A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
تم فحص الخلايا المحيطة في الأوعية الدموية الشبكية عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي باستخدام مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية β بعد الحقن المداري الرجعي ليكتين الطماطم الفلوري. تمت معالجة شبكية العين المسماة بطريقة تطهير الأنسجة وتم تركيبها بالكامل لتصور المناظر ثلاثية الأبعاد للخلايا المحيطة بالأوعية الدموية الشبكية تحت مجهر متحد البؤر.
تعتبر خلايا الشبكية الحضاقية ضرورية لنمو الأوعية الدموية واستقرار شبكية العين ، وتلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على سلامة الأوعية الدموية في الشبكية. لتقديم عرض مفصل للخصائص المورفولوجية للخلايا الحضجة ، وصفت هذه الدراسة نهجا جديدا يجمع بين الحقن المداري الرجعي لعامل الفلورسنت ، والتلوين المناعي الفلوري ، ومعالجة إزالة الأنسجة. أولا ، تم حقن ليكتين الطماطم الفلوري في الجيب المداري الرجعي للفأر الحي لتسمية الأوعية الدموية في الشبكية. بعد 5 دقائق ، تم التضحية بالفأر ، وتمت إزالة شبكية العين السليمة بعناية من كوب الشبكية وصبغها بفلورية مناعية بمستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية β للكشف عن الحضواج. بالإضافة إلى ذلك ، تمت معالجة شبكية العين الملطخة بكاشف لإزالة الأنسجة وتركيبها بالكامل على شريحة المجهر. من خلال هذه الأساليب ، لوحظت الأوعية الدموية الشبكية والخلايا العمومية بوضوح في شبكية العين الشفافة. تحت المجهر متحد البؤر ، حصلنا على المزيد من الفرص لالتقاط صور عالية الدقة لمزيد من إعادة بناء وتحليل الخصائص المورفولوجية للخلايا الحضاقية على طول شجرة الأوعية الدموية الشبكية في عرض ثلاثي الأبعاد. من الناحية المنهجية ، يقدم هذا البروتوكول نهجا فعالا لتصور التبريقات داخل الأوعية الدموية الشبكية ، مما يوفر رؤى قيمة حول دورها في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية.
يتم تضمين خلايا الشبكية داخل الغشاء القاعدي على طول الجانب العظمي للخلايا البطانية الوعائية ، مما يعرض نمطا يشبه الشبكة من العمليات قصيرة المدى الملفوفة حول الأوعية الدمويةفي الشبكية 1. يساهم هذا الاتصال الحميم بين التناسقات والأوعية الدموية في الشبكية في الحفاظ على التوازن البيئي للشبكية2. على الرغم من أن العديد من الدراسات قدمت دليلا مورفولوجيا على الخلايا المحيطة في الأوعية الدموية الشبكية ، إلا أن معظم فهمنا للخصائص المورفولوجية للخلايا المحيطة في الشبكية يأتي من التقنيات النسيجيةالتقليدية 3.
تماشيا مع هذه الدراسات ، صممنا هذه الدراسة لعرض المزيد من التفاصيل المورفولوجية للخلايا المحيطة في الأوعية الدموية الدقيقة في الشبكية من خلال الجمع بين التقنيات النسيجية التقليدية والأساليب العلمية الحديثة المتطورة. يدمج النهج هنا ثلاث تقنيات رئيسية: الحقن المداري الرجعي ليكتين الطماطم الفلورية في الفئران الحية ، وتلوين الفلورسنت المناعي باستخدام β مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGFR-β) ، واستراتيجية إزالة الأنسجة القائمة على المذيبات. ثبت أن الحقن المداري الرجعي ليكتين الطماطم الفلوري فعالا وموثوقا به لمراقبة الأوعية الدموية الشبكية للفأر في كل من الإعدادات في الجسم الحي وفي المختبر 4،5. يعمل PDGFR-β كمؤشر حيوي شائع الاستخدام لتلوين الفلورسنت المناعي للخلايا6. لالتقاط صور عالية الدقة للخلايا التمويقية داخل شبكية العين السميكة والكاملة ، تعزز استراتيجية إزالة الأنسجة الشفافية النسيجية2،7،8.
