2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması

Özet

Bu yöntem, histon proteoform karakterizasyonu ve araştırması için basit ve hızlı bir stratejiyi tanımlar.

Özet

Histonlar, nükleozom dinamiklerini kontrol eden ve hücre kaderini belirleyen metilasyon, asetilasyon, fosforilasyon, asilasyon ve ubikitinasyon gibi çeşitli translasyon sonrası modifikasyonlara (PTM'ler) uğrar. Kromatinin fonksiyonel birimi olan nükleozom, DNA, küresel çekirdeği oluşturan dört çift histon (H3, H4, H2A ve H2B) ve kromatin yapısını stabilize eden bağlayıcı histon H1'den oluşur. Histonların amino (N)-terminal kuyrukları, küresel çekirdek alanlarından çıkıntı yapar ve kromatin manzarasını etkileyen farklı PTM'lere maruz kalır. Bazı kanıtlar, histon PTM homeostazının tüm fizyolojik aktiviteleri korumak için çok önemli olduğunu göstermektedir. Histon PTM'lerinin deregülasyonu, anormal hücresel proliferasyon, invazyon ve metastazın birincil nedenidir. Bu nedenle, histon PTM'lerini karakterize etmek için yöntemler geliştirmek çok önemlidir. Burada, histon izoformlarını izole etmek ve analiz etmek için etkili bir teknik açıklıyoruz. İki ortogonal ayırmanın kombinasyonuna dayanan yöntem, histon izoformlarının zenginleştirilmesine ve ardından kütle spektrometresi tanımlamasına izin verir. İlk olarak Shechter ve ark. tarafından tanımlanan teknik, temel histon proteinlerini boyut ve yüke göre ayırabilen asit-üre poliakrilamid jelleri (TAU-GEL) ve proteinleri moleküler ağırlığa göre ayırabilen Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jelleri (SDS-PAGE) birleştirir. Sonuç, jel içi sindirim için uygun olan histon izoformlarının iki boyutlu bir haritasıdır ve ardından kütle spektrometresi tanımlaması ve western blot analizidir. Sonuç, hem jel içi sindirim hem de kütle spektrometresi tanımlaması ve western blot analizi için uygun olan histon izoformlarının iki boyutlu bir haritasıdır. Bu proteomik yaklaşım, tek bir histon izoformunun zenginleştirilmesine ve yeni histon PTM'lerinin karakterizasyonuna izin veren sağlam bir yöntemdir.

Giriş

Kanser başlangıcı, ilerlemesi ve kemorezistans, histon PTM'leri de dahil olmak üzere genetik ve epigenetik olaylarla ilişkilidir. Histonlar, kromatin dinamiklerini düzenleyen ve hücre kaderini belirleyen çeşitli PTM'lere maruz kalır¹.

Nükleozom, kromatinin fonksiyonel birimidir ve DNA'nın çekirdeğe paketlenmesine izin veren moleküler bir DNA ve protein kompleksidir. Nükleozom çekirdeğini oluşturan dört çift histondan (H3, H4, H2A ve H2B) ve ayrıca kromatin yapısını stabilize etmeye yardımcı olan bağlayıcı histon H1'den oluşur. Histonlar amino (N)-terminal kuyrukları, küresel çekirdek alanlarından çıkıntı yapar ve kromatin manzarasını² etkileyen spesifik translasyon sonrası modifikasyonlara uğrar.

Şimdiye kadar, en az 23 histon PTM sınıfı bilinmektedir. Bu PTM'ler, esas olarak metilasyon, asetilasyon, fosforilasyon, glikozilasyon, ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribosilasyon^3'ten oluşan kovalent modifikasyonlardır. Ek olarak, epigenom homeostazı ile metabolik yeniden kablolama arasında yakın bir ilişki önerilmiştir, bu da PTM'lerin^{olası histon} sayısı 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13'ün üstel büyümesini açıklamaktadır . Değiştirici enzimler tarafından biriktirilen, silinen ve dönüştürülen histon PTM'leri sırasıyla yazıcılar, silgiler ve okuyucular olarak adlandırılır. Kromatin yapısının fiziksel ve kimyasal özelliklerini etkilerler, tümör baskılayıcı genlerin ve onkogenlerin ekspresyonu dahil olmak üzere gen ekspresyon profilini etkilerler 14,15,16.

Histon proteoformlarının sayısı, histon varyantları olarak nükleozoma dahil edildiğinde artar. Bu varyantlar, kanonik histonların alelik olmayan izoformlarıdır ve kromatinin kimyasal ve fiziksel özelliklerini değiştirerek karmaşıklık katarlar. Kanonik histonlarla karşılaştırıldığında, histon varyantları, benzersiz translasyon sonrası modifikasyonlara uğrayan veya belirli kromatin bileşenleriyle etkileşime giren, nükleozom^17'nin dinamiklerini ve stabilitesini etkileyen fonksiyonel alanlara sahiptir.

Kanser hücrelerinde, histon PTM'lerinin ve varyantlarının deregülasyonu, gen ekspresyon profilini etkileyerek anormal hücresel proliferasyona, istilaya, metastaza ve ilaç direnç yollarının^{aktivasyonuna yol} açar ^3,18,19,20. Histionlar veya kromatin yeniden şekillenme kompleksleri içindeki mutasyonlar, hücre fenotipini değiştirerek neoplastik dönüşüme katkıda bulunabilir. Histon metilasyonu gibi epigenetik değişikliklerin birikmesi, ilaç direnç yollarının 21,22,23 aktive edilmesinde anahtar bir faktördür. 29 gen tarafından kodlanan 15 alt birimden oluşan SWI/SNF kompleksi içindeki mutasyonlar, birçok tümör tipinde insan kanserlerinin %20'sinden fazlasını etkiler. Son on yılda, epigenetik temelli ilaç stratejileri (epi-ilaçlar) geliştirilmiş ve anormal histon modifikasyon paternlerine sahip kanseri hedef alan birçok ilaç ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından ^{onaylanmıştır23}.

Histon proteinlerinin analizi oldukça zordur ve bu da onu zorlu bir çalışma alanı haline getirir. Son zamanlarda, kütle spektrometresi yöntemleri, histon proteoformlarını karakterize etmek ve incelemek için tercih edilen yol haline gelmiştir. Bununla birlikte, bazı varyantların zayıf çözünürlüğü ve yüksek dizi homolojisi ile birlikte sert ekstraksiyon koşulları, analizlerini zorlaştırır.

Son on yılda, histon profillemesi ve incelemesi için çeşitli kütle spektrometresi tabanlı yöntemler geliştirilmiştir 24,25,26,27. Bu çalışmada, histon proteoformlarının iki boyutlu bir haritasını oluşturmak için uygun maliyetli ve güvenilir bir yöntem sunuyoruz, bu da yeni translasyon sonrası modifikasyonları keşfetme şansını artırabilir.

2D TAU elektroforezi, asidik koşullarda separasyonu SDS PAGE ile birleştirir. Birinci boyutta, ortamın asidik durumu, bazik proteinlere net bir pozitif yük verir. Histonlar çok temel proteinler olduklarından ve ortama kıyasla daha yüksek bir izoelektrik noktaya (pH) sahip olduklarından, pozitif yüklü hale gelirler ve bir elektrik alanı altında göç ederler. İkinci boyutta, histonlar SDS ile denatüre edilir ve moleküler ağırlıklarına göre ayrılır. Elde edilen 2D harita, kütle spektrometresi analizi ve immünolojik çalışmalar için tek nokta çözünürlükte spesifik proteoformları zenginleştirmek için bir araç olarak kullanılabilir^28,29. Elektroforezden sonra, 2D TAU lekeleri lekelenebilir, tripsin ile sindirilebilir ve kütle spektrometresi ile analiz edilebilir. Alternatif olarak, 2D TAU haritası bir nitroselüloz / PVDF filtresine lekelenebilir ve immün boyama²⁷ ile incelenebilir.

Bu bağlamda, yöntemler, metabolik yeniden kablolama ile ilişkili yeni translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanmasını ve analizini geliştirmek için stratejik olabilir^30,31.

DNA bozunması ve protein çözünürlüğünün iyileştirilmesi için yardımcı olan bir sonikasyon adımı ekleyerek orijinal yöntemi daha da geliştirdik. Ek olarak, yüksek saflıkta bir protein örneği elde etmek için histon ekstraksiyonu için inkübasyon adımını uzattık. Ayrıca protokolümüzde daha iyi bir çözünürlük elde etmek için ilk boyutu düşük voltajda daha uzun süre çalıştırdık. Elde edilen jel, kanonik histonlar PTM'leri araştırmak ve glikasyon^10,32 gibi yeni modifikasyonları karakterize etmek için kullanıldı.

Genel olarak, histonların ekstrakte edilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem geliştirdik, ardından iki boyutlu bir harita kullanarak histon proteoformlarının çözünürlüğünü izledik. Çalışma ayrıca kütle spektrometresi analizi için jel içi sindirim prosedürünü ve iki boyutlu western blot analizi için adımları içerir.

Protokol

1. Histon ekstraksiyonu

1. % 80 birleşik olan en az 1 x 10⁶ hücreden histon ekstraksiyonu gerçekleştirin. Bu deney için ATCC'den MCF-10A hücre hatlarını kullandık. Kaplamadan sonra, hücreleri 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) 1x ile üç kez yıkayın. Tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
2. 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM KCl ve 1.5 mM_MgCl2 içeren bir hücre lizis tamponu hazırlayın. Kullanmadan hemen önce 1 mM ditioeritritol ve proteaz ve fosfataz inhibitörleri ekleyin.
3. Hücre içeren Petri kabına 800 μL hücre lizis tamponu ekleyin, hücreleri kazıyın ve 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın, daha sonra 300 rpm'de, 4 ° C'de 1 saat boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
4. 10.000 x g, 4 ° C'de, 1.5 mL tüpler için bir döndürücü ile önceden soğutulmuş bir mikro santrifüjde 10 dakika santrifüjleyin.
5. Peleti 400 μL hücre lizis tamponu ile yıkayın ve 10.000 x g, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Yıkama adımını 3 kez tekrarlayın.
   NOT: Tüm adımlar için 4 ml'lik tüpler için döndürücülü önceden soğutulmuş bir mikro santrifüj (1.5 °C) kullanın. Malzeme kaybını önlemek için peleti dikkatli bir şekilde kullanın.
6. Peletleri 640 μL'lik 0,2 M H₂S4'te yeniden süspanse edin ve 300 rpm'de, 4 ° C'de 16 saat boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
   DİKKAT: Sülfürik asit tehlikeli bir kimyasaldır; Lütfen kimyasal çeker ocak altında kullanın.
7. 16.000 x g, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve aşağıdaki adımlara kadar saklayın. Nükleer kalıntıları atın.
8. Damla damla 212 μL Trikloroasetik asit ekleyerek histonları çökeltin (TCA'nın nihai konsantrasyonu %33'tür). Tüpü 10x ters çevirerek çözeltiyi karıştırın. Karanlıkta buz üzerinde 16 saat kuluçkaya yatırın.
   DİKKAT: TCA tehlikeli bir kimyasaldır; Kimyasal çeker ocak altında kullanın.
9. Önceden soğutulmuş bir santrifüjde 16.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika döndürülerek pelet histonları. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 3x 200 μL soğuk asetonla yıkayın.
10. Peleti soğuk asetonla yeniden askıya alın, ardından buz üzerinde 10 dakikalık bir duraklama ile dönüşümlü olarak, 3 döngü 30 s açma / kapama ile yüksek gücü 2x sonikasyon yapın.
    NOT: İşlem bir ultrasonicator kullanılarak yapıldı. Bu adım, histon sarılı DNA'yı ortadan kaldırmak için gereklidir.
11. 10 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin, asetonu atın ve numuneyi 100 μL çift damıtılmış suda yeniden süspanse edin. Üreticinin talimatlarına göre Bradford tahlil yöntemini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin³³.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra, pelet bazen beyaz veya yarı saydam görünür. Beyaz ve opak bir çökelti, 2D ayrımını bozabilecek tuz kirleticilerinin varlığını gösterebilir. Eğer öyleyse, pelet yarı saydam hale gelene kadar aseton yıkama adımlarını tekrarlayın.
12. Üreticinin talimatlarına göre 70 μg histonu liyofilize edin. Liyofilizatörü 60 dakika boyunca 30 °C'ye ayarlayın. Tüp hacmini kontrol edin ve numune tamamen liyofilize olana kadar adımı 30 °C'de tekrarlayın (genellikle numuneyi tamamen liyofilize etmek için 90 dakika gereklidir). 60 dakika sonra, işlem örneğe bağlı olduğu için hacmi her 10 dakikada bir kontrol edin.
    NOT: Histon proteinlerinin miktarı düşükse, 2 x 10⁶ hücreden başlayın. Bu durumda, 1 x 10⁶ hücre için kullanılan aynı hacimde reaktif kullanın. İşlem sırasında kullanılan tüm kimyasalların saflığını kontrol edin; tüm reaktifler HPLC sınıfı olmalıdır.

2. Mini 2D jel triton-asit-üre (TAU) elektroforezi

1. Aşağıda açıklandığı gibi bir mini dikey poliakrilamid jel elektroforez sistemi için bir mini TAU jeli hazırlayın.
   1. Ayırma jeli hazırlayın: 6 M Üre, %15 akrilamid/bisakrilamid (29:1), %5 buzlu asit asetik, %0,25 Triton X-100 (h/h), %0,4 TEMED (h/v), %0,1 APS (p/v). Çözeltiyi hazırlamak için, üreyi akrilamid / bis ve 1 mL ultra saf su içinde oda sıcaklığında hafif çalkalama ile çözün; Diğer bileşenleri ekleyin ve ses seviyesini ayarlayın. Bir mini TAU jeli için 10 mL çözelti hazırlayın. Önceden ayarlanmış jel plakalarını solüsyonla doldurun ve üstten sadece 1,5 cm yükseklikte hava kabarcıkları oluşmasını önleyin. Jeli düzleştirmek için çözeltiyi 1 mL izopropanol ile kaplayın.
   2. İstifleme jeli hazırlayın: 6 M Üre, %6 akrilamid/bisakrilamid (29:1), %5 buzlu asit asetik, %0,25 Triton X-100 (h/h), %0,4 TEMED (h/v), %0,1 APS (p/v). Çözeltiyi hazırlamak için üreyi akrilamid / bis ve 1 mL ultra saf su içinde çözün; Diğer bileşenleri ekleyin ve ses seviyesine ayarlayın. Jel plakaları istifleme solüsyonu ile doldurun, plakalar arasına 10 oyuklu bir jel tarak yerleştirin ve jel solüsyonu tarağın dişlerinin yarısına gelene kadar yerleştirin. Jelin 4 °C'de 16 saat polimerize olmasına izin verin.
      NOT: Kuyuların düzenli oluşumunu sağlamak için tarağı dikkatlice yerleştirin.
2. 6 M Üre, %5 buzlu asit asetik ve çift damıtılmış suyu çözerek 100 μL TAU numune tamponu hazırlayın. Hazırlanan liyofilize numuneyi 30 μL TAU numune tamponunda çözün.
3. Mini kaseti TAU çalışma tamponu,% 5 asetik asit nihai konsantrasyonu ile doldurun. TAU-jelin kuyucuklarını çalışan tamponla doldurulmuş bir şırınga ile durulayın ve numuneyi bir mikropipet kullanarak kuyuya yükleyin.
4. Elektroforetik odayı, pozitif (kırmızı) elektrot alta yerleştirilmiş olarak güç kaynağına bağlayın. IP pH > olduğunda, proteinler pozitif yüklüdür, bu nedenle göç pozitiften negatif elektrota doğru olur. Jeli önce 70 dakika boyunca 30 V'ta, ardından 17 saat boyunca 25 V'luk sabit voltajda çalıştırın.
   NOT: Bu süre zarfında, ara sıra güç kaynağını kapatın ve tek kullanımlık bir şırınga kullanarak jel kuyularını durulayın. Numune kaybını ve çözülen proteinlerde bir lekelenme olmasını önlemek için bir şırınga kullanarak jelin alt yüzeyindeki kabarcıkları çıkarmaya dikkat edin.
5. Jeli jel plakalardan çıkarın ve ilgi hattını temiz bir neşter ile kesin. Jel kırılmasını önlemek için jeli dikkatlice kullanın. İlgi alanı renksiz olduğundan, ilgilenilen şeridi tam olarak tanımlamak ve kesmek için numuneyi 1 numaralı kuyuya yükleyin.
   NOT: Mini-TAU jel üzerindeki ayrılmayı kontrol etmek için, numuneyi iki kopya halinde hazırlayın ve çalıştırın. Bu jellerden biri Coomassie Brilliant Blue kullanılarak boyanabilir. Ayrılma modeli Şekil 1A'da rapor edilmiştir.
6. Şeridi 15 mL 0.5 M Tris-HCl pH 8.8 ile 15 dakika boyunca yıkayın.
7. 6 M Üre, 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, %30 gliserol, %20 SDS ve %2 Ditioeritritol kullanarak 15 mL dengeleme tamponu 1 hazırlayın. 6 M Üre, 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, %30 gliserol, %20 SDS ve %2 İyodoasetamid kullanarak 15 mL dengeleme tamponu 2 hazırlayın. Dengeleme tamponu 1 ve 2'yi kullanmadan hemen önce hazırlayın; Dengeleme tamponunu 2 karanlıkta saklayın.
8. Jel şeridini hafif çalkalama altında 10 mL dengeleme tamponu 1 içinde 15 dakika inkübe edin, ardından boşaltın. Jel şeridini hafif çalkalama altında, 10 mL dengeleme tamponu 2 ile karanlıkta 15 dakika inkübe edin, ardından boşaltın.
9. Tablo 15'i takip ederek çözülen bir SDS % 1 akrilamid jeli hazırlayın. Jel plakasını ayarlayın ve çözücü jel çözeltisi ile doldurun. Solüsyonu uzun jel plakanın ucundan 1,5 cm uzakta olana kadar doldurun. Jeli düzleştirmek ve polimerize olmasını sağlamak için yüzeye 1 mL izopropanol koyun.
10. Jel polimerizasyonundan sonra, izopropanolü boşaltın ve kuyuyu 3MM Chr Selüloz Kromatografi Kağıdı ile kurulayın. Elde edilen şeridi 8. adımdan jel kuyusuna yerleştirin.
11. 1x Tris/glisin/SDS tamponunda %0,5 düşük erime noktalı agaroz ve 5 μL %0,003 bromofenol mavisi sızdırmazlık solüsyonu ile çözme jeline giden şeridi kapatın. 30 dakika agaroz jel polimerizasyonuna izin verin.
    NOT: Jel bulaşmasını önlemek için agaroz sızdırmazlığı sırasında hava kabarcıkları oluşmasını önleyin.
12. Jel plakaları kasete yerleştirin ve 1x Tris / glisin / SDS tamponu ile doldurun. Bromofenol mavisi boya dibe ulaşana kadar jeli 120 V'ta çalıştırın. Jeli plakalardan nazikçe çıkarın, fazla agarozu atın ve immünolojik test için kütle spektrometresi veya leke ile uyumlu bir prosedür kullanarak jeli gümüş lekeleyin.

3. Gümüş boyama ³²

1. Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın - Fiksatif:% 50 metanol,% 5 asetik asit,% 45 deiyonize su; Yıkama çözeltisi: %50 metanol, %50 deiyonize su; Hassaslaştırıcı: Deiyonize suda %0,02_Na2S2O35H2O; Gümüş reaktifi: soğuk (4°C) deiyonize suda %0.1 gümüş nitrat; Geliştirici:% 0.04 Formalin ve% 2 Na₂CO₃, Formaldehit (% 37) (kullanmadan hemen önce ekleyin) 0.4 mL deiyonize su ve 1000 mL'ye kadar doldurun; Durdurucu reaktif:% 5 asetik asit; Jel saklama çözeltisi:% 1 asetik asit.
   NOT: Boyama için kullanılan kimyasallar tehlikeli olduğundan, tüm adımları kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirin.
2. Aşağıdaki hususları göz önünde bulundurarak Tablo 2'deki prosedürü izleyin. Tüm inkübasyonları hafif çalkalama ile gerçekleştirin. Geliştirme adımına başlamadan önce durdurma reaktifini hazırlayın; Bu, uygun yoğunlukta jel gelişimini sağlayacaktır. Geliştirme aşaması sırasında, inkübasyonun sonunda açık kahverengiye dönüşecek olan sarı sinyaller olarak lekeler görünecektir. Farklı noktaların yoğunluğu, histon proteoformlarının miktarına bağlı olacaktır. Jel, nokta eksizyonu ve jel içi sindirim için hazırdır (Şekil 1B)

4. Jel içi sindirim

1. Aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: 50 mM amonyum bikarbonat (_NH4HCO3)/%50 (h/h) asetonitril; 50 mM NH_4HCO3 içinde 10 mM ditiyotreitol (DTT); 50 mM NH₄HCO₃ içinde 55 mM iyodoasetamid (IAA); % 0.1 TFA; 50 mM NH₄HCO₃, pH 8; HPLC sınıfı Asetonitril; 1 mL silikon tüpler.
   NOT: Saç veya ciltten insan keratin kontaminasyonunu önlemek için temiz eldiven kullanın ve temiz bir alanda çalışın.
2. Temiz bir neşter kullanarak lekeli jelden ilgilenilen histon lekelerini çıkarın ve bunları yeni bir silikon tüpe (1.5 mL) yerleştirin. İzoform çapraz kontaminasyonunu önlemek için tek bir noktayı eksize etmeye ve tek bir tüpe koymaya özen gösterin.
3. Her bir jel noktasına 250 μL 50 mM NH₄HCO₃/50% asetonitril ekleyin ve oda sıcaklığında bir termomikserde hafif çalkalama altında inkübe edin. Çözeltiyi boşaltın ve bu adımı 3 kez tekrarlayın. Jel parçaları şeffaf görünecektir.
4. Asetonitril (200 μL) ekleyerek jel lekelerini kurutun. Bu aşamada jel parçaları opak-beyaz bir renk alacaktır.
5. Asetonitrili boşaltın ve 10 dakika kurumaya bırakın. Jel parçası tüpte kurumuş görünecektir. Dengeleme aşaması sırasında histon proteinleri indirgendiği ve alkillendiği için indirgeme ve alkilasyon gerekli değildir.
6. Jel lekelerini 20 μL tripsin çözeltisinde (0.1 mM HCl) veya jel parçalarını kaplamak için yeterli bir hacimde rehidre edin. Tüpleri termomiksere yerleştirin ve hafif çalkalama altında 37 °C'de en az 4 saat ila 16 saat arasında inkübe edin.
7. Triptik peptitleri içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Jel parçalarına 50 μL ekstraksiyon çözeltisi (% 60 asetonitril,% 1 TFA) ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca ultrasonik bir su banyosunda 2x sonikat yapın.
8. Ek triptik peptitler içeren süpernatanı taze tüpe aktarın. Havuzlanmış ekstrakte edilmiş peptitleri kurutmak için bir liyofilizatör kullanın. Liyofilizatörü 30 °C'ye ayarlayın ve çözeltiyi kurutun; Tüpte liyofilize bir pelet görünecektir.
   NOT: Bu adım hacme bağlıdır; Genellikle 1 saat yeterlidir, ancak numune tamamen kuruyana kadar hacmi her 10 dakikada bir kontrol edin.
9. Her tüpe 15 μL %0,1 TFA ekleyin ve 25 °C'de bir termomikserde nazikçe inkübe edin. Süpernatanı LC-MS/MS analizi için şişeye aktarın.

5. 2DTAU batı lekesi

1. Çift damıtılmış su kullanarak transfer tamponunu, 250 mM Tris bazını, 92 mM glisini ve% 10 metanolü hazırlayın.
2. Nitroselüloz membranı ve filtre kağıdını jelin boyutlarına göre kesin.
3. Jeli dengeleyin ve zarı, filtre kağıdını ve filtre kağıtlarını transfer tamponunda 15 dakika bekletin. Nitroselüloz veya PVDF membranları kullanın. PVDF (Poliviniliden diflorür) membranları kullanılıyorsa, bunları %100 MetOH'ye batırarak etkinleştirin.
4. Kasetteki jel sandviçi Yarı kuru transfer için aşağıdaki gibi hazırlayın: Negatif elektrot / Filtre Kağıdı / Jel / Nitroselüloz membran / Filtre kağıdı / Pozitif elektrot. İyi sonuçlar elde etmek için jel ve zar arasındaki hava kabarcıklarını çıkarın.
5. Kaseti Yarı kuru üniteye yerleştirin ve lekeyi 25 V'ta 30 dakika çalıştırın. Sonunda, kurutma sandviçini sökün ve immünolojik tahlil için zarı saklayın. Ponceau boyama ile transfer verimliliğini kontrol edin. Doğru filtre yönünü korumak için membranı sağ üstte bir işaretle işaretleyin.
6. Deneye bağlı olarak birincil ve ikincil antikorlarla inkübe edin (Şekil 2).

Sonuçlar

Şekil 1A'da, histon proteinlerinin 1D bir jel içinde nasıl göç ettiğini gözlemlemek mümkündür. Bu, ilk boyutun çalışma süresini anlamak için önemli bir ön adımdır. Doğru ayrılma zamanı belirlendikten sonra, ikinci boyutu çalıştırın. Histon proteoformlarının 2B haritası, belirgin bir topografik model gösterir (Şekil 1B). Şekil 1B'deki her nokta belirli bir histon tipi...

Tartışmalar

Son on yılda, kanser hastası tedavisi, kanser gelişimini ve ilerlemesini yönlendiren çeşitli moleküler değişiklikleri tanımlayarak devrim yaratmıştır. Modern onkolojideki en önemli gelişme, kapsamlı moleküler analize dayalı tedavinin geliştirilmesidir. Genomik ve proteomikteki teknolojik gelişmeler, erken tespit, sürveyans, prognoz ve ilaç izleme için spesifik biyobelirteçlerin profillenmesinde çok önemli bir rol oynamıştır. Proteomik, belirli bir koşul alt?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	SIGMA- ALDRICH	D8255	Reagent for maintaining −SH groups in the reduced state; quantitatively reduces disulfides.
1,5 M Tris-HCL buffer, pH 8.8	BIO-RAD	161-0798	Resolving Gel Buffer
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD	1610772	Use this premixed 10x Tris/glycine/SDS running buffer to separate protein samples by SDS-PAGE.
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	33539	2-Propanol (Isopropanol) is a secondary alcohol. It has been tested as a substitute to fuel for use in various fuel cells. CuO powder dissolved in 2-propanol has been used for the laser ablation assisted synthesis of Cu colloids. Suspension of 2-propanol with Zn(NO3)2 has been employed for the fabrication of titanium dioxide-coated stainless steel (P25-TiO2/SS) photoanode coated with uniformly thick layer of P25-TiO2.This photoanode was used for the electrochemical photocatalytic (ECPC) degradation process.
30% Acrylamide/Bis Solution	BIO-RAD	1610158	2.6% Crosslinker. Electrophoresis purity reagent
Acetic Acid Glacial	Carlo Erba Reagennts	401392	Acetic acid is an important chemical reagent with many industrial applicatios.
Acetone	Panreac Applichem	211007.1214	Acetone is a solvent, renowned for its versatility in various laboratory, manufacturing, and cleaning applications.
Acetonitile	VWR	83640320	for HPLC   LC-MS grade
Agarose	Invitrogen	15510-027	Agarose is a heteropolysaccharide  frequently used in molecular biology.
Ammonium bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	A6141	minimum 99,0%
Ammonium persulfate	SIGMA-ALDRICH	A3678	For molecular Biology, For electrophoresis, ≥98%
Bioruptor plus	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	sonicator
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	Reducing agent used to reduce disulfide bonds in proteins.
Dodeca Silver Stain Kit	BIO-RAD	161-0480	The Dodeca silver stain kit is easy-to-use for the detection of nonagram levels of proteins in polyacrylamide gels.
Glycerol	GE - Healthcare Life Sciences	171325010L	Glycerol is a simple triol compound, it is involved to aid in casting gradient gels, protein stabilizer and storage buffer component.
Halt Phosphatase Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail preserves the phosphorylation state of proteins during and after cell lysis or tissue protein extraction  Single- Use Cocktail (100X).
Halt Protease Inhibitor	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) are ready-to-use concentrated stock solutions of protease inhibitors for addition to samples to prevent proteolytic degradation during cell lysis and protein extraction. Single- Use Cocktail (100X).
Hydrochloric acid	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReagent, for molecular biology
Iodoacetamide	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥99% (NMR), crystalline
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	Potassium chloride, KCl, is generally used in laboratory routines. Its use as a storage buffer for pH electrodes and as a reference solution for conductivity measurements is well established.
MCF10 cell line	atcc	CRL-10317	epithelial cell line that was isolated in 1984 from the mammary gland of a White, 36-year-old female with fibrocystic breasts. This cell line was deposited by the Michigan Cancer Foundation.
MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	Magnesium chloride is a colorless crystalline solid.
N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamine	SIGMA-ALDRICH	T9281	For Electrophoresis, approx. 99%
Phosphate saline buffer 1X	Corning	15373631	1 X PBS (phosphate buffered saline) is a buffered balanced salt solution used for a variety biological and cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Potassium hexacyanoferrate	SIGMA-ALDRICH	60299	Electron acceptor, employed in systems involving electron transport,
SDS Solution 20% (w/v)	BIO-RAD	161-0418	Sodium dodecyl sulfate. Electrophoresis purity reagent
Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%	SIGMA- ALDRICH	21,726-3	Sodium thiosulfate, ReagentPlus 99%
Sulfuric acid	SIGMA-ALDRICH	339741	Sulfuric Acid, Reagent, is an extremely corrosive acid that comes as yellowy slightly viscous liquid. It is soluble in water and is a diprotic acid. It has very strong corrosive, dehydrating and oxidizing properties as well as being hygroscopic.
Trichloroacetic acid	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	Trichloroacetic acid (TCA) is used as a reagent for the precipitation of proteins1,2 and nucleic acids3.
Trifluoroacetic acid	Riedel-de Haën	34957	Trifluoroacetic acid
Triton X-100	SIGMA- ALDRICH	T9284-1L	Triton X-100 is a nonionic polyoxyethylene surfactant that is most frequently used to extract and solubilize proteins.
Trypsin from porcine pancreas	SIGMA-ALDRICH	T6567	Proteomics Grade, BioReagent, Dimethylated
UREA	SIGMA-ALDRICH	33247	Urea is a chaotropic agent and is used for protein denaturation. It disturbs the hydrogen bonds in the secondary, tertiary and quaternary structure of proteins. It can also disturb hydrogen bonding present in DNA secondary structure