2D-TAUゲル電気泳動によるヒストンプロテオフォームの解明

要約

この方法は、ヒストンプロテオフォームの特性評価と調査のためのシンプルで迅速な戦略を示しています。

要約

ヒストンは、メチル化、アセチル化、リン酸化、アシル化、ユビキチン化など、ヌクレオソームの動態を制御し、細胞の運命を決定するさまざまな翻訳後修飾(PTM)を受けます。クロマチンの機能単位であるヌクレオソームは、DNAと球状コアを構成する4対のヒストン(H3、H4、H2A、H2B)、クロマチン構造を安定化するリンカーヒストンH1から構成されています。ヒストンのアミノ(N)末端テールは球状コアドメインから突き出ており、クロマチンランドスケープに影響を与える明確なPTMを受けます。いくつかの証拠は、ヒストンPTM恒常性がすべての生理学的活性を維持するために重要であることを示唆しています。ヒストンPTMの調節解除は、異常な細胞増殖、浸潤、および転移の主な原因です。したがって、ヒストンPTMsを特徴付ける方法を開発することは非常に重要です。ここでは、ヒストンアイソフォームの単離と分析に有効な手法について説明します。この分析法は、2つの直交する分離の組み合わせに基づいており、ヒストンアイソフォームの濃縮とそれに続く質量分析の同定を可能にします。Shechterらによって最初に報告されたこの技術は、サイズと電荷に基づいて塩基性ヒストンタンパク質を分離できる酸性尿素ポリアクリルアミドゲル(TAU-GEL)と、分子量によってタンパク質を分離できるドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)を組み合わせたものです。その結果、ヒストンアイソフォームの2次元マップが得られ、ゲル内消化とそれに続く質量分析、およびウェスタンブロット分析に適しています。その結果、ヒストンアイソフォームの2次元マップが得られ、ゲル内消化とそれに続く質量分析の同定、およびウェスタンブロット分析の両方に適しています。このプロテオミクスアプローチは、単一のヒストンアイソフォームの濃縮と新しいヒストンPTMの特性評価を可能にする堅牢な方法です。

概要

がんの発症、進行、および化学療法抵抗性は、ヒストンPTMを含む遺伝的およびエピジェネティックなイベントに関連しています。ヒストンは、クロマチンダイナミクスを調節し、細胞の運命を決定するさまざまなPTMを受けます¹。

ヌクレオソームはクロマチンの機能単位であり、DNAを核にパッケージ化することを可能にするDNAとタンパク質の分子複合体です。ヌクレオソームコアを構成する4対のヒストン(H3、H4、H2A、H2B)と、クロマチン構造の安定化を助けるリンカーヒストンH1で構成されています。ヒストンのアミノ(N)末端尾部は、球状のコアドメインから突出し、クロマチンランドスケープに影響を与える特定の翻訳後修飾を受ける²。

これまでに、少なくとも23種類のヒストンPTMが知られています。これらのPTMは、主にメチル化、アセチル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、SUMO化、およびADP-リボシル化^からなる共有結合修飾です3。さらに、エピゲノムの恒常性と代謝再配線との間の密接な相関関係が最近提案されており、ヒストンPTM^の可能な数の指数関数的な増加を説明しています4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 .ヒストンPTMは、モディファイア酵素によって堆積、消去、および形質導入され、それぞれライター、イレイサー、リーダーと呼ばれます。それらはクロマチン構造の物理的および化学的特性に影響を及ぼし、腫瘍抑制遺伝子および癌遺伝子14,15,16の発現を含む遺伝子発現プロファイルに影響を与える。

ヒストンプロテオフォームの数は、ヒストン変異体としてヌクレオソームに取り込まれると増加します。これらの変異体は、標準的なヒストンの非対立遺伝子アイソフォームであり、クロマチンの化学的および物理的特性を変化させることにより複雑さを増します。標準的なヒストンと比較して、ヒストン変異体は、独自の翻訳後修飾を受けるか、特定のクロマチン成分と相互作用する機能ドメインを持ち、ヌクレオソーム¹⁷のダイナミクスと安定性に影響を与えます。

がん細胞では、ヒストンPTMおよび変異体の調節解除が遺伝子発現プロファイルに影響を及ぼし、異常な細胞増殖、浸潤、転移、および薬剤耐性経路の活性化につながる3,18,19,20。ヒストンまたはクロマチンリモデリング複合体内の変異は、細胞の表現型を変化させ、腫瘍性の形質転換に寄与する可能性があります。ヒストンメチル化などのエピジェネティックな変化の蓄積は、薬剤耐性経路を活性化する重要な要素^です21,22,23。SWI/SNF複合体内の変異は、29の遺伝子によってコードされる15のサブユニットから構成され、多くの腫瘍タイプにわたるヒトのがんの20%以上に影響を与えます。この10年間で、エピジェネティックに基づく薬物戦略(エピドラッグ)が開発され、ヒストン修飾パターンに異常があるがんを標的とした多くの薬剤が米国食品医薬品局(FDA)によって承認されています²³。

ヒストンタンパク質の分析は非常に困難であり、要求の厳しい研究分野となっています。最近では、質量分析法がヒストンプロテオフォームの特性評価と研究に適した方法となっています。しかし、抜本的な抽出条件は、一部のバリアントの溶解性の低さや配列相同性が高いことと相まって、その分析を困難にしています。

過去10年間で、ヒストンプロファイリングと調査のために、質量分析に基づくいくつかの方法が開発されてきました24,25,26,27。この研究では、ヒストンプロテオフォームの2次元マップを作成するための費用対効果が高く信頼性の高い方法を提示します。これにより、新しい翻訳後修飾を発見する可能性を高めることができます。

2D TAU電気泳動は、酸性条件下での分離とSDS PAGEを組み合わせたものです。最初の次元では、培地の酸性状態は、塩基性タンパク質に正味の正電荷を与えます。ヒストンは非常に塩基性タンパク質であり、培地と比較して等電点(pH)が高いため、正に帯電し、電場下で移動します。2次元では、ヒストンはSDSによって変性され、分子量に基づいて分離されます。得られた2Dマップは、質量分析分析および免疫学的研究^28,29のための単一スポット分解能で特定のプロテオフォームを濃縮するためのツールとして使用できる。電気泳動後、2D TAUスポットを脱染し、トリプシン消化し、質量分析法で分析することができます。あるいは、2D TAUマップをニトロセルロース/PVDFフィルターにブロットし、免疫染色²⁷によって調査することができる。

この文脈では、これらの方法は、代謝再配線と相関する新規の翻訳後修飾の同定と分析を改善するための戦略的である可能性があります^30,31。

私たちは、DNAの分解とタンパク質溶解性の向上に役立つ超音波処理ステップを組み込むことにより、元の方法をさらに改善しました。さらに、高純度のタンパク質サンプルを得るために、ヒストン抽出のためのインキュベーションステップを延長しました。さらに、私たちのプロトコルでは、より良い分解能を達成するために、最初の次元を低電圧でより長い時間実行しました。得られたゲルは、標準的なヒストンPTMを調査し、糖化などの新規修飾を特徴付けるために使用されました^10,32。

全体として、ヒストンを抽出・精製する方法を開発し、続いて2次元マップを用いてヒストンプロテオフォームを分離しました。この作業には、質量分析のためのゲル内消化の手順や、2次元ウェスタンブロット分析の手順も含まれています。

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プロトコル

1. ヒストン抽出

1. 80%がコンフルエントである少なくとも1 x 10⁶ 細胞からヒストン抽出を行います。この実験では、ATCCのMCF-10A細胞株を使用しました。プレーティング後、1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を3回洗浄します。氷上ですべてのステップを実行します。
2. 10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM KCl、および1.5 mM MgCl₂を含む細胞溶解バッファーを調製します。使用直前に1 mMジチオエリスリトールとプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加します。
3. 細胞含有シャーレに800 μLの細胞溶解バッファーを加え、細胞をこすり落とし、1.5 mLチューブに集めた後、ローテーター上で300 rpm、4°Cで1時間インキュベートします。
4. 10,000 x g、4°Cで、1.5 mLチューブ用のローテーターを備えた予冷マイクロ遠心分離機で10分間遠心分離します。
5. ペレットを400 μLの細胞溶解バッファーで洗浄し、10,000 x g、4°Cで10分間遠心分離します。上清を捨てます。洗浄手順を3回繰り返します。
   注:すべてのステップで、1.5 mLチューブ用のローテーターを備えた予冷された微量遠心分離機(4°C)を使用してください。材料の損失を避けるために、ペレットは慎重に取り扱ってください。
6. ペレットを640 μLの0.2 M H₂SO₄ に再懸濁し、ローテーター上で300 rpm、4°C、16時間インキュベートします。
   注意: 硫酸は危険な化学物質です。薬品ドラフトの下でご使用ください。
7. 16,000 x g、4°C、10分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移し、次の手順まで保管します。核の破片を捨てます。
8. 212 μLのトリクロロ酢酸を一滴ずつ添加してヒストンを沈殿させます(TCAの最終濃度は33%)。チューブを10倍反転させて溶液を混合します。氷上で、暗闇の中で16時間インキュベートします。
   注意: TCAは危険な化学物質です。化学薬品のヒュームフードの下で使用してください。
9. ヒストンをペレット化するには、予冷した遠心分離機で16,000 x g 、4°Cで10分間遠心します。 上清を慎重に取り除き、ペレットを200μLの冷たいアセトンで3回洗浄します。
10. ペレットを冷たいアセトンで再懸濁し、次に30秒のオン/オフを3サイクルで高出力2回超音波処理し、氷上で10分間の一時停止を交互に行います。
    注:この手順は超音波装置を使用して行われました。このステップは、ヒストンに包まれたDNAを排除するために不可欠です。
11. 16,000 x g で 10 分間遠心分離し、アセトンを廃棄し、サンプルを 100 μL の再蒸留水に再懸濁します。製造元の指示に従って、Bradfordアッセイ法を使用してタンパク質濃度を決定する³³。
    注:遠心分離後、ペレットが白くまたは半透明に見えることがあります。白く不透明な沈殿物は、2D 分離を損なう可能性のある塩分汚染物質の存在を示している可能性があります。その場合は、ペレットが半透明になるまでアセトン洗浄手順を繰り返します。
12. 製造元の指示に従って、70μgのヒストンを凍結乾燥します。凍結乾燥機を30°Cに60分間セットします。チューブの容量を確認し、サンプルが完全に凍結乾燥されるまで30°Cでステップを繰り返します(通常、サンプルを完全に凍結乾燥するには90分が必要です)。60分後、プロセスはサンプルに依存するため、10分ごとに容量を確認してください。
    注:ヒストンタンパク質の量が少ない場合は、2 x 10⁶ 細胞から開始します。この場合、1 x 10⁶ セルに使用したのと同じ量の試薬を使用してください。手順中に使用されるすべての化学物質の純度を確認してください。すべての試薬はHPLCグレードでなければなりません。

2. ミニ2Dゲルトリトン酸尿素(TAU)電気泳動

1. 以下に説明するように、mini vertical polyacrylamide gel electrophoresis system 用のmini-TAUゲルを調製します。
   1. 分離ゲルを調製:6 M尿素、15%アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)、5%氷酸酢酸、0.25%Triton X-100(v / v)、0.4%TEMED(v / v)、0.1%APS(p / v)。溶液を調製するには、尿素をアクリルアミド/ビスと超純水1mLに溶解し、室温で穏やかに攪拌します。他のコンポーネントを追加し、音量を調整します。mini-TAUゲルの場合は、10 mLの溶液を調製します。プリセットされたゲルプレートに溶液を充填し、上部からわずか1.5cmのところに気泡が形成されないようにします。溶液を1mLのイソプロパノールで覆い、ゲルを平らにします。
   2. スタッキングゲルを調製:6 M尿素、6%アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)、5%氷酸酢酸、0.25%Triton X-100(v / v)、0.4%TEMED(v / v)、0.1%APS(p / v)。溶液を調製するには、尿素をアクリルアミド/ビスと1mLの超純水に溶解します。他のコンポーネントを追加し、音量を調整します。ゲルプレートにスタッキング溶液を充填し、プレートの間に10ウェルのゲルコームを置き、ゲル溶液がコームの歯の半分まで来るまで挿入します。ゲルを4°Cで16時間重合させます。
      注意: 井戸が規則的に形成されるように、コームを慎重に挿入します。
2. 6 M 尿素、5% 氷酸酢酸、および再蒸留水を溶解して、100 μL の TAU サンプルバッファーを調製します。調製した凍結乾燥サンプルを30 μLのTAUサンプルバッファーに溶解します。
3. ミニカセットにTAUランニングバッファー、5%酢酸最終濃度を充填します。TAU-gelのウェルをランニングバッファーで満たされたシリンジで洗い流し、マイクロピペットを使用してサンプルをウェルにロードします。
4. 電気泳動チャンバーを電源に接続し、プラス(赤)電極を下部に配置します。IPがpH>すると、タンパク質は正に帯電するため、正極から負極への移行になることに注意してください。まずゲルを30Vで70分間、次に25Vの定電圧で17時間泳動します。
   注意: この間、時々電源を切り、使い捨ての注射器を使用してゲルウェルをすすいでください。シリンジを使用してゲルの底面から気泡を取り除くように注意し、サンプルの損失や分離されたタンパク質の汚れの存在を避けてください。
5. ゲルプレートからゲルを取り出し、きれいなメスで目的の線を切ります。ゲルの破損を防ぐために、ゲルは慎重に取り扱ってください。対象ラインは無色であるため、サンプルをウェル番号1にロードして、対象レーンを正確に特定してカットします。
   注:mini-TAUゲルでの分離を確認するには、サンプルを二重に調製して分析します。これらのゲルの1つは、Coomassie Brilliant Blueを使用して染色できます。分離のパターンを 図 1A に示します。
6. レーンを 15 mL の 0.5 M Tris-HCl pH 8.8 で 15 分間洗浄します。
7. 6 M 尿素、0.5 M Tris-HCl、pH 6.8、30% グリセロール、20% SDS、および 2% ジチオエリスリトールを使用して、15 mL の平衡化バッファー 1 を調製します。6 M 尿素、0.5 M Tris-HCl、pH 6.8、30% グリセロール、20% SDS、および 2% ヨードアセトアミドを使用して、15 mL の平衡化バッファー 2 を調製します。使用直前に平衡化バッファー1および2を準備します。平衡化バッファー2を暗所に保管します。
8. 穏やかに撹拌しながら、ゲルレーンを10 mLの平衡緩衝液1で15分間インキュベートし、次いでデカントします。穏やかに攪拌しながら、10 mLの平衡緩衝液2とゲルレーンを暗所で15分間インキュベートし、その後デカントします。
9. 表1に従って、分離SDS 15%アクリルアミドゲルを調製します。ゲルプレートをセットし、分離ゲル溶液を充填します。長いゲルプレートの端から1.5cmになるまで溶液を満たします。表面に1mLのイソプロパノールを敷いてゲルを平らにし、重合させます。
10. ゲル重合後、イソプロパノールをデカントし、3MM Chr Cellulose Chromatography Paperでウェルを乾燥させます。ステップ8で得られたレーンをゲルウェルに挿入します。
11. 1x Tris/glycine/SDSバッファーに0.5%低融点アガロースを溶かし、0.003%ブロモフェノールブルー5μLのシール溶液で、レーンを分離ゲルにシールします。アガロースゲル重合を30分間行います。
    注:ゲルの汚れを防ぐために、アガロースのシーリング中に気泡が形成されないようにしてください。
12. ゲルプレートをカセットに入れ、1x Tris/グリシン/SDSバッファーを充填します。ブロモフェノールブルー染料が底に達するまで、ゲルを120Vで泳がせます。プレートからゲルを静かに取り出し、余分なアガロースを廃棄し、質量分析または免疫学的アッセイ用のブロットと互換性のある手順を使用してゲルを銀染色します。

3. 銀染色 ³²

1. 以下の試薬を準備します - 固定剤:50%メタノール、5%酢酸、45%脱イオン水;洗浄液:メタノール50%、脱イオン水50%。増感剤:脱イオン水中の0.02%Na₂S₂O₃ 5H₂O;銀試薬:0.1%硝酸銀を冷水(4°C)脱イオン水に溶かします。現像液:0.04%ホルマリンおよび2%Na₂CO₃、ホルムアルデヒド(37%)(使用直前に添加)0.4mLの脱イオン水および1000mLまで充填する。ストップ試薬:5%酢酸;ゲル保存溶液:1%酢酸。
   注:染色に使用する薬品は危険ですので、すべての手順を薬品ドラフトの下で行ってください。
2. 表 2 の手順に従って、以下の点を考慮してください。すべてのインキュベーションを穏やかに攪拌して行ってください。現像ステップを開始する前に、停止試薬を準備します。これにより、適切な強度でゲルの発達が保証されます。開発段階では、スポットが黄色のシグナルとして現れ、インキュベーションの終了時には薄茶色になります。異なるスポットの強度は、ヒストンプロテオフォームの量によって異なります。ゲルは、スポット切除およびゲル内消化の準備ができています(図1B)

4. ゲル内消化

1. 次の溶液を準備します:50 mM重炭酸アンモニウム(NH₄HCO3)/ 50%(v / v)アセトニトリル;10 mM ジチオスレイトール (DTT) in 50 mM NH₄HCO₃;50 mM NH₄HCO₃ 中の 55 mM ヨードアセトアミド (IAA);0.1%TFA;50 mM NH₄HCO₃、pH 8;HPLCグレードのアセトニトリル;1mLシリコンチューブ。
   注意: 髪の毛や皮膚からの人間のケラチン汚染を回避するには、清潔な手袋を使用し、清潔な場所で作業してください。
2. 清潔なメスを使用して染色したゲルから目的のヒストンスポットを切除し、それらを新しいシリコンチューブ(1.5 mL)に入れます。アイソフォームの相互汚染を避けるために、1つのスポットを切り取り、1つのチューブに入れるように注意してください。
3. 各ゲルスポットに250 μLの50 mM NH₄HCO₃/50%アセトニトリルを添加し、室温のサーモミキサーで穏やかに攪拌しながらインキュベートします。溶液をデカントし、この手順を3回繰り返します。ゲル片は透明に見えます。
4. アセトニトリル(200 μL)を添加してゲルスポットを脱水します。この段階で、ゲル片は不透明な白色を帯びます。
5. アセトニトリルをデカントし、10分間風乾させます。ゲル片はチューブ内で乾燥しているように見えます。ヒストンタンパク質は平衡化ステップ中に還元およびアルキル化されているため、還元とアルキル化は必須ではありません。
6. ゲルスポットを20 μLのトリプシン溶液(0.1 mM HCl)またはゲル片を覆うのに十分な容量で再水和します。チューブをサーモミキサーに入れ、穏やかに攪拌しながら、37°Cで最低4時間から16時間インキュベートします。
7. トリプシンペプチドを含む上清を新しいチューブに移します。.50 μLの抽出溶液(60%アセトニトリル、1%TFA)をゲル片に加え、超音波水浴で4°Cで10分間2回超音波処理します。
8. 追加のトリプシンペプチドを含む上清を新鮮なチューブに移します。凍結乾燥機を使用して、プールされた抽出ペプチドを乾燥させます。凍結乾燥機を30°Cにセットし、溶液を乾燥させます。凍結乾燥されたペレットがチューブ内に現れます。
   注: この手順はボリュームに依存します。一般的には1時間で十分ですが、サンプルが完全に乾燥するまで10分ごとに容量を確認してください。
9. 各チューブに15 μLの0.1 % TFAを加え、25°Cのサーモミキサーで静かにインキュベートします。 上清をバイアルに移し、LC-MS/MS 分析を行います。

5. 2DTAUウェスタンブロット

1. トランスファーバッファー、250 mM Tris base、92 mM グリシン、および 10% メタノールを、再蒸留水で調製します。
2. ニトロセルロースメンブレンと濾紙をゲルの寸法にカットします。
3. ゲルを平衡化し、メンブレン、濾紙、および濾紙を転写緩衝液に15分間浸します。ニトロセルロースまたはPVDFメンブレンのいずれかを使用してください。PVDF(ポリフッ化ビニリデン)メンブレンを使用する場合は、100%MetOHに浸して活性化します。
4. 次のようにセミドライ転写用のカセットにゲルサンドイッチを準備します:負極/フィルターペーパー/ゲル/ニトロセルロース膜/フィルターペーパー/正極。ゲルとメンブレンの間の気泡を取り除き、良好な結果が得られるようにします。
5. カセットをセミドライユニットにセットし、ブロットを25Vで30分間泳動します。最後に、ブロッティングサンドイッチを分解し、免疫学的アッセイのためにメンブレンを保存します。Ponceau染色で転写効率を確認します。メンブレンの右上に記号を付けて、フィルターの向きを適切に保ちます。
6. 実験に応じて、一次抗体および二次抗体とインキュベートします(図2)。

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結果

図1Aでは、ヒストンタンパク質が1Dゲル内でどのように移動するかを観察することができます。これは、最初の次元の実行時間を理解するための重要な準備ステップです。分離の適切な時間が決まったら、2 番目のディメンションを実行します。ヒストンプロテオフォームの2Dマップは、独特のトポグラフィーパターンを示しています(

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ディスカッション

過去10年間で、がん患者の治療は、がんの発生と進行を促進するさまざまな分子変化を特定することにより、革命をもたらしました。現代の腫瘍学における最も重要な進歩は、包括的な分子解析に基づく治療法の開発です。ゲノミクスとプロテオミクスの技術的進歩は、早期発見、監視、予後、および薬物モニタリングのための特定のバイオマーカーのプロファイリ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	SIGMA- ALDRICH	D8255	Reagent for maintaining −SH groups in the reduced state; quantitatively reduces disulfides.
1,5 M Tris-HCL buffer, pH 8.8	BIO-RAD	161-0798	Resolving Gel Buffer
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD	1610772	Use this premixed 10x Tris/glycine/SDS running buffer to separate protein samples by SDS-PAGE.
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	33539	2-Propanol (Isopropanol) is a secondary alcohol. It has been tested as a substitute to fuel for use in various fuel cells. CuO powder dissolved in 2-propanol has been used for the laser ablation assisted synthesis of Cu colloids. Suspension of 2-propanol with Zn(NO3)2 has been employed for the fabrication of titanium dioxide-coated stainless steel (P25-TiO2/SS) photoanode coated with uniformly thick layer of P25-TiO2.This photoanode was used for the electrochemical photocatalytic (ECPC) degradation process.
30% Acrylamide/Bis Solution	BIO-RAD	1610158	2.6% Crosslinker. Electrophoresis purity reagent
Acetic Acid Glacial	Carlo Erba Reagennts	401392	Acetic acid is an important chemical reagent with many industrial applicatios.
Acetone	Panreac Applichem	211007.1214	Acetone is a solvent, renowned for its versatility in various laboratory, manufacturing, and cleaning applications.
Acetonitile	VWR	83640320	for HPLC   LC-MS grade
Agarose	Invitrogen	15510-027	Agarose is a heteropolysaccharide  frequently used in molecular biology.
Ammonium bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	A6141	minimum 99,0%
Ammonium persulfate	SIGMA-ALDRICH	A3678	For molecular Biology, For electrophoresis, ≥98%
Bioruptor plus	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	sonicator
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	Reducing agent used to reduce disulfide bonds in proteins.
Dodeca Silver Stain Kit	BIO-RAD	161-0480	The Dodeca silver stain kit is easy-to-use for the detection of nonagram levels of proteins in polyacrylamide gels.
Glycerol	GE - Healthcare Life Sciences	171325010L	Glycerol is a simple triol compound, it is involved to aid in casting gradient gels, protein stabilizer and storage buffer component.
Halt Phosphatase Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail preserves the phosphorylation state of proteins during and after cell lysis or tissue protein extraction  Single- Use Cocktail (100X).
Halt Protease Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) are ready-to-use concentrated stock solutions of protease inhibitors for addition to samples to prevent proteolytic degradation during cell lysis and protein extraction. Single- Use Cocktail (100X).
Hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReagent, for molecular biology
Iodoacetamide	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥99% (NMR), crystalline
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	Potassium chloride, KCl, is generally used in laboratory routines. Its use as a storage buffer for pH electrodes and as a reference solution for conductivity measurements is well established.
MCF10 cell line	atcc	CRL-10317	epithelial cell line that was isolated in 1984 from the mammary gland of a White, 36-year-old female with fibrocystic breasts. This cell line was deposited by the Michigan Cancer Foundation.
MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	Magnesium chloride is a colorless crystalline solid.
N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamine	SIGMA-ALDRICH	T9281	For Electrophoresis, approx. 99%
Phosphate saline buffer 1X	Corning	15373631	1 X PBS (phosphate buffered saline) is a buffered balanced salt solution used for a variety biological and cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Potassium hexacyanoferrate	SIGMA-ALDRICH	60299	Electron acceptor, employed in systems involving electron transport,
SDS Solution 20% (w/v)	BIO-RAD	161-0418	Sodium dodecyl sulfate. Electrophoresis purity reagent
Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%	SIGMA- ALDRICH	21,726-3	Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%
Sulfuric acid	SIGMA-ALDRICH	339741	Sulfuric Acid, Reagent, is an extremely corrosive acid that comes as yellowy slightly viscous liquid. It is soluble in water and is a diprotic acid. It has very strong corrosive, dehydrating and oxidizing properties as well as being hygroscopic.
Trichloroacetic acid	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	Trichloroacetic acid (TCA) is used as a reagent for the precipitation of proteins1,2 and nucleic acids3.
Trifluoroacetic acid	Riedel-de Haën	34957	Trifluoroacetic acid
Triton X-100	SIGMA- ALDRICH	T9284-1L	Triton X-100 is a nonionic polyoxyethylene surfactant that is most frequently used to extract and solubilize proteins.
Trypsin from porcine pancreas	SIGMA-ALDRICH	T6567	Proteomics Grade, BioReagent, Dimethylated
UREA	SIGMA-ALDRICH	33247	Urea is a chaotropic agent and is used for protein denaturation. It disturbs the hydrogen bonds in the secondary, tertiary and quaternary structure of proteins. It can also disturb hydrogen bonding present in DNA secondary structure