интересующая линия бесцветна, загрузите образец в лунку No 1, чтобы точно определить и перерезать интересующую полосу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить разделение на геле mini-TAU, подготовьте и запустите образец в двух экземплярах. Один из таких гелей можно окрашивать с помощью Coomassie Brilliant Blue. Схема разделения представлена на рисунке 1А.
  6. Промойте дорожку 15 мл 0,5 М Tris-HCl pH 8,8 в течение 15 минут.
  7. Приготовьте 15 мл уравновешивающего буфера 1, используя 6 М мочевины, 0,5 М Tris-HCl, pH 6,8, 30% глицерина, 20% SDS и 2% дитиоэритритола. Приготовьте 15 мл уравновешивающего буфера 2, используя 6 М мочевины, 0,5 М Tris-HCl, pH 6,8, 30% глицерина, 20% SDS и 2% йодоацетамида. Подготовьте уравновешивающий буфер 1 и 2 непосредственно перед использованием; Храните буфер уравновешивания 2 в темноте.
  8. Инкубировать гелевую дорожку, при слабом перемешивании, в 10 мл уравновешивающего буфера 1 в течение 15 мин, затем сцедить. Инкубируйте гелевую дорожку, под легким перемешиванием, с 10 мл уравновешивающего буфера 2 в течение 15 минут в темноте, затем сцедите.
  9. Приготовьте растворяющий гель SDS 15% акриламид, следуя таблице 1. Установите гелевую пластину и заполните ее раствором разрешающего геля. Залейте раствор до тех пор, пока он не окажется в 1,5 см от конца длинной гелевой пластины. Нанесите 1 мл изопропанола на поверхность, чтобы разровнять гель и дать ему полимеризоваться.
  10. После полимеризации геля сцедите изопропанол и высушите лунку бумагой для хроматографии 3MM Chr Cellulos. Получившуюся дорожку из шага 8 вставьте в гелевую лунку.
  11. Запечатайте дорожку до разрешающего геля герметизирующим раствором 0,5% агарозы с низкой температурой плавления в 1x Трис/глицин/SDS буфере и 5 мкл 0,003% бромфенолового синего. Дайте агарозному гелю полимеризоваться в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха во время запечатывания агарозой, чтобы предотвратить размазывание геля.
  12. Поместите гелевые пластины в кассету и заполните 1x Трис/глицин/SDS буфером. Запустите гель при напряжении 120 В, пока бромофенольный синий краситель не достигнет дна. Аккуратно снимите гель с пластин, выбросьте излишки агарозы, а серебро окрасьте гель с помощью процедуры, совместимой с масс-спектрометрией или блоттингом для иммунологического анализа.

3. Окрашивание серебром 32

  1. Приготовьте следующие реагенты - Фиксаторы: 50% метанола, 5% уксусной кислоты, 45% деионизированной воды; Промывочный раствор: 50% метанол, 50% деионизированная вода; Сенсибилизатор: 0,02% Na2S2O3 5H2O в деионизированной воде; Реагент серебра: 0,1% нитрата серебра в холодной (4°C) деионизированной воде; Проявитель: 0,04% формалина и 2% Na2CO3, формальдегида (37%) (добавить непосредственно перед использованием) 0,4 мл деионизированной воды и залить до 1000 мл; Стоп-реагент: 5% уксусной кислоты; Раствор для хранения геля: 1% уксусная кислота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку химические вещества, используемые для окрашивания, опасны, выполняйте все действия под вытяжным шкафом для химикатов.
  2. Следуйте процедуре, приведенной в таблице 2 , с учетом следующего. Все инкубации выполняйте с легким перемешиванием. Приготовьте стоп-реагент перед началом этапа проявки; Это обеспечит развитие геля с нужной интенсивностью. На этапе развития пятна будут появляться в виде желтых сигналов, которые станут светло-коричневыми в конце инкубации. Интенсивность различных пятен будет зависеть от количества гистоновых протеоформ. Гель готов к точечному иссечению и расщеплению в геле (Рисунок 1B)

4. Пищеварение в геле

  1. Приготовьте следующие растворы: 50 мМ бикарбоната аммония (NH4HCO3)/50% (v/v) ацетонитрила; 10 мМ дитиотреитол (DTT) в 50 мМ NH4HCO3; 55 мМ йодоацетамид (IAA) в 50 мМ NH4HCO3; 0,1% TFA; 50 мМ NH4HCO3, pH 8; Ацетонитрил класса ВЭЖХ; 1 мл силиконовых трубок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать загрязнения кератином человека с волос или кожи, используйте чистые перчатки и работайте в чистом месте.
  2. Удалите интересующие гистоны из окрашенного геля с помощью чистого скальпеля и поместите их в свежую силиконовую пробирку (1,5 мл). Обязательно иссекайте одно пятно и поместите его в одну пробирку, чтобы избежать перекрестного загрязнения изоформом.
  3. Добавьте в каждое гелевое пятно 250 мкл 50 мМ NH4HCO3/50% ацетонитрила и инкубируйте при слабом перемешивании в термомиксере при комнатной температуре. Сцедите раствор и повторите этот шаг 3 раза. Кусочки геля будут казаться прозрачными.
  4. Обезвоживайте гелевые пятна путем добавления ацетонитрила (200 μл). На этом этапе кусочки геля приобретут непрозрачно-белый цвет.
  5. Сцедите ацетонитрил и дайте высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Кусочек геля будет казаться высохшим в тюбике. Восстановление и алкилирование не являются существенными, поскольку белки гистонов восстанавливаются и алкилируются на этапе уравновешивания.
  6. Регидратируйте гелевые пятна в 20 мкл раствора трипсина (0,1 мМ HCl) или объеме, достаточном для покрытия кусочков геля. Поместите пробирки в термомиксер и инкубируйте при слабом перемешивании при температуре 37 °C в течение минимум 4-16 часов.
  7. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую триптические пептиды, в свежую пробирку. Добавьте 50 μл экстракционного раствора (60% ацетонитрила, 1% TFA) к кусочкам геля и 2 раза обработайте ультразвуком на ультразвуковой водяной бане в течение 10 минут при 4 °C.
  8. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую дополнительные триптические пептиды, в свежую трубку. Используйте лиофилизатор для сушки накопленных экстрагированных пептидов. Установите лиофилизатор на 30 °C и высушите раствор; В пробирке появится лиофилизированная гранула.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг зависит от объема; Как правило, достаточно 1 часа, но проверяйте объем каждые 10 минут, пока образец полностью не высохнет.
  9. Добавьте 15 мкл 0,1 % TFA в каждую пробирку и аккуратно инкубируйте в термомиксере при 25 °C. Перенесите надосадочную жидкость во флакон для анализа ЖХ-МС/МС.

5. 2DTAU вестерн-блот

  1. Приготовьте буфер для переноса, 250 мМ трис-основания, 92 мМ глицина и 10% метанола с помощью двойной дистиллированной воды.
  2. Обрежьте нитроцеллюлозную мембрану и фильтровальную бумагу по размерам геля.
  3. Уравновесьте гель и замочите мембрану, фильтровальную бумагу и фильтровальную бумагу в буфере для переноса на 15 минут. Используйте мембраны из нитроцеллюлозы или ПВДФ. При использовании мембран PVDF (поливинилидендифторид) активируйте их, замочив в 100% MetOH.
  4. Подготовьте гелевый бутерброд в кассете для полусухого переноса следующим образом: отрицательный электрод/фильтровальная бумага/гель/нитроцеллюлозная мембрана/фильтровальная бумага/положительный электрод. Удалите все пузырьки воздуха между гелем и мембраной, чтобы обеспечить хорошие результаты.
  5. Поместите кассету в полусухой блок и запустите блот при напряжении 25 В в течение 30 минут. В конце разберите промокательный бутерброд и сохраните мембрану для иммунологического анализа. Проверьте эффективность переноса с помощью окрашивания по Понсо. Отметьте мембрану знаком в правом верхнем углу, чтобы сохранить правильную ориентацию фильтра.
  6. Инкубируйте с первичными и вторичными антителами в зависимости от эксперимента (рис. 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1А можно наблюдать, как белки гистонов мигрируют в одномерном геле. Это важный предварительный шаг для понимания времени работы первого измерения. После того, как правильное время разделения определено, запустите второе измерение. На 2D-карт?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

За последнее десятилетие в терапии онкологических пациентов произошла революция за счет выявления различных молекулярных изменений, которые стимулируют развитие и прогрессирование рака. Наиболее значительным достижением в современной онкологии является разработ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Работа была поддержана PRIN2022, DS, CF и AC были поддержаны PRIN2022, а MLC была поддержана программой PhD в области молекулярной онкологии, школой UMG PhD. Работа также прошла при поддержке проекта PNRR INSIDE CUP: B83C22003920001

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DithioerythritolSIGMA- ALDRICHD8255 Reagent for maintaining −SH groups in the reduced state; quantitatively reduces disulfides.
1,5 M Tris-HCL buffer, pH 8.8BIO-RAD161-0798Resolving Gel Buffer
10x Tris/Glycine/SDS BIO-RAD 1610772Use this premixed 10x Tris/glycine/SDS running buffer to separate protein samples by SDS-PAGE.
2-PropanolSIGMA-ALDRICH335392-Propanol (Isopropanol) is a secondary alcohol. It has been tested as a substitute to fuel for use in various fuel cells. CuO powder dissolved in 2-propanol has been used for the laser ablation assisted synthesis of Cu colloids. Suspension of 2-propanol with Zn(NO3)2 has been employed for the fabrication of titanium dioxide-coated stainless steel (P25-TiO2/SS) photoanode coated with uniformly thick layer of P25-TiO2.This photoanode was used for the electrochemical photocatalytic (ECPC) degradation process.
30% Acrylamide/Bis Solution BIO-RAD16101582.6% Crosslinker. Electrophoresis purity reagent 
Acetic Acid GlacialCarlo Erba Reagennts401392Acetic acid is an important chemical reagent with many industrial applicatios.
AcetonePanreac Applichem211007.1214Acetone is a solvent, renowned for its versatility in various laboratory, manufacturing, and cleaning applications.
AcetonitileVWR83640320for HPLC   LC-MS grade
AgaroseInvitrogen15510-027Agarose is a heteropolysaccharide  frequently used in molecular biology.
Ammonium bicarbonateSIGMA-ALDRICHA6141minimum 99,0%
Ammonium persulfateSIGMA-ALDRICHA3678For molecular Biology, For electrophoresis, ≥98% 
Bioruptor plusDiagenodeB01020001 - B01020002- B01020003sonicator
DithiothreitolSIGMA- ALDRICHD9163-5GReducing agent used to reduce disulfide bonds in proteins.
Dodeca Silver Stain Kit BIO-RAD161-0480The Dodeca silver stain kit is easy-to-use for the detection of nonagram levels of proteins in polyacrylamide gels.
GlycerolGE - Healthcare Life Sciences171325010LGlycerol is a simple triol compound, it is involved to aid in casting gradient gels, protein stabilizer and storage buffer component.
Halt Phosphatase Inhibitor Thermo SCIENTIFIC78428Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail preserves the phosphorylation state of proteins during and after cell lysis or tissue protein extraction  Single- Use Cocktail (100X).  
Halt Protease Inhibitor Thermo SCIENTIFIC78430Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) are ready-to-use concentrated stock solutions of protease inhibitors for addition to samples to prevent proteolytic degradation during cell lysis and protein extraction. Single- Use Cocktail (100X).  
Hydrochloric acidSIGMA-ALDRICHH1758BioReagent, for molecular biology
IodoacetamideSIGMA-ALDRICHI6125≥99% (NMR), crystalline
KClSIGMA-ALDRICHP9541Potassium chloride, KCl, is generally used in laboratory routines. Its use as a storage buffer for pH electrodes and as a reference solution for conductivity measurements is well established.
MCF10 cell lineatccCRL-10317 epithelial cell line that was isolated in 1984 from the mammary gland of a White, 36-year-old female with fibrocystic breasts. This cell line was deposited by the Michigan Cancer Foundation.
MgCl2SIGMA-ALDRICH208337Magnesium chloride is a colorless crystalline solid.
N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamineSIGMA-ALDRICHT9281For Electrophoresis, approx. 99%
Phosphate saline buffer 1XCorning153736311 X PBS (phosphate buffered saline) is a buffered balanced salt solution used for a variety biological and cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Potassium hexacyanoferrateSIGMA-ALDRICH60299Electron acceptor, employed in systems involving electron transport,
SDS Solution 20% (w/v) BIO-RAD161-0418Sodium dodecyl sulfate. Electrophoresis purity reagent 
Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%SIGMA- ALDRICH21,726-3Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%
Sulfuric acidSIGMA-ALDRICH339741Sulfuric Acid, Reagent, is an extremely corrosive acid that comes as yellowy slightly viscous liquid. It is soluble in water and is a diprotic acid. It has very strong corrosive, dehydrating and oxidizing properties as well as being hygroscopic.
Trichloroacetic acidSIGMA-ALDRICHT6399-5GTrichloroacetic acid (TCA) is used as a reagent for the precipitation of proteins1,2 and nucleic acids3. 
Trifluoroacetic acidRiedel-de Haën34957Trifluoroacetic acid
Triton X-100SIGMA- ALDRICHT9284-1LTriton X-100 is a nonionic polyoxyethylene surfactant that is most frequently used to extract and solubilize proteins.
Trypsin from porcine pancreasSIGMA-ALDRICHT6567Proteomics Grade, BioReagent, Dimethylated
UREASIGMA-ALDRICH33247Urea is a chaotropic agent and is used for protein denaturation. It disturbs the hydrogen bonds in the secondary, tertiary and quaternary structure of proteins. It can also disturb hydrogen bonding present in DNA secondary structure

Ссылки

  1. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  2. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  3. Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  4. Sun, L., et al. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  5. Kinnaird, A., et al. Metabolic control of epigenetics in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).
  6. Díaz-Hirashi, Z., et al. Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis. Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).
  7. Panatta, E., et al. Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability. Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).
  8. Scumaci, D., Zheng, Q. Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer. Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).
  9. Chiaradonna, F., Scumaci, D. Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy. Cells. 10 (6), 1393(2021).
  10. Scumaci, D., et al. DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation. Cells. 9 (9), 1968(2020).
  11. Olivo, E., et al. Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism. Cells. 11 (9), 1432(2022).
  12. Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics. Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).
  13. Maksimovic, I., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code. Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).
  14. Lowe, B. R., et al. Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer. Cancers. 11 (5), 660(2019).
  15. Karsli-Ceppioglu, S. The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer. Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).
  16. Yang, C., et al. Histone methyltransferase and drug resistance in cancers. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).
  17. Vardabasso, C., et al. Histone variants: emerging players in cancer biology. Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).
  18. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).
  19. Liu, Y., et al. Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2. Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).
  20. Nowsheen, S., et al. ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage. Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).
  21. Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer. DNA Repair. 77, 87-95 (2019).
  22. Yang, Y., Wang, Y. Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment. Front Immunol. 12, 640369(2021).
  23. Miranda Furtado, C. L., et al. Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment. Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).
  24. Thomas, S. P., et al. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  25. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  26. Kwak, H. G., Dohmae, N. Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis. Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).
  27. Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).
  28. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  29. Basak, S. K., Ladisch, M. R. Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties. Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).
  30. Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors. Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).
  31. Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated. J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).
  32. Perri, A. M., et al. Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer. Aging. 11, 11722-11755 (2019).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  34. Omenn, G. S., et al. Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project. J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).
  35. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  36. Starkova, T. Y., et al. The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells. Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).
  37. García-Giménez, J. L., et al. Histone carbonylation occurs in proliferating cells. Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).
  38. García-Saura, A. G., Schüler, H. PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis. Cells. 10, 654(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

2D TAUSDS PAGE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены