Enthüllung von Histon-Proteoformen mit 2D-TAU-Gelelektrophorese

Zusammenfassung

Diese Methode beschreibt eine einfache und schnelle Strategie zur Charakterisierung und Untersuchung von Histon-Proteoformen.

Zusammenfassung

Histone durchlaufen verschiedene posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Acylierung und Ubiquitinierung, die die Nukleosomendynamik steuern und das Zellschicksal bestimmen. Das Nukleosom, das die funktionelle Einheit des Chromatins darstellt, besteht aus DNA, vier Paaren von Histonen (H3, H4, H2A und H2B), die den globulären Kern bilden, und dem Linker-Histon H1, das die Chromatinstruktur stabilisiert. Die Amino(N)-terminalen Schwänze der Histone ragen aus den kugelförmigen Kerndomänen heraus und durchlaufen unterschiedliche PTMs, die die Chromatinlandschaft beeinflussen. Einige Hinweise deuten darauf hin, dass die Histon-PTM-Homöostase für die Erhaltung aller physiologischen Aktivitäten von entscheidender Bedeutung ist. Die Deregulierung von Histon-PTMs ist die Hauptursache für abnormale zelluläre Proliferation, Invasion und Metastasierung. Daher ist die Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Histon-PTMs von entscheidender Bedeutung. Hier beschreiben wir eine effektive Technik zur Isolierung und Analyse von Histon-Isoformen. Die Methode, die auf der Kombination von zwei orthogonalen Trennungen basiert, ermöglicht die Anreicherung von Histon-Isoformen und die anschließende massenspektrometrische Identifizierung. Die Technik, die ursprünglich von Shechter et al. beschrieben wurde, kombiniert Säure-Harnstoff-Polyacrylamid-Gele (TAU-GEL), die basische Histonproteine basierend auf Größe und Ladung trennen können, und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gele (SDS-PAGE), die Proteine nach Molekulargewicht trennen können. Das Ergebnis ist eine zweidimensionale Karte der Histon-Isoformen, die sich für den In-Gel-Aufschluss eignet, gefolgt von der massenspektrometrischen Identifizierung und der Western-Blot-Analyse. Das Ergebnis ist eine zweidimensionale Karte der Histon-Isoformen, die sowohl für den In-Gel-Aufschluss gefolgt von der massenspektrometrischen Identifizierung als auch für die Western-Blot-Analyse geeignet ist. Dieser proteomische Ansatz ist eine robuste Methode, die die Anreicherung einer einzelnen Histon-Isoform und die Charakterisierung neuer Histon-PTMs ermöglicht.

Einleitung

Der Beginn, das Fortschreiten und die Chemoresistenz von Krebs hängen mit genetischen und epigenetischen Ereignissen zusammen, einschließlich Histon-PTMs. Histone durchlaufen eine Vielzahl von PTMs, die die Chromatindynamik regulieren und das Zellschicksal bestimmen¹.

Das Nukleosom ist die funktionelle Einheit des Chromatins und ist ein molekularer Komplex aus DNA und Proteinen, der es ermöglicht, DNA in den Zellkern zu packen. Es besteht aus vier Paaren von Histonen (H3, H4, H2A und H2B), die den Nukleosomenkern bilden, sowie dem Linker-Histon H1, das zur Stabilisierung der Chromatinstruktur beiträgt. Die Amino-(N)-terminalen Schwänze der Histone ragen aus ihren kugelförmigen Kerndomänen heraus und durchlaufen spezifische posttranslationale Modifikationen, die die Chromatinlandschaft beeinflussen².

Bisher sind mindestens 23 Klassen von Histon-PTMs bekannt. Bei diesen PTMs handelt es sich um kovalente Modifikationen, die hauptsächlich aus Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Glykosylierung, Ubiquitylierung, SUMOylierung und ADP-Ribosylierung^{bestehen 3}. Darüber hinaus wurde kürzlich eine enge Korrelation zwischen der Epigenomhomöostase und der metabolischen Neuverdrahtung vorgeschlagen, was das exponentielle Wachstum der möglichen Anzahl von Histonen PTMs 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 erklärt . Histon-PTMs, die von Modifikatorenzymen abgeschieden, gelöscht und transduziert werden, werden jeweils als Writer, Eraser und Reader bezeichnet. Sie beeinflussen die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Chromatinstruktur und beeinflussen das Genexpressionsprofil, einschließlich der Expression von Tumorsuppressorgenen und Onkogenen 14,15,16.

Die Anzahl der Histon-Proteoformen nimmt zu, wenn sie als Histonvarianten in das Nukleosom eingebaut werden. Diese Varianten sind nicht-allelische Isoformen von kanonischen Histonen und erhöhen die Komplexität, indem sie die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Chromatins verändern. Im Vergleich zu kanonischen Histonen weisen Histonvarianten funktionelle Domänen auf, die einzigartige posttranslationale Modifikationen durchlaufen oder mit spezifischen Chromatinkomponenten interagieren, was sich auf die Dynamik und Stabilität des Nukleosoms auswirkt¹⁷.

In Krebszellen beeinflusst die Deregulierung von Histon-PTMs und -Varianten das Genexpressionsprofil, was zu einer abnormalen zellulären Proliferation, Invasion, Metastasierung und Aktivierung von Arzneimittelresistenzwegen führt 3,18,19,20. Mutationen in Histonen oder Chromatin-Remodeling-Komplexen können den Zellphänotyp verändern und zur neoplastischen Transformation beitragen. Die Akkumulation epigenetischer Veränderungen, wie z. B. der Histonmethylierung, ist ein Schlüsselfaktor bei der Aktivierung von Arzneimittelresistenzwegen 21,22,23. Mutationen innerhalb des SWI/SNF-Komplexes, der aus 15 Untereinheiten besteht, die von 29 Genen kodiert werden, betreffen über 20 % der menschlichen Krebserkrankungen bei vielen Tumorarten. In den letzten zehn Jahren wurden epigenetisch basierte Arzneimittelstrategien (Epi-Drugs) entwickelt, und viele Medikamente, die auf Krebs mit abnormalen Histon-Modifikationsmustern abzielen, wurden von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) ^zugelassen23.

Die Analyse von Histonproteinen ist eine große Herausforderung und damit ein anspruchsvolles Forschungsgebiet. In jüngster Zeit haben sich massenspektrometrische Methoden zur bevorzugten Methode zur Charakterisierung und Untersuchung von Histon-Proteoformen entwickelt. Die drastischen Extraktionsbedingungen in Kombination mit der schlechten Löslichkeit einiger Varianten und der hohen Sequenzhomologie machen ihre Analyse jedoch zu einer Herausforderung.

In den letzten zehn Jahren wurden mehrere massenspektrometrische Methoden für die Erstellung und Untersuchung von Histonprofilen entwickelt 24,25,26,27. In dieser Studie stellen wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode vor, um eine zweidimensionale Karte von Histon-Proteoformen zu erstellen, die die Chancen auf die Entdeckung neuer posttranslationaler Modifikationen erhöhen kann.

Die 2D-TAU-Elektrophorese kombiniert die Trennung unter sauren Bedingungen mit SDS PAGE. In der ersten Dimension gibt der saure Zustand des Mediums den basischen Proteinen eine positive Nettoladung. Da Histone sehr basische Proteine sind und im Vergleich zum Medium einen höheren isoelektrischen Punkt (pH) haben, werden sie positiv geladen und wandern unter einem elektrischen Feld. In der zweiten Dimension werden Histone mittels SDS denaturiert und anhand ihres Molekulargewichts getrennt. Die resultierende 2D-Karte kann als Werkzeug zur Anreicherung spezifischer Proteoformen mit Einzelpunktauflösung für massenspektrometrische Analysen und immunologische Studien verwendet werden^28,29. Nach der Elektrophorese können 2D-TAU-Spots entfärbt, mit Trypsin verdaut und mittels Massenspektrometrie analysiert werden. Alternativ kann die 2D-TAU-Karte auf einen Nitrozellulose/PVDF-Filter geblottet und durch Immunfärbung untersucht werden²⁷.

In diesem Zusammenhang könnten die Methoden strategisch sein, um die Identifizierung und Analyse neuer posttranslationaler Modifikationen, die mit metabolischer Neuverdrahtung korrelieren, zu verbessern^30,31.

Wir haben die ursprüngliche Methode weiter verbessert, indem wir einen Ultraschallschritt eingebaut haben, der für den DNA-Abbau und die Verbesserung der Proteinlöslichkeit hilfreich ist. Darüber hinaus haben wir den Inkubationsschritt für die Histonextraktion verlängert, um eine Proteinprobe mit hoher Reinheit zu erhalten. Darüber hinaus haben wir in unserem Protokoll die erste Dimension über einen längeren Zeitraum bei niedriger Spannung laufen lassen, um eine bessere Auflösung zu erreichen. Das resultierende Gel wurde zur Untersuchung kanonischer Histone PTMs und zur Charakterisierung neuartiger Modifikationen wie der Glykation^{verwendet 10,32}.

Insgesamt haben wir eine Methode zur Extraktion und Reinigung von Histonen entwickelt, gefolgt von der Auflösung von Histon-Proteoformen mit Hilfe einer zweidimensionalen Karte. Die Arbeit umfasst auch ein Verfahren zum In-Gel-Aufschluss für die massenspektrometrische Analyse und die Schritte zur zweidimensionalen Western-Blot-Analyse.

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Protokoll

1. Histon-Extraktion

1. Führen Sie eine Histonextraktion aus mindestens 1 x 10⁶ Zellen durch, die zu 80 % konfluent sind. Für dieses Experiment haben wir MCF-10A-Zelllinien von ATCC verwendet. Nach dem Plattieren die Zellen dreimal mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1x waschen. Führen Sie alle Schritte auf Eis aus.
2. Bereiten Sie einen Zelllysepuffer vor, der 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM KCl und 1,5 mM MgCl₂ enthält. Fügen Sie kurz vor Gebrauch 1 mM Dithioerythrit sowie Protease- und Phosphatasehemmer hinzu.
3. Geben Sie 800 μl Zelllysepuffer in die zellhaltige Petrischale, kratzen und sammeln Sie die Zellen in einem 1,5-ml-Röhrchen, dann inkubieren Sie sie auf einem Rotator bei 300 U/min und 4 °C für 1 h.
4. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g, 4 °C, für 10 min in einer vorgekühlten Mikrozentrifuge mit einem Rotator für 1,5 mL Röhrchen.
5. Waschen Sie das Pellet mit 400 μl Zelllysepuffer und zentrifugieren Sie es bei 10.000 x g, 4 °C, für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Waschschritt 3x.
   HINWEIS: Verwenden Sie für alle Schritte eine vorgekühlte Mikrozentrifuge (4 °C) mit einem Rotator für 1,5-ml-Röhrchen. Behandeln Sie das Pellet vorsichtig, um Materialverlust zu vermeiden.
6. Das Pellet wird in 640 μl 0,2 M H₂SO₄ resuspendiert und auf einem Rotator bei 300 U/min bei 4 °C 16 h lang inkubiert.
   ACHTUNG: Schwefelsäure ist eine gefährliche Chemikalie; Bitte verwenden Sie es unter einem chemischen Abzug.
7. Zentrifugieren bei 16.000 x g, 4 °C, für 10 min. Füllen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und lagern Sie ihn bis zu den folgenden Schritten. Entsorgen Sie den nuklearen Schutt.
8. Haustone durch Zugabe von 212 μl Trichloressigsäure tropfenweise ausfällen (die Endkonzentration von TCA beträgt 33%). Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Röhrchen 10x umdrehen. Inkubieren Sie 16 Stunden lang im Dunkeln auf Eis.
   ACHTUNG: TCA ist eine gefährliche Chemikalie; Verwendung unter einem chemischen Abzug.
9. Pellet-Histone durch Schleudern in einer vorgekühlten Zentrifuge bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie das Pellet 3x mit 200 μL kaltem Aceton.
10. Resuspendieren Sie das Pellet mit kaltem Aceton und beschallen Sie es dann 2x mit 3 Zyklen von 30 s ein/aus, abwechselnd mit einer 10-minütigen Pause auf Eis.
    HINWEIS: Der Eingriff wurde mit einem Ultraschallgerät durchgeführt. Dieser Schritt ist wichtig, um histonumhüllte DNA zu eliminieren.
11. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 16.000 x g , verwerfen Sie das Aceton und resuspendieren Sie die Probe in 100 μl doppelt destilliertem Wasser. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der Bradford-Assay-Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers³³.
    HINWEIS: Nach dem Zentrifugieren erscheint das Pellet manchmal weiß oder durchscheinend. Ein weißer und undurchsichtiger Niederschlag könnte auf das Vorhandensein von Salzverunreinigungen hinweisen, die die 2D-Trennung beeinträchtigen könnten. Wenn ja, wiederholen Sie die Aceton-Waschschritte, bis das Pellet durchscheinend wird.
12. Lyophilisieren Sie 70 μg Histone gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie den Gefriertrockner für 60 Minuten auf 30 °C ein. Überprüfen Sie das Volumen des Röhrchens und wiederholen Sie den Schritt bei 30 °C, bis die Probe vollständig lyophilisiert ist (in der Regel sind 90 Minuten erforderlich, um die Probe vollständig zu lyophilisieren). Nach 60 Minuten ist die Lautstärke alle 10 Minuten zu überprüfen, da der Vorgang probenabhängig ist.
    HINWEIS: Wenn die Menge an Histonproteinen gering ist, beginnen Sie mit 2 x 10⁶ Zellen. Verwenden Sie in diesem Fall das gleiche Volumen an Reagenzien, das für 1 x 10⁶ Zellen verwendet wird. Überprüfen Sie die Reinheit aller Chemikalien, die während des Eingriffs verwendet werden. Alle Reagenzien müssen HPLC-Qualität haben.

2. Mini-2D-Gel-Tritonsäure-Harnstoff-Elektrophorese (TAU)

1. Bereiten Sie ein Mini-TAU-Gel für ein vertikales Mini-Polyacrylamid-Gelelektrophoresesystem vor, wie unten beschrieben.
   1. Trenngel vorbereiten: 6 M Harnstoff, 15 % Acrylamid/Bisacrylamid (29:1), 5 % Eissäureessig, 0,25 % Triton X-100 (v/v), 0,4 % TEMED (v/v), 0,1 % APS (p/v). Zur Herstellung der Lösung Harnstoff in Acrylamid/bis und 1 ml Reinstwasser unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur auflösen; Fügen Sie die anderen Komponenten hinzu und passen Sie die Lautstärke an. Bereiten Sie für ein Mini-TAU-Gel 10 ml Lösung vor. Füllen Sie die voreingestellten Gelplatten mit der Lösung, um die Bildung von Luftblasen in nur 1,5 cm Entfernung von oben zu vermeiden. Bedecken Sie die Lösung mit 1 ml Isopropanol, um das Gel auszugleichen.
   2. Stapelgel vorbereiten: 6 M Urea, 6 % Acrylamid/Bisacrylamid (29:1), 5 % Eissäureessig, 0,25 % Triton X-100 (v/v), 0,4 % TEMED (v/v), 0,1 % APS (p/v). Zur Herstellung der Lösung Harnstoff in Acrylamid/bis und 1 ml Reinstwasser auflösen; Fügen Sie die anderen Komponenten hinzu und passen Sie die Lautstärke an. Füllen Sie die Gelplatten mit Stapellösung, platzieren Sie einen 10-Well-Gelkamm zwischen den Platten und führen Sie ihn ein, bis die Gellösung auf halber Höhe der Zähne des Kamms ankommt. Lassen Sie das Gel 16 h bei 4 °C polymerisieren.
      HINWEIS: Führen Sie den Kamm vorsichtig ein, um die regelmäßige Bildung von Vertiefungen zu gewährleisten.
2. Bereiten Sie 100 μl TAU-Probenpuffer vor, indem Sie 6 M Harnstoff, 5 % Eissäureessig und doppelt destilliertes Wasser auflösen. Die lyophilisierte Probe wird in 30 μl TAU-Probenpuffer aufgelöst.
3. Füllen Sie die Minikassette mit TAU Laufpuffer, 5% Essigsäure-Endkonzentration. Spülen Sie die Wells des TAU-Gels mit einer mit Laufpuffer gefüllten Spritze und laden Sie die Probe mit einer Mikropipette in die Well.
4. Schließen Sie die elektrophoretische Kammer an die Stromversorgung an, wobei sich die positive (rote) Elektrode an der Unterseite befindet. Achten Sie darauf, dass die Proteine bei IP > pH-Wert positiv geladen sind, sodass die Migration von der positiven zur negativen Elektrode erfolgt. Lassen Sie das Gel zuerst 70 min lang bei 30 V laufen, dann 17 h lang bei der konstanten Spannung von 25 V.
   HINWEIS: Schalten Sie während dieser Zeit gelegentlich die Stromversorgung aus und spülen Sie die Gel-Wells mit einer Einwegspritze aus. Achten Sie darauf, dass Sie mit einer Spritze Blasen von der Unterseite des Gels entfernen, um den Verlust der Probe und das Vorhandensein von Verschmierungen in den aufgelösten Proteinen zu vermeiden.
5. Entfernen Sie das Gel von den Gelplatten und schneiden Sie die Linie von Interesse mit einem sauberen Skalpell ab. Gehen Sie vorsichtig mit dem Gel um, um einen Bruch des Gels zu vermeiden. Da die interessierende Linie farblos ist, laden Sie die Probe in Vertiefung Nummer 1, um die interessierende Spur genau zu identifizieren und zu schneiden.
   HINWEIS: Um die Trennung auf Mini-TAU-Gel zu überprüfen, bereiten Sie die Probe vor und führen Sie sie in doppelter Ausführung aus. Eines dieser Gele kann mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt werden. Das Trennungsmuster ist in Abbildung 1A dargestellt.
6. Waschen Sie die Bahn mit 15 mL 0,5 M Tris-HCl pH 8,8 für 15 min.
7. Bereiten Sie 15 ml Äquilibrierungspuffer 1 mit 6 M Harnstoff, 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 30 % Glycerin, 20 % SDS und 2 % Dithioerythrit vor. Bereiten Sie 15 ml Äquilibrierungspuffer 2 mit 6 M Harnstoff, 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 30 % Glycerin, 20 % SDS und 2 % Jodacetamid vor. Bereiten Sie die Äquilibrierungspuffer 1 und 2 unmittelbar vor der Verwendung vor; Lagern Sie den Äquilibrierungspuffer 2 im Dunkeln.
8. Die Gelbahn wird unter leichtem Rühren 15 Minuten lang in 10 ml Äquilibrierungspuffer 1 inkubiert, dann dekantiert. Inkubieren Sie die Gelbahn unter leichtem Rühren mit 10 mL Äquilibrierungspuffer 2 für 15 Minuten im Dunkeln und dekantieren Sie sie dann.
9. Bereiten Sie ein auflösendes SDS-Gel mit 15 % Acrylamid vor, indem Sie Tabelle 1 befolgen. Stellen Sie die Gelplatte auf und füllen Sie sie mit der auflösenden Gellösung. Füllen Sie die Lösung, bis sie 1,5 cm vom Ende der langen Gelplatte entfernt ist. Geben Sie 1 ml Isopropanol auf die Oberfläche, um das Gel zu nivellieren und polymerisieren zu lassen.
10. Nach der Gelpolymerisation das Isopropanol dekantieren und die Vertiefung mit 3MM Chr Cellulosechromatographiepapier trocknen. Führen Sie die resultierende Spur aus Schritt 8 in die Gelvertiefung ein.
11. Versiegeln Sie die Spur zum auflösenden Gel mit einer Versiegelungslösung von 0,5 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 1x Tris/Glycin/SDS-Puffer und 5 μl 0,003 % Bromphenolblau. Lassen Sie die Agarosegelpolymerisation 30 min einwirken.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen während der Agaroseversiegelung, um ein Verschmieren des Gels zu verhindern.
12. Legen Sie die Gelplatten in die Kassette und füllen Sie sie mit 1x Tris/Glycin/SDS-Puffer. Lassen Sie das Gel bei 120 V laufen, bis der Bromphenolblau-Farbstoff den Boden erreicht. Entfernen Sie das Gel vorsichtig von den Platten, entsorgen Sie den Überschuss an Agarose und färben Sie das Gel mit einem Verfahren, das mit der Massenspektrometrie oder dem Blot für immunologische Assays kompatibel ist.

3. Silberfärbung ³²

1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor - Fixiermittel: 50% Methanol, 5% Essigsäure, 45% deionisiertes Wasser; Waschlösung: 50 % Methanol, 50 % entionisiertes Wasser; Sensibilisator: 0,02 % Na₂S₂O₃ 5H₂O in deionisiertem Wasser; Silberreagenz: 0,1 % Silbernitrat in kaltem (4 °C) deionisiertem Wasser; Entwickler: 0,04 % Formalin und 2 % Na₂CO₃, Formaldehyd (37 %) (kurz vor Gebrauch hinzufügen) 0,4 mL deionisiertes Wasser und bis zu 1000 mL auffüllen; Stop-Reagenz: 5% Essigsäure; Gel-Aufbewahrungslösung: 1% Essigsäure.
   HINWEIS: Da Chemikalien, die zum Färben verwendet werden, gefährlich sind, führen Sie alle Schritte unter einem chemischen Abzug durch.
2. Befolgen Sie das Verfahren in Tabelle 2 mit den folgenden Überlegungen. Führen Sie alle Inkubationen unter sanftem Rühren durch. Bereiten Sie das Stoppreagenz vor, bevor Sie mit dem Entwicklungsschritt beginnen. Dies gewährleistet die Gelentwicklung mit der richtigen Intensität. Während des Entwicklungsschritts erscheinen Flecken als gelbe Signale, die am Ende der Inkubation hellbraun werden. Die Intensität der verschiedenen Spots hängt von der Menge der Histon-Proteoformen ab. Das Gel ist bereit für die Spot-Exzision und den In-Gel-Verdau (Abbildung 1B)

4. In-Gel-Verdauung

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: 50 mM Ammoniumbicarbonat (NH₄HCO3)/50 % (v/v) Acetonitril; 10 mM Dithiothreitol (DTT) in 50 mM NH₄HCO₃; 55 mM Iodacetamid (IAA) in 50 mM NH₄HCO₃; 0,1 % TFA; 50 mM NH₄HCO₃, pH 8; Acetonitril in HPLC-Qualität; 1 mL Silikonröhrchen.
   HINWEIS: Um eine Kontamination des menschlichen Keratins durch Haare oder Haut zu vermeiden, verwenden Sie saubere Handschuhe und arbeiten Sie in einem sauberen Bereich.
2. Entfernen Sie mit einem sauberen Skalpell interessante Histonflecken aus dem gefärbten Gel und geben Sie sie in ein frisches Silikonröhrchen (1,5 ml). Achten Sie darauf, einen einzelnen Punkt herauszuschneiden und in ein einzelnes Röhrchen zu geben, um eine Kreuzkontamination der Isoform zu vermeiden.
3. Zu jedem Gelfleck werden 250 μl 50 mM NH₄HCO₃/50 % Acetonitril gegeben und unter sanftem Rühren in einem Thermomischer bei Raumtemperatur inkubiert. Dekantieren Sie die Lösung und wiederholen Sie diesen Schritt 3x. Gelstücke erscheinen transparent.
4. Dehydrieren Sie Gelflecken durch Zugabe von Acetonitril (200 μl). In diesem Stadium nehmen die Gelstücke eine undurchsichtig-weiße Farbe an.
5. Acetonitril dekantieren und 10 min an der Luft trocknen lassen. Das Gelstück erscheint in der Tube getrocknet. Reduktion und Alkylierung sind nicht notwendig, da Histonproteine während des Äquilibrierungsschritts reduziert und alkyliert wurden.
6. Rehydrieren Sie Gelflecken in 20 μl Trypsinlösung (0,1 mM HCl) oder einem Volumen, das ausreicht, um die Gelstücke zu bedecken. Die Röhrchen werden in den Thermomischer gestellt und unter leichtem Rühren bei 37 °C mindestens 4 bis 16 Uhr inkubiert.
7. Den Überstand mit den tryptischen Peptiden in ein frisches Röhrchen überführen. Geben Sie 50 μL Extraktionslösung (60% Acetonitril, 1% TFA) zu den Gelstücken und beschallen Sie 2x in einem Ultraschall-Wasserbad für 10 min bei 4 °C.
8. Übertragen Sie den Überstand, der zusätzliche tryptische Peptide enthält, in das frische Röhrchen. Verwenden Sie einen Gefriertrockner, um die gepoolten extrahierten Peptide zu trocknen. Stellen Sie den Gefriertrockner auf 30 °C ein und trocknen Sie die Lösung; In der Tube erscheint ein lyophilisiertes Pellet.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist volumenabhängig. In der Regel ist 1 h ausreichend, aber überprüfen Sie das Volumen alle 10 Minuten, bis die Probe vollständig getrocknet ist.
9. Geben Sie 15 μl 0,1 % TFA in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es vorsichtig in einem Thermomischer bei 25 °C. Übertragen Sie den Überstand für die LC-MS/MS-Analyse in das Fläschchen.

5. 2DTAU Western Blot

1. Bereiten Sie den Transferpuffer, 250 mM Tris-Base, 92 mM Glycin und 10 % Methanol mit doppelt destilliertem Wasser vor.
2. Schneiden Sie die Nitrozellulosemembran und das Filterpapier auf die Maße des Gels zu.
3. Äquilibrieren Sie das Gel und weichen Sie die Membran, das Filterpapier und das Filterpapier 15 Minuten lang im Transferpuffer ein. Verwenden Sie entweder Nitrozellulose- oder PVDF-Membranen. Wenn Sie PVDF-Membranen (Polyvinylidendifluorid) verwenden, aktivieren Sie diese, indem Sie sie in 100 % MetOH einweichen.
4. Bereiten Sie das Gelsandwich in der Kassette für einen halbtrockenen Transfer wie folgt vor: Negative Elektrode/Filterpapier/Gel/Nitrozellulosemembran/Filterpapier/Positive Elektrode. Entfernen Sie alle Luftblasen zwischen Gel und Membran, um gute Ergebnisse zu erzielen.
5. Legen Sie die Kassette in das Halbtrockengerät und lassen Sie den Blot 30 Minuten lang bei 25 V laufen. Zerlegen Sie zum Schluss das Blotting-Sandwich und lagern Sie die Membran für den immunologischen Assay. Überprüfen Sie die Übertragungseffizienz mit der Ponceau-Färbung. Markieren Sie die Membran mit einem Schild oben rechts, um die richtige Filterausrichtung beizubehalten.
6. Inkubieren Sie je nach Experiment mit primären und sekundären Antikörpern (Abbildung 2).

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Ergebnisse

In Abbildung 1A ist zu beobachten, wie Histonproteine in einem 1D-Gel wandern. Dies ist ein wichtiger vorbereitender Schritt, um die Laufzeit der ersten Dimension zu verstehen. Sobald der richtige Zeitpunkt für die Trennung bestimmt ist, führen Sie die zweite Dimension aus. Die 2D-Karte der Histon-Proteoformen zeigt ein charakteristisches topographisches Muster (Abbildung 1B). Jeder Punkt in Abbildung 1B

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Diskussion

In den letzten zehn Jahren wurde die Therapie von Krebspatienten revolutioniert, indem verschiedene molekulare Veränderungen identifiziert wurden, die die Entwicklung und das Fortschreiten von Krebs vorantreiben. Der bedeutendste Fortschritt in der modernen Onkologie ist die Entwicklung von Therapien, die auf einer umfassenden molekularen Analyse basieren. Technologische Fortschritte in der Genomik und Proteomik haben eine entscheidende Rolle bei der Profilierung spezifischer Biomarker ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	SIGMA- ALDRICH	D8255	Reagent for maintaining −SH groups in the reduced state; quantitatively reduces disulfides.
1,5 M Tris-HCL buffer, pH 8.8	BIO-RAD	161-0798	Resolving Gel Buffer
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD	1610772	Use this premixed 10x Tris/glycine/SDS running buffer to separate protein samples by SDS-PAGE.
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	33539	2-Propanol (Isopropanol) is a secondary alcohol. It has been tested as a substitute to fuel for use in various fuel cells. CuO powder dissolved in 2-propanol has been used for the laser ablation assisted synthesis of Cu colloids. Suspension of 2-propanol with Zn(NO3)2 has been employed for the fabrication of titanium dioxide-coated stainless steel (P25-TiO2/SS) photoanode coated with uniformly thick layer of P25-TiO2.This photoanode was used for the electrochemical photocatalytic (ECPC) degradation process.
30% Acrylamide/Bis Solution	BIO-RAD	1610158	2.6% Crosslinker. Electrophoresis purity reagent
Acetic Acid Glacial	Carlo Erba Reagennts	401392	Acetic acid is an important chemical reagent with many industrial applicatios.
Acetone	Panreac Applichem	211007.1214	Acetone is a solvent, renowned for its versatility in various laboratory, manufacturing, and cleaning applications.
Acetonitile	VWR	83640320	for HPLC   LC-MS grade
Agarose	Invitrogen	15510-027	Agarose is a heteropolysaccharide  frequently used in molecular biology.
Ammonium bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	A6141	minimum 99,0%
Ammonium persulfate	SIGMA-ALDRICH	A3678	For molecular Biology, For electrophoresis, ≥98%
Bioruptor plus	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	sonicator
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	Reducing agent used to reduce disulfide bonds in proteins.
Dodeca Silver Stain Kit	BIO-RAD	161-0480	The Dodeca silver stain kit is easy-to-use for the detection of nonagram levels of proteins in polyacrylamide gels.
Glycerol	GE - Healthcare Life Sciences	171325010L	Glycerol is a simple triol compound, it is involved to aid in casting gradient gels, protein stabilizer and storage buffer component.
Halt Phosphatase Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail preserves the phosphorylation state of proteins during and after cell lysis or tissue protein extraction  Single- Use Cocktail (100X).
Halt Protease Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) are ready-to-use concentrated stock solutions of protease inhibitors for addition to samples to prevent proteolytic degradation during cell lysis and protein extraction. Single- Use Cocktail (100X).
Hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReagent, for molecular biology
Iodoacetamide	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥99% (NMR), crystalline
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	Potassium chloride, KCl, is generally used in laboratory routines. Its use as a storage buffer for pH electrodes and as a reference solution for conductivity measurements is well established.
MCF10 cell line	atcc	CRL-10317	epithelial cell line that was isolated in 1984 from the mammary gland of a White, 36-year-old female with fibrocystic breasts. This cell line was deposited by the Michigan Cancer Foundation.
MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	Magnesium chloride is a colorless crystalline solid.
N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamine	SIGMA-ALDRICH	T9281	For Electrophoresis, approx. 99%
Phosphate saline buffer 1X	Corning	15373631	1 X PBS (phosphate buffered saline) is a buffered balanced salt solution used for a variety biological and cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Potassium hexacyanoferrate	SIGMA-ALDRICH	60299	Electron acceptor, employed in systems involving electron transport,
SDS Solution 20% (w/v)	BIO-RAD	161-0418	Sodium dodecyl sulfate. Electrophoresis purity reagent
Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%	SIGMA- ALDRICH	21,726-3	Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%
Sulfuric acid	SIGMA-ALDRICH	339741	Sulfuric Acid, Reagent, is an extremely corrosive acid that comes as yellowy slightly viscous liquid. It is soluble in water and is a diprotic acid. It has very strong corrosive, dehydrating and oxidizing properties as well as being hygroscopic.
Trichloroacetic acid	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	Trichloroacetic acid (TCA) is used as a reagent for the precipitation of proteins1,2 and nucleic acids3.
Trifluoroacetic acid	Riedel-de Haën	34957	Trifluoroacetic acid
Triton X-100	SIGMA- ALDRICH	T9284-1L	Triton X-100 is a nonionic polyoxyethylene surfactant that is most frequently used to extract and solubilize proteins.
Trypsin from porcine pancreas	SIGMA-ALDRICH	T6567	Proteomics Grade, BioReagent, Dimethylated
UREA	SIGMA-ALDRICH	33247	Urea is a chaotropic agent and is used for protein denaturation. It disturbs the hydrogen bonds in the secondary, tertiary and quaternary structure of proteins. It can also disturb hydrogen bonding present in DNA secondary structure