JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم فحص الخلايا المحيطة في الأوعية الدموية الشبكية عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي باستخدام مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية β بعد الحقن المداري الرجعي ليكتين الطماطم الفلوري. تمت معالجة شبكية العين المسماة بطريقة تطهير الأنسجة وتم تركيبها بالكامل لتصور المناظر ثلاثية الأبعاد للخلايا المحيطة بالأوعية الدموية الشبكية تحت مجهر متحد البؤر.

Abstract

تعتبر خلايا الشبكية الحضاقية ضرورية لنمو الأوعية الدموية واستقرار شبكية العين ، وتلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على سلامة الأوعية الدموية في الشبكية. لتقديم عرض مفصل للخصائص المورفولوجية للخلايا الحضجة ، وصفت هذه الدراسة نهجا جديدا يجمع بين الحقن المداري الرجعي لعامل الفلورسنت ، والتلوين المناعي الفلوري ، ومعالجة إزالة الأنسجة. أولا ، تم حقن ليكتين الطماطم الفلوري في الجيب المداري الرجعي للفأر الحي لتسمية الأوعية الدموية في الشبكية. بعد 5 دقائق ، تم التضحية بالفأر ، وتمت إزالة شبكية العين السليمة بعناية من كوب الشبكية وصبغها بفلورية مناعية بمستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية β للكشف عن الحضواج. بالإضافة إلى ذلك ، تمت معالجة شبكية العين الملطخة بكاشف لإزالة الأنسجة وتركيبها بالكامل على شريحة المجهر. من خلال هذه الأساليب ، لوحظت الأوعية الدموية الشبكية والخلايا العمومية بوضوح في شبكية العين الشفافة. تحت المجهر متحد البؤر ، حصلنا على المزيد من الفرص لالتقاط صور عالية الدقة لمزيد من إعادة بناء وتحليل الخصائص المورفولوجية للخلايا الحضاقية على طول شجرة الأوعية الدموية الشبكية في عرض ثلاثي الأبعاد. من الناحية المنهجية ، يقدم هذا البروتوكول نهجا فعالا لتصور التبريقات داخل الأوعية الدموية الشبكية ، مما يوفر رؤى قيمة حول دورها في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية.

Introduction

يتم تضمين خلايا الشبكية داخل الغشاء القاعدي على طول الجانب العظمي للخلايا البطانية الوعائية ، مما يعرض نمطا يشبه الشبكة من العمليات قصيرة المدى الملفوفة حول الأوعية الدمويةفي الشبكية 1. يساهم هذا الاتصال الحميم بين التناسقات والأوعية الدموية في الشبكية في الحفاظ على التوازن البيئي للشبكية2. على الرغم من أن العديد من الدراسات قدمت دليلا مورفولوجيا على الخلايا المحيطة في الأوعية الدموية الشبكية ، إلا أن معظم فهمنا للخصائص المورفولوجية للخلايا المحيطة في الشبكية يأتي من التقنيات النسيجيةالتقليدية 3.

تماشيا مع هذه الدراسات ، صممنا هذه الدراسة لعرض المزيد من التفاصيل المورفولوجية للخلايا المحيطة في الأوعية الدموية الدقيقة في الشبكية من خلال الجمع بين التقنيات النسيجية التقليدية والأساليب العلمية الحديثة المتطورة. يدمج النهج هنا ثلاث تقنيات رئيسية: الحقن المداري الرجعي ليكتين الطماطم الفلورية في الفئران الحية ، وتلوين الفلورسنت المناعي باستخدام β مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGFR-β) ، واستراتيجية إزالة الأنسجة القائمة على المذيبات. ثبت أن الحقن المداري الرجعي ليكتين الطماطم الفلوري فعالا وموثوقا به لمراقبة الأوعية الدموية الشبكية للفأر في كل من الإعدادات في الجسم الحي وفي المختبر 4،5. يعمل PDGFR-β كمؤشر حيوي شائع الاستخدام لتلوين الفلورسنت المناعي للخلايا6. لالتقاط صور عالية الدقة للخلايا التمويقية داخل شبكية العين السميكة والكاملة ، تعزز استراتيجية إزالة الأنسجة الشفافية النسيجية2،7،8.

في حين تم تطبيق كل من هذه التقنيات بشكل فردي في دراسات الشبكية ، فإن توافقها المشترك لفحص الخلايا المحيطة في الأوعية الدموية لشبكية الفئران لا يزال غير مؤكد. نظرا لأن متوسط سمك شبكية الفأر يبلغ حوالي 180-220 ميكرومتر9 ، فإن وضع العلامات على الأجسام المضادة والتصوير متحد البؤر في هذا النسيج السميك دون إزالة العلاج غالبا ما يؤدي إلى إشارات خلفية عالية ، مما يعقد ملاحظة العلاقة المكانية بين الخلايا والأوعية الدموية10. من خلال الأساليب الموضحة هنا ، نهدف إلى توفير طريقة مباشرة لتصور التبريج داخل الأوعية الدموية الشبكية في عرض ثلاثي الأبعاد (3D) تحت المجهر متحد البؤر. يمكن أن تؤدي هذه المعلومات الخلوية المحسنة من الخلايا الحضجة في الأوعية الدموية الشبكية إلى تحسين فهمنا للتوازن البيئي في الشبكية والتأكيد على الاستراتيجيات المحتملة لحماية الأوعية الدموية ، وبالتالي تعزيز النتائج الوظيفية في اضطرابات الأوعية الدموية في الشبكية.

Protocol

في هذه الدراسة ، تم استخدام ثلاثة فئران من الذكور C57BL / 6 من الشباب (8-10 أسابيع ، تزن 20-25 جم). تم إيواؤهم في دورة إضاءة / مظلمة مدتها 12 ساعة مع درجة حرارة ورطوبة يتم التحكم فيها وسمحوا بالوصول المجاني إلى الطعام والماء. تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد الوخز بالإبر والكي ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية الصينية (رقم الموافقة 2023-03-14-04) وتم إجراؤها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (مطبعة الأكاديمية الوطنية ، واشنطن العاصمة ، 1996).

1. في الجسم الحي حقن الرجعية المدارية ليكتين الطماطم الفلورية

  1. حقن 50 ملغم / كجم بنتوباربيتال داخل الصفاق لتخدير الفأر. قم بتقييم عمق التخدير من خلال تقييم عدم وجود استجابة لتحفيز قرصة إصبع القدم.
  2. ضع الماوس في الاستلقاء الجانبي الأيمن مع توجيه رأسه إلى اليسار.
  3. اضغط بإصبعين برفق على المنطقة المحيطة بالحجاج لكشف العين اليسرى للفأر للسماح بأسهل إعطاء الحقن في الجيب الأنفي الرجعي الأيسر للحيوان11.
  4. استخدم حقنة سعة 1 مل مزودة بإبرة 27G لاختراق حوالي 2-3 مم برفق في الجيوب الأنفية الوريدية المدارية للماوس مع توجيه شطبة الإبرة للأمام بزاوية 45 درجة.
  5. حقن 0.1 مل (1 ملغ/مل) من ليكتين الطماطم الفلوري في الجيوب الأنفية الوريدية المدارية للفأر.

2. نضح واستئصال العينين

  1. بعد 5 دقائق من الحقن الحجاجي الرجعي ، قم بحقن محلول ثلاثي البروم الإيثانول (250 مجم / كغ) داخل الصفاق لتخدير الفأر بعمق. بعد ذلك ، قتل عن طريق التروية والنضح القلبي. بمجرد توقف التنفس ، افتح التجويف الصدري بمقص جراحي12.
  2. بمجرد توقف التنفس ، افتح التجويف الصدري بمقص جراحي. تعقيم الأدوات الجراحية مسبقا والعمل في غطاء الدخان. استخدم إبرة 24G وأدخلها 2 مم في البطين القلبي الأيسر من خلال قمة البطين الأيسر. قم بإجراء التروية بمعدل 3 مل / دقيقة مع 20 مل من محلول ملحي فسيولوجي 0.9٪ متبوعا ب 20 مل من الفورمالديهايد 4٪ في محلول الفوسفات 0.1 M (PB ، الرقم الهيدروجيني 7.4).
  3. ضع الفأر المضحى على جانبه وقم بإزالة الجلد الذي يغطي العينين بالمقص. استئصال العينين بالمقص والملقط.
  4. قم بقطع العصب البصري والأنسجة المحيطة به ، ثم ارفع العين وانقلها إلى صفيحة مكونة من 12 بئرا للتثبيت اللاحق في 4٪ فورمالديهايد في 0.1 M PB لمدة ساعتين.
  5. قم بالتبريد بحماية الأنسجة في 25٪ سكروز في 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4) عند 4 درجات مئوية حتى تغرق في قاع المحلول.
    ملاحظة: نظرا لأن أنسجة العين تجف جيدا في محلول السكروز ، يمكن فصل شبكية العين بسهولة أكبر وبشكل كامل ، مما يسهل الدراسات الشاملة اللاحقة.

3. تشريح شبكية العين

  1. انقل العينين إلى طبق بتري يحتوي على 0.1 ميجا بيتابل (درجة الحموضة 7.4) باستخدام ماصة باستور بلاستيكية.
  2. اخترق حافة القرنية بمقص حاد ، وقطع حول القرنية والقزحية ، وتخلص منها.
  3. استخدم ملقطا لإزالة العدسة والخلط الزجاجي. ثم اسحب شبكية العين على شكل كوب بعيدا عن مركز العين باستخدام ملقط دقيق. اشطف شبكية العين ب 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4) في طبق بتري نظيف.

4. تلطيخ الفلورسنت المناعي وتطهير أنسجة شبكية العين

  1. قم بإزالة شبكية العين على شكل كوب بعناية واحتضانها في محلول Triton X-100 بنسبة 2٪ في 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  2. انقل شبكية العين إلى محلول الحجب (0.1 M PB + 1٪ Triton-X 100 + 0.2٪ أزيد الصوديوم + 10٪ مصل الحمار العادي) وقم بتدويرها عند 72 دورة في الدقيقة على الخلاط طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  3. انقل شبكية العين إلى المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية للماعز المضاد ل PDGFR-β (10 ميكروغرام / مل) في مخزن مؤقت للتخفيف (0.1 M PB + 0.2٪ Triton-X 100 + 0.2٪ أزيد الصوديوم + 1٪ مصل حمار عادي) في أنبوب طرد مركزي دقيق وقم بتدويره على شاكر لمدة يومين عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل شبكية العين 2x بمحلول غسيل (0.1 M PB + 0.2٪ Triton-X 100) في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتفظ بها في مخزن الغسيل طوال الليل عند 4 درجات مئوية على الخلاط.
  5. في اليوم التالي ، انقل شبكية العين إلى المحلول المختلط الذي يحتوي على الجسم المضاد الثانوي 1 مجم / مل من الحمار المضاد للماعز 488 و 0.2 نانوغرام / مل نووي الفلورسنت 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وقم بالتدوير عند 72 دورة في الدقيقة على شاكر لمدة 5 ساعات عند 4 درجات مئوية.
  6. اغسل شبكية العين في طبق من 6 آبار مع مخزن مؤقت للغسيل لمدة 1 ساعة ، 2x ، في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بشبكية العين في محلول الغسيل على الخلاط طوال الليل عند 4 درجات مئوية. قم بإجراء التصوير والتحليل وفقا للخطوة 5 للحصول على طرق عرض ما قبل إزالة الأنسجة.
  7. انقل شبكية العين إلى كاشف تنظيف الأنسجة وقم بتدويرها برفق عند 60 دورة في الدقيقة على الخلاط لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
  8. بعد علاج تنظيف الأنسجة ، اشطف شبكية العين على شكل كوب ب 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4) في طبق بتري نظيف.
  9. قم بعمل 4 شقوق شعاعية تصل إلى حوالي 2/3 من نصف قطر شبكية العين باستخدام مقص زنبركي لإنشاء شكل بتلة.
  10. قم بتسطيح شبكية العين وتركيبها على شريحة مجهرية ، ثم قم بإزالة أي PB زائد بقطعة صغيرة من الورق الماص. حافظ على الجزء الداخلي من شبكية العين متجها لأعلى على الشريحة.
  11. ضع دائرة حول شبكية العين المثبتة بفاصل واملأ الفجوة بكاشف جديد لتنظيف الأنسجة وغطاء غطاء.

5. التصوير والتحليلات

  1. احصل على المناظر الخارجية لشبكية العين قبل (بعد إكمال الخطوة 4.6) وبعد علاج إزالة الأنسجة.
  2. امسح مناظر المونتاج لشبكية العين المصنفة باستخدام الماسح الضوئي البانورامي لشريحة المناديل. استخدم عدسة أهداف 2x مع NA 0.08.
  3. التقط صورا مكبرة أعلى بواسطة نظام التصوير متحد البؤر المجهز بعدسات الأهداف التالية: عدسة 10x مع NA 0.40 وعدسة 40x مع NA 0.95. اضبط الثقب متحد البؤر على 152 ميكرومتر (عدسة موضوعية 10x) و 105 ميكرومتر (عدسة موضوعية 40x). اضبط الدقة المكانية لالتقاط الصورة على 1024 × 1024 بكسل (عدسة موضوعية 10x) و 640 × 640 بكسل (عدسة موضوعية 40x).
  4. التقط 50 صورة (مكدس Z) في إطارات 2 ميكرومتر من شبكية العين المسماة. دمج جميع الصور في تركيز بؤري واحد ضمن وضع الإسقاط / التضاريس. للإعداد، انقر فوق Set Start Focal Plane > Set End focal level > Set Step Size > Choose Depth Pattern > Image Capture > Z series.
  5. التقاط الصور باستخدام الأطوال الموجية التالية للإثارة والانبعاث لإشارات مضان مختلفة: إشارات مضان أخضر عند 499 نانومتر و 519 نانومتر. إشارات مضان حمراء عند 591 نانومتر و 618 نانومتر ؛ وإشارات مضان زرقاء عند 401 نانومتر و 421 نانومتر.
  6. أعد بناء الصور في النمط ثلاثي الأبعاد عن طريق استيراد الصور متحدة البؤر Z-stack إلى برنامج تحليل عن طريق تحديد إضافة أسطح جديدة > اختيار إعدادات مستوى الصوت > اختيار قناة المصدر > ضبط الشاشة > ضبط زاوية السطح > لقطة.

النتائج

من المناظر الخارجية لشبكية العين بالكامل ، تمت زيادة شفافية الأنسجة لشبكية العين بالكامل باستخدام علاج تطهير الأنسجة مقارنة بتلك الموجودة في شبكية العين دون تطهير الأنسجة (الشكل 1).

بالنسبة للفحص النسيجي على شبكية العين بالكامل ، تم تمييز...

Discussion

في هذه الدراسة ، قمنا بتفصيل العملية الفنية لتوضيح مورفولوجيا الخلايا المحيطة في الأوعية الدموية الشبكية باستخدام الحقن المداري الرجعي ليكتين الطماطم الفلوري ، وفحص الفلورسنت المناعي باستخدام PDGFR-β ، وإزالة الأنسجة القائمة على المذيبات. تظهر النتائج أن هذه التقنيات م?...

Disclosures

لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (رقم 7244480) ، وصندوق الابتكار CACMS (رقم . CI2021A03407) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82004492) ، وصناديق البحوث الأساسية لمعاهد أبحاث الرفاه العام المركزية (الأرقام ZZ-YQ2023008 و ZZ14-YQ-032 و ZZ-JQ2023008 و ZZ-YC2023007).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571Protect from light
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11055Protect from light
C57BL/6 mouseBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK (Jing) 2021-0006
Confocal imaging systemOlympusFV1200
Goat anti-PDGFR-βResearch and DevelopmentAF104225 µg 
Imaris softwareOxford Instrumentsv.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594Thermo Fisher ScientificL324711 mg
Microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C1.5 mL
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-12110 mL
Panoramic tissue slice scannerOlympusVS120-S6-W
Photoshop and  IllustrationAdobeCS6
RapiClear 1.52 SolutionSunJin LabRC15200110 mL
Six-well plateCostar3335
Spring scissors Fine Science Tools15003-08
Superfrost Plus microscope slideThermo Fisher Scientific4951PLUS-00125 mm x 75 mm x 1 mm

References

  1. Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. Retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes. J Vis Exp. (140), e57733 (2018).
  2. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. (77), e50546 (2013).
  3. Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nat Commun. 8, 15296 (2017).
  4. Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2795-2806 (2004).
  5. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
  6. Hutter-Schmid, B., Humpel, C. Platelet-derived growth factor receptor-beta is differentially regulated in primary mouse pericytes and brain slices. Curr Neurovasc Res. 13 (2), 127-134 (2016).
  7. Wang, X., et al. Demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches. J Vis Exp. (183), e63807 (2022).
  8. Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. J Vis Exp. (167), e61742 (2021).
  9. Batista, A., et al. Normative mice retinal thickness: 16-month longitudinal characterization of wild-type mice and changes in a model of Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 15, 1161847 (2023).
  10. Huang, H. Pericyte-endothelial interactions in the retinal microvasculature. Int J Mol Sci. 21 (19), 7413 (2020).
  11. Dong, X., et al. Exosome-mediated delivery of an anti-angiogenic peptide inhibits pathological retinal angiogenesis. Theranostics. 11 (11), 5107-5126 (2021).
  12. Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
  13. Riew, T. R., Jin, X., Kim, S., Kim, H. L., Lee, M. Y. Temporal dynamics of cells expressing ng2 and platelet-derived growth factor receptor-β in the fibrotic scar formation after 3-nitropropionic acid-induced acute brain injury. Cell Tissue Res. 385 (3), 539-555 (2021).
  14. Susaki, E. A., et al. Advanced cubic protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  15. Liang, H., et al. Cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. J Vis Exp. (114), e54401 (2016).
  16. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annu Rev Vis Sci. 7, 129-153 (2021).
  17. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced clarity for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  18. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  20. Alarcon-Martinez, L., Yemisci, M., Dalkara, T. Pericyte morphology and function. Histol Histopathol. 36 (6), 633-643 (2021).
  21. Dessalles, C. A., Babataheri, A., Barakat, A. I. Pericyte mechanics and mechanobiology. J Cell Sci. 134 (6), jcs240226 (2021).
  22. Alarcon-Martinez, L., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217 (2023).
  23. Uemura, M. T., Maki, T., Ihara, M., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. Brain microvascular pericytes in vascular cognitive impairment and dementia. Front Aging Neurosci. 12, 80 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved