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Method Article
* Estos autores han contribuido por igual
Este método describe una estrategia simple y rápida para la caracterización e investigación de proteoformes de histonas.
Las histonas experimentan varias modificaciones postraduccionales (PTM) como la metilación, la acetilación, la fosforilación, la acilación y la ubiquitinación, que controlan la dinámica de los nucleosomas y determinan el destino celular. El nucleosoma, que es la unidad funcional de la cromatina, comprende el ADN, cuatro pares de histonas (H3, H4, H2A y H2B) que forman el núcleo globular y la histona enlazadora H1, que estabiliza la estructura de la cromatina. Las colas amino (N)-terminales de las histonas sobresalen de los dominios del núcleo globular y experimentan distintos PTM que influyen en el paisaje de la cromatina. Algunas evidencias sugieren que la homeostasis de las histonas PTM es crucial para preservar todas las actividades fisiológicas. La desregulación de las histonas PTM es la causa principal de la proliferación celular anormal, la invasión y la metástasis. Por lo tanto, el desarrollo de métodos para caracterizar las histonas PTM es crucial. En este trabajo describimos una técnica eficaz para aislar y analizar las isoformas de histonas. El método, basado en la combinación de dos separaciones ortogonales, permite el enriquecimiento de isoformas de histonas y la posterior identificación por espectrometría de masas. La técnica, descrita originalmente por Shechter et al., combina geles de poliacrilamida ácido-urea (TAU-GEL), que pueden separar proteínas histonas básicas en función del tamaño y la carga, y geles de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), que pueden separar proteínas por peso molecular. El resultado es un mapa bidimensional de isoformas de histonas, adecuado para la digestión en gel, seguido de la identificación por espectrometría de masas y el análisis de Western blot. El resultado es un mapa bidimensional de isoformas de histonas, adecuado tanto para la digestión en gel como para la identificación por espectrometría de masas y el análisis de Western blot. Este enfoque proteómico es un método robusto que permite el enriquecimiento de una sola isoforma de histona y la caracterización de nuevos PTM de histonas.
La aparición, la progresión y la quimiorresistencia del cáncer están relacionadas con eventos genéticos y epigenéticos, incluidas las histonas PTM. Las histonas experimentan una variedad de PTM que regulan la dinámica de la cromatina y dictanel destino de las células.
El nucleosoma es la unidad funcional de la cromatina y es un complejo molecular de ADN y proteínas que permite que el ADN se empaquete en el núcleo. Consta de cuatro pares de histonas (H3, H4, H2A y H2B) que constituyen el núcleo del nucleosoma, así como la histona enlazadora H1, que ayuda a estabilizar la estructura de la cromatina. Las colas amino (N)-terminales de las histonas sobresalen de sus dominios centrales globulares y sufren modificaciones postraduccionales específicas que afectan al paisaje de la cromatina2.
Hasta ahora, se conocen al menos 23 clases de histonas PTM. Estos PTM son modificaciones covalentes que consisten principalmente en metilación, acetilación, fosforilación, glicosilación, ubiquitilación, SUMOilación y ADP-ribosilación3. Además, recientemente se ha propuesto una estrecha correlación entre la homeostasis del epigenoma y el recableado metabólico, lo que explica el crecimiento exponencial del posible número de histonas PTMs 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Las histonas PTM, depositadas, borradas y transducidas por enzimas modificadoras, se denominan respectivamente escritores, borradores y lectores. Afectan las propiedades físicas y químicas de la estructura de la cromatina, afectando el perfil de expresión génica, incluida la expresión de genes supresores de tumores y oncogenes 14,15,16.
El número de histonas proteoformas aumenta cuando se incorporan al nucleosoma como variantes de histonas. Estas variantes son isoformas no alélicas de histonas canónicas y añaden complejidad al alterar las propiedades químicas y físicas de la cromatina. En comparación con las histonas canónicas, las variantes de histonas tienen dominios funcionales que sufren modificaciones postraduccionales únicas o interactúan con componentes específicos de la cromatina, lo que afecta la dinámica y la estabilidad del nucleosoma17.
En las células cancerosas, la desregulación de las histonas PTM y sus variantes afecta el perfil de expresión génica, lo que conduce a una proliferación celular anormal, invasión, metástasis y la activación de vías de resistencia a los fármacos 3,18,19,20. Las mutaciones dentro de las histonas o los complejos de remodelación de la cromatina pueden alterar el fenotipo celular, contribuyendo a la transformación neoplásica. La acumulación de alteraciones epigenéticas, como la metilación de histonas, es un factor clave en la activación de las vías de resistencia a fármacos 21,22,23. Las mutaciones dentro del complejo SWI/SNF, que consta de 15 subunidades codificadas por 29 genes, afectan a más del 20% de los cánceres humanos en muchos tipos de tumores. En la última década, se han desarrollado estrategias farmacológicas de base epigenética (epifármacos), y muchos fármacos dirigidos al cáncer con patrones anormales de modificación de histonas han sido aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA)23.
El análisis de las proteínas histonas es bastante desafiante, lo que lo convierte en un área de estudio exigente. Recientemente, los métodos de espectrometría de masas se han convertido en la forma preferida para caracterizar y estudiar las proteoformas de histonas. Sin embargo, las drásticas condiciones de extracción, en combinación con la escasa solubilidad de algunas variantes y la alta homología de secuencia, dificultan su análisis.
En la última década, se han desarrollado varios métodos basados en espectrometría de masas para el perfil y la investigación de histonas 24,25,26,27. En este estudio, presentamos un método rentable y fiable para crear un mapa bidimensional de proteoformas de histonas, que puede aumentar las posibilidades de descubrir nuevas modificaciones postraduccionales.
La electroforesis 2D TAU combina la separación en condiciones ácidas con SDS PAGE. En la primera dimensión, la condición ácida del medio da una carga neta positiva a las proteínas básicas. Dado que las histonas son proteínas muy básicas y tienen un punto isoeléctrico (pH) más alto en comparación con el medio, se cargan positivamente y migran bajo un campo eléctrico. En la segunda dimensión, las histonas son desnaturalizadas por SDS y separadas en función de su peso molecular. El mapa 2D resultante se puede utilizar como herramienta para enriquecer proteoformas específicas con una resolución de un solo punto para el análisis de espectrometría de masas y estudios inmunológicos28,29. Después de la electroforesis, las manchas 2D de TAU se pueden decolorar, digerir con tripsina y analizar mediante espectrometría de masas. Alternativamente, el mapa 2D de TAU puede secarse en un filtro de nitrocelulosa/PVDF e investigarse mediante inmunotinción27.
En este contexto, los métodos podrían ser estratégicos para mejorar la identificación y el análisis de nuevas modificaciones postraduccionales correlacionadas con el recableado metabólico30,31.
Hemos mejorado aún más el método original incorporando un paso de sonicación, que es útil para la degradación del ADN y mejora la solubilidad de las proteínas. Además, hemos prolongado la etapa de incubación para la extracción de histonas, con el fin de obtener una muestra de proteína de alta pureza. Además, en nuestro protocolo, ejecutamos la primera dimensión a baja tensión durante más tiempo para lograr una mejor resolución. El gel resultante se utilizó para investigar histonas canónicas PTM y caracterizar modificaciones novedosas como la glicación10,32.
En general, hemos desarrollado un método para extraer y purificar histonas, seguido de la resolución de las proteoformas de histonas utilizando un mapa bidimensional. El trabajo también incluye un procedimiento para la digestión en gel para el análisis de espectrometría de masas y los pasos para el análisis bidimensional de Western blot.
1. Extracción de histonas
2. Mini electroforesis 2D de tritón-ácido-urea (TAU) en gel
3. Tinción de plata 32
4. Digestión en gel
5. Mancha occidental 2DTAU
En la Figura 1A, es posible observar cómo migran las proteínas histonas en un gel 1D. Este es un paso preliminar importante para comprender el tiempo de ejecución de la primera dimensión. Una vez que se determine el momento correcto de separación, ejecute la segunda dimensión. El mapa 2D de las proteoformas de histonas muestra un patrón topográfico distintivo (Figura 1B). Cada punto de la Figura 1B
En la última década, la terapia del paciente con cáncer se ha revolucionado al identificar varias alteraciones moleculares que impulsan el desarrollo y la progresión del cáncer. El avance más significativo en la oncología moderna es el desarrollo de una terapia basada en el análisis molecular integral. Los avances tecnológicos en genómica y proteómica han desempeñado un papel crucial en el perfil de biomarcadores específicos para la detección temprana, la vigilancia, el pro...
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
El trabajo fue apoyado por PRIN2022, DS, CF y AC fueron apoyados por PRIN2022, y MLC fue apoyado por el programa de doctorado en Oncología Molecular, escuela del programa de doctorado UMG. El trabajo también contó con el apoyo del proyecto PNRR INSIDE CUP: B83C22003920001
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,4-Dithioerythritol | SIGMA- ALDRICH | D8255 | Reagent for maintaining −SH groups in the reduced state; quantitatively reduces disulfides. |
1,5 M Tris-HCL buffer, pH 8.8 | BIO-RAD | 161-0798 | Resolving Gel Buffer |
10x Tris/Glycine/SDS | BIO-RAD | 1610772 | Use this premixed 10x Tris/glycine/SDS running buffer to separate protein samples by SDS-PAGE. |
2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 33539 | 2-Propanol (Isopropanol) is a secondary alcohol. It has been tested as a substitute to fuel for use in various fuel cells. CuO powder dissolved in 2-propanol has been used for the laser ablation assisted synthesis of Cu colloids. Suspension of 2-propanol with Zn(NO3)2 has been employed for the fabrication of titanium dioxide-coated stainless steel (P25-TiO2/SS) photoanode coated with uniformly thick layer of P25-TiO2.This photoanode was used for the electrochemical photocatalytic (ECPC) degradation process. |
30% Acrylamide/Bis Solution | BIO-RAD | 1610158 | 2.6% Crosslinker. Electrophoresis purity reagent |
Acetic Acid Glacial | Carlo Erba Reagennts | 401392 | Acetic acid is an important chemical reagent with many industrial applicatios. |
Acetone | Panreac Applichem | 211007.1214 | Acetone is a solvent, renowned for its versatility in various laboratory, manufacturing, and cleaning applications. |
Acetonitile | VWR | 83640320 | for HPLC LC-MS grade |
Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Agarose is a heteropolysaccharide frequently used in molecular biology. |
Ammonium bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | A6141 | minimum 99,0% |
Ammonium persulfate | SIGMA-ALDRICH | A3678 | For molecular Biology, For electrophoresis, ≥98% |
Bioruptor plus | Diagenode | B01020001 - B01020002- B01020003 | sonicator |
Dithiothreitol | SIGMA- ALDRICH | D9163-5G | Reducing agent used to reduce disulfide bonds in proteins. |
Dodeca Silver Stain Kit | BIO-RAD | 161-0480 | The Dodeca silver stain kit is easy-to-use for the detection of nonagram levels of proteins in polyacrylamide gels. |
Glycerol | GE - Healthcare Life Sciences | 171325010L | Glycerol is a simple triol compound, it is involved to aid in casting gradient gels, protein stabilizer and storage buffer component. |
Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo SCIENTIFIC | 78428 | Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail preserves the phosphorylation state of proteins during and after cell lysis or tissue protein extraction Single- Use Cocktail (100X). |
Halt Protease Inhibitor | Thermo SCIENTIFIC | 78430 | Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) are ready-to-use concentrated stock solutions of protease inhibitors for addition to samples to prevent proteolytic degradation during cell lysis and protein extraction. Single- Use Cocktail (100X). |
Hydrochloric acid | SIGMA-ALDRICH | H1758 | BioReagent, for molecular biology |
Iodoacetamide | SIGMA-ALDRICH | I6125 | ≥99% (NMR), crystalline |
KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541 | Potassium chloride, KCl, is generally used in laboratory routines. Its use as a storage buffer for pH electrodes and as a reference solution for conductivity measurements is well established. |
MCF10 cell line | atcc | CRL-10317 | epithelial cell line that was isolated in 1984 from the mammary gland of a White, 36-year-old female with fibrocystic breasts. This cell line was deposited by the Michigan Cancer Foundation. |
MgCl2 | SIGMA-ALDRICH | 208337 | Magnesium chloride is a colorless crystalline solid. |
N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamine | SIGMA-ALDRICH | T9281 | For Electrophoresis, approx. 99% |
Phosphate saline buffer 1X | Corning | 15373631 | 1 X PBS (phosphate buffered saline) is a buffered balanced salt solution used for a variety biological and cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
Potassium hexacyanoferrate | SIGMA-ALDRICH | 60299 | Electron acceptor, employed in systems involving electron transport, |
SDS Solution 20% (w/v) | BIO-RAD | 161-0418 | Sodium dodecyl sulfate. Electrophoresis purity reagent |
Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99% | SIGMA- ALDRICH | 21,726-3 | Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99% |
Sulfuric acid | SIGMA-ALDRICH | 339741 | Sulfuric Acid, Reagent, is an extremely corrosive acid that comes as yellowy slightly viscous liquid. It is soluble in water and is a diprotic acid. It has very strong corrosive, dehydrating and oxidizing properties as well as being hygroscopic. |
Trichloroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | T6399-5G | Trichloroacetic acid (TCA) is used as a reagent for the precipitation of proteins1,2 and nucleic acids3. |
Trifluoroacetic acid | Riedel-de Haën | 34957 | Trifluoroacetic acid |
Triton X-100 | SIGMA- ALDRICH | T9284-1L | Triton X-100 is a nonionic polyoxyethylene surfactant that is most frequently used to extract and solubilize proteins. |
Trypsin from porcine pancreas | SIGMA-ALDRICH | T6567 | Proteomics Grade, BioReagent, Dimethylated |
UREA | SIGMA-ALDRICH | 33247 | Urea is a chaotropic agent and is used for protein denaturation. It disturbs the hydrogen bonds in the secondary, tertiary and quaternary structure of proteins. It can also disturb hydrogen bonding present in DNA secondary structure |
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