في حين تم تطبيق كل من هذه التقنيات بشكل فردي في دراسات الشبكية ، فإن توافقها المشترك لفحص الخلايا المحيطة في الأوعية الدموية لشبكية الفئران لا يزال غير مؤكد. نظرا لأن متوسط سمك شبكية الفأر يبلغ حوالي 180-220 ميكرومتر9 ، فإن وضع العلامات على الأجسام المضادة والتصوير متحد البؤر في هذا النسيج السميك دون إزالة العلاج غالبا ما يؤدي إلى إشارات خلفية عالية ، مما يعقد ملاحظة العلاقة المكانية بين الخلايا والأوعية الدموية10. من خلال الأساليب الموضحة هنا ، نهدف إلى توفير طريقة مباشرة لتصور التبريج داخل الأوعية الدموية الشبكية في عرض ثلاثي الأبعاد (3D) تحت المجهر متحد البؤر. يمكن أن تؤدي هذه المعلومات الخلوية المحسنة من الخلايا الحضجة في الأوعية الدموية الشبكية إلى تحسين فهمنا للتوازن البيئي في الشبكية والتأكيد على الاستراتيجيات المحتملة لحماية الأوعية الدموية ، وبالتالي تعزيز النتائج الوظيفية في اضطرابات الأوعية الدموية في الشبكية.
في هذه الدراسة ، تم استخدام ثلاثة فئران من الذكور C57BL / 6 من الشباب (8-10 أسابيع ، تزن 20-25 جم). تم إيواؤهم في دورة إضاءة / مظلمة مدتها 12 ساعة مع درجة حرارة ورطوبة يتم التحكم فيها وسمحوا بالوصول المجاني إلى الطعام والماء. تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد الوخز بالإبر والكي ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية الصينية (رقم الموافقة 2023-03-14-04) وتم إجراؤها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (مطبعة الأكاديمية الوطنية ، واشنطن العاصمة ، 1996).
1. في الجسم الحي حقن الرجعية المدارية ليكتين الطماطم الفلورية
2. نضح واستئصال العينين
3. تشريح شبكية العين
4. تلطيخ الفلورسنت المناعي وتطهير أنسجة شبكية العين
5. التصوير والتحليلات
من المناظر الخارجية لشبكية العين بالكامل ، تمت زيادة شفافية الأنسجة لشبكية العين بالكامل باستخدام علاج تطهير الأنسجة مقارنة بتلك الموجودة في شبكية العين دون تطهير الأنسجة (الشكل 1).
بالنسبة للفحص النسيجي على شبكية العين بالكامل ، تم تمييز...
في هذه الدراسة ، قمنا بتفصيل العملية الفنية لتوضيح مورفولوجيا الخلايا المحيطة في الأوعية الدموية الشبكية باستخدام الحقن المداري الرجعي ليكتين الطماطم الفلوري ، وفحص الفلورسنت المناعي باستخدام PDGFR-β ، وإزالة الأنسجة القائمة على المذيبات. تظهر النتائج أن هذه التقنيات م?...
لا تضارب في المصالح.
تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (رقم 7244480) ، وصندوق الابتكار CACMS (رقم . CI2021A03407) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82004492) ، وصناديق البحوث الأساسية لمعاهد أبحاث الرفاه العام المركزية (الأرقام ZZ-YQ2023008 و ZZ14-YQ-032 و ZZ-JQ2023008 و ZZ-YC2023007).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | Protect from light |
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | Protect from light |
C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | SCXK (Jing) 2021-0006 | |
Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
Goat anti-PDGFR-β | Research and Development | AF1042 | 25 µg |
Imaris software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594 | Thermo Fisher Scientific | L32471 | 1 mg |
Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | 10 mL |
Panoramic tissue slice scanner | Olympus | VS120-S6-W | |
Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | |
RapiClear 1.52 Solution | SunJin Lab | RC152001 | 10 mL |
Six-well plate | Costar | 3335 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
Superfrost Plus microscope slide | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | 25 mm x 75 mm x 1 mm |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